摘要：為了解山西省忻州某奶牛場艾美耳球蟲感染率和蟲種分布，為后期球蟲病治療及牛群飼養(yǎng)管理提供臨床依據(jù)，采用飽和鹽水漂浮法對采自奶牛場200 頭產(chǎn)后母牛和600 只犢牛的800 份新鮮糞便樣品進行球蟲卵囊分離收集，采用麥氏蟲卵計數(shù)法和PCR 方法對球蟲卵囊進行檢查和種類鑒定。結(jié)果表明，奶牛場艾美耳球蟲的總感染率為32.75%，0～3 月齡和5～12 月齡犢牛的球蟲感染率分別為36.33% 和43.00%，產(chǎn)后母牛的球蟲感染率為12.00%，5～12 月齡犢牛的球蟲感染情況較0～3 月齡犢牛嚴重，產(chǎn)后母牛感染情況輕于犢牛；通過序列比對分析共鑒定出4 種牛艾美耳球蟲，分別是邱氏艾美耳球蟲（77.48%）、牛艾美耳球蟲（41.22%）、奧博艾美耳球蟲（31.68%）和橢圓艾美耳球蟲（14.50%），以邱氏艾美耳球蟲為優(yōu)勢蟲種；所調(diào)查的奶牛中有多重感染的情況，鑒定的262 份陽性糞便樣本中有117 份為感染2 種以上球蟲，混合感染率為44.66%，發(fā)現(xiàn)最多可混合感染4 種球蟲。5～12 月齡犢牛的球蟲混合感染情況較0～3 月齡犢牛嚴重，而產(chǎn)后母牛多以1 種球蟲感染。

關(guān)鍵詞：奶牛；艾美耳球蟲；飽和鹽水漂浮法；麥氏蟲卵計數(shù)法；流行病學

中圖分類號：S855.9 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0696?06

牛球蟲病是一種由艾美耳屬幾種球蟲寄生于牛的腸道引起的以急性腸炎、血痢等為特征的寄生蟲病[1]，多發(fā)生于犢牛[2]。目前世界上已報道的牛艾美耳球蟲有27 種[3]，其中，牛艾美耳球蟲（Eimeriabovis）和邱氏艾美耳球蟲（Eimeria zuernii）致病性較強[4]，寄生于牛的腸道導致腸黏膜上皮脫落、黏膜出血并形成潰瘍，臨床上表現(xiàn)為出血性腸炎、腹痛和血便，是造成牛場高發(fā)病率和嚴重經(jīng)濟損失的重要原因。奶牛球蟲病主要危害3 周到12 個月的犢牛[5]，臨床上以腹瀉為主要癥狀，有時會出現(xiàn)貧血、消瘦、生產(chǎn)性能下降、脫水等癥狀，引起犢牛體質(zhì)量減輕，生長發(fā)育受阻，免疫力下降，導致易共患其他疾病[6]，嚴重可導致死亡[5，7]。成年奶牛以亞臨床表現(xiàn)為主，出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，食欲下降[1]，但其是危險的傳染源，排出的糞便中攜帶大量的球蟲卵囊，長期存在于養(yǎng)殖環(huán)境中，會造成球蟲病周期感染[8]。

OLIVARES-MU?OZ 等[9]研究表明，墨西哥維拉克魯斯州中部地區(qū)犢牛球蟲病的總感染率為39.7%，加拿大艾美耳球蟲為優(yōu)勢蟲種；MAKAU 等[10]對肯尼亞西部的牛球蟲流行病學研究發(fā)現(xiàn)，其感染率為32.7%，而犢牛的感染率為48.2%。SANTOS 等[11]調(diào)查伯南布哥南部的格雷斯特地區(qū)發(fā)現(xiàn)，其牛場球蟲感染率為50.65%，共鑒定出11 種艾美耳球蟲。

LOPEZ-OSORIO 等[12]對哥倫比亞7 個州（包括亞熱帶和熱帶地區(qū)）55 個養(yǎng)牛場共1 333 份1 歲以下犢牛的糞便樣本進行球蟲檢查，發(fā)現(xiàn)總感染率為75.5%，共鑒定出13 種球蟲，以牛艾美耳球蟲為優(yōu)勢種，并且存在混合其他球蟲感染的情況。LI 等[13]研究表明，在中國牛艾美耳球蟲感染率呈逐年下降趨勢，從2000 年以前的57.9% 下降到2015 年以后的25.0%，但仍處于較高水平。牛球蟲病是全世界最常見的牛寄生蟲病之一[2]，給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，全球范圍內(nèi)每年因球蟲病造成的損失約為7.23 億元[5]，因此，防治牛球蟲病對減少牛產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失至關(guān)重要。奶牛產(chǎn)業(yè)是山西省一大重點發(fā)展產(chǎn)業(yè)，但山西省至今尚未有奶牛球蟲感染情況的報道。鑒于此，本研究調(diào)查了山西省忻州市某奶牛場母牛和犢牛球蟲感染情況，旨在為防治奶牛球蟲病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 糞樣采集

2021 年5—9 月從山西省某奶牛場采集200 頭產(chǎn)后母牛和600 只犢牛（0～3 月齡和5～12 月齡各300 頭）的新鮮糞便樣品共800 份，分別裝入干凈的塑料自封袋，帶回實驗室檢測。

1.2 檢測方法

利用飽和食鹽水溶液飄浮法檢測奶牛糞便中的球蟲卵囊。將每份糞樣充分攪勻后取10 g 放入50 mL 燒杯中，加入適量水，輕輕攪勻，后經(jīng)0.280、0.154 mm 銅絲網(wǎng)過濾。將濾液移入50 mL 試管，2 500 r/min 離心10 min。棄去上清液，沉淀物中加入少量飽和鹽水，混勻，用一次性吸管將管內(nèi)的沉淀物混懸液移入10 mL 玻璃瓶內(nèi)。飽和鹽水加滿玻璃瓶，蓋上蓋玻片（蓋玻片應與液面接觸），靜置10 min。取下蓋玻片，將有液體的一面蓋在載玻片上。置載玻片于顯微鏡載物臺上，用10×10 或10×40 的倍數(shù)進行檢查。

1.3 卵囊計數(shù)方法

對于牛球蟲陽性糞便樣本，采用麥克馬斯特氏法檢測每克糞便中蟲卵數(shù)（OPG）。取2 g 糞便放入裝有玻璃珠的燒杯中，加入58 mL 飽和食鹽水。經(jīng)充分攪拌均勻后，再用糞篩過濾至新的燒杯中，再次混勻，用滴管將樣本液體加到麥克馬斯特計數(shù)板內(nèi)，靜置5 min，待球蟲全部沉降到計數(shù)室底部后，在低倍鏡下記10×10 方格內(nèi)的卵囊總數(shù)，記3 次，取平均值乘以200，即為每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG 值）[14-16]。

1.4 卵囊的收集與培養(yǎng)

將鏡檢球蟲卵囊呈陽性的牛糞樣品取10 g，放入潔凈的100 mL 燒杯中并加入適量的涼白開，用玻璃棒充分攪拌均勻后，加自來水經(jīng)0.280、0.154 mm 不銹鋼篩子依次過濾至潔凈的250 mL離心杯內(nèi)，混懸液以2 500 r/min 離心10 min，棄上清，反復3 次，保留沉淀。再將沉淀用適量的飽和食鹽水充分攪拌均勻，以3 000 r/min 離心5 min，取上清液置于潔凈50 mL 離心管中，加入合適的涼白開并混勻后，3 500 r/min 離心10 min。棄上清，用2.5% 重鉻酸鉀溶液沖洗含球蟲卵囊的沉淀，置于4 ℃保存，備用[16-17]。

1.5 卵囊形態(tài)觀察與蟲種鑒定

取孢子化前后的卵囊液制片，置于100× 和400×光學顯微鏡下觀察并記錄孢子化前后球蟲卵囊的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)卵囊、孢子囊和子孢子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、顏色、大小及有無內(nèi)外殘體等情況對奶牛球蟲進行鑒定。

1.6 卵囊基因組DNA 提取

將收集保存在2.5% 重鉻酸鉀溶液中的牛球蟲卵囊，混勻制成球蟲卵囊懸浮液，并立即抽取5 mL的懸液，置于10 mL 離心管中，加入4.5 mL ddH2O，2 500 r/min，離心10 min 去除重鉻酸鉀，進行3 次重復，最后保留沉淀，加入1 mL ddH2O 振蕩混勻，移至1.5 mL 的離心管中，將沉淀中加入100 μL 含5%膽汁和5% 胰蛋白酶的裂解液，加入0.15 g 500 μm玻璃珠，200 r/min，37 ℃漩渦振蕩混勻45 min。至鏡檢視野中95% 以上的卵囊壁破裂為止。用基因組DNA 提取試劑盒提取孢子化卵囊DNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR 擴增及凝膠電泳

選擇GenBank 中具有牛球蟲種內(nèi)保守種間特異的牛艾美耳球蟲ITS-1基因（序列號：AB557613.1）、邱氏艾美耳球蟲ITS-1 基因（序列號：AB769655.1）、橢圓艾美耳球蟲ITS-1 基因（序列號：AB557619.1）、奧博艾美耳球蟲ITS-1 基因（序列號：AB557610.1）和5.8S rRNA 基因（AB769720.1）作為特征靶基因。

參考張學勇等[18]和LEE 等[19]中牛致病球蟲引物，應用Primer 3 在線軟件設計4 種球蟲的特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并使用NCBI 引物BLAST 功能驗證4 對引物的特異性。

引物核苷酸序列及目的片段長度如表1 所示。

PCR 擴增反應體系50 μL： PCR SuperMix25.0 μL，上下游引物（濃度10.0 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 3.0 μL，補充水18.0 mL；反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性10 s、60.4 ℃退火15 s，68 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

擴增后PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增結(jié)果。

1.8 PCR 產(chǎn)物測序

PCR 產(chǎn)物送北京華大測序，測序結(jié)果采用NCBI 中核酸BLAST（https：//blast. ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi）功能對各蟲種PCR 產(chǎn)物與目標序列進行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西省某奶牛場球蟲感染率與OPG 值分析

某奶牛場球蟲感染率與OPG 值如表2 所示。

由表2 可知，800 份糞便樣本中262 份發(fā)現(xiàn)有球蟲卵囊，總感染率為32.75%。0～3 月和5～12 月齡犢牛的球蟲感染率分別為36.33% 和43.00%，平均OPG 值分別為615 和10 818，5～12 月齡犢牛的球蟲感染情況較0～3 月齡犢牛的球蟲感染嚴重。產(chǎn)后母牛的球蟲感染率為12.00%，平均OPG 值為5 158，產(chǎn)后母牛感染情況輕于犢牛。

2.2 山西省某奶牛場球蟲分類及各種球蟲感染率分析

對山西地區(qū)262 份牛球蟲陽性糞便樣本進行初步鑒定。經(jīng)形態(tài)學鑒定發(fā)現(xiàn)4 種艾美爾球蟲（圖1），分別為邱氏艾美耳球蟲（E. zuernii）77.48%；牛艾美耳球蟲（E. bovis）41.22%；奧博艾美耳球蟲（E. auburnensis）31.68%；橢圓艾美耳球蟲（E.ellipsoidalli）14.50%。不同年齡的牛感染艾美爾球蟲種類統(tǒng)計結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知，上述4 種艾美爾球蟲在產(chǎn)后母牛的陽性占比分別為87.50%、33.33%、20.83% 和8.33%，在0～3 月齡犢牛的陽性占比分別為75.23%、23.85%、15.60% 和8.26%，在5～12 月齡犢牛的陽性占比分別為77.52%、57.36%、47.29%和20.93%，其中各年齡段牛均以邱氏艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲感染為主。

2.3 球蟲混合感染情況分析

不同年齡段牛艾美爾球蟲混合感染情況如表4所示，鑒定的262 份陽性糞便樣本中有117 份為感染2 種以上球蟲的，混合感染率為44.66%，發(fā)現(xiàn)最多可混合感染4 種球蟲，多數(shù)為1 種，同時感染2、3、4 種球蟲的牛所占球蟲陽性牛的比例分別為30.15%、8.40% 和6.11%；0～3 月齡犢牛陽性糞便樣本中有18 份為感染2 種及以上球蟲的，混合感染率為16.51%，多數(shù)感染1 種，感染率為83.49%，感染3 種陽性占比為5.50%；5～12 月齡犢牛陽性糞便樣本中有88 份為感染2 種及以上球蟲的，混合感染率為68.22%，多數(shù)感染2 種，感染率為44.19%，感染3、4 種球蟲陽性占比分別為11.63% 和12.40%；產(chǎn)后母牛陽性糞便樣本中有11 份為感染2 種及以上球蟲的，混合感染率為45.83%，多數(shù)感染1 種，感染率為54.17%，感染3 種陽性占比為4.17%；牛艾美耳球蟲部分陽性樣品電泳結(jié)果如圖2 所示，鑒定的5 份陽性糞便樣本中有2 份為感染3 種球蟲的，3 份為感染2 種球蟲的。

5～12 月齡犢牛的球蟲混合感染情況較0～3 月齡犢牛嚴重，而產(chǎn)后母牛多以1 種球蟲感染，并沒有5～12 月齡的混合感染種類多。

2.4 牛球蟲卵囊PCR 產(chǎn)物測序鑒定

對陽性樣品的牛球蟲孢子化卵囊的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)華大基因股份有限公司測序，并進行NCBI 的BLAST 初步鑒定。結(jié)果顯示，檢測的奶牛場存在4 種艾美耳屬球蟲，即牛艾美爾球蟲（E. bovis）、邱氏艾美爾球蟲（E. zuernii）、橢圓艾美爾球蟲（E.ellipsoidalli）、奧博艾美爾球蟲（E. auburnensis）。牛艾美耳球蟲測序結(jié)果與AB557613.1相似性為99.54%；邱氏艾美耳球蟲測序結(jié)果與AB769655.1 相似性為99.69%；橢圓艾美耳球蟲測序結(jié)果與AB557619.1相似性為100.00%；奧博艾美耳球蟲測序結(jié)果與AB557610.1 相似性為99.52%。

3 結(jié)論與討論

艾美耳球蟲是一種常見的胃腸道寄生蟲[20]，犢牛感染出現(xiàn)嚴重腹瀉、血樣糞便、脫水嚴重，最終導致體質(zhì)量增加減少、飼料轉(zhuǎn)化率降低及對其他疾病易感度提高，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[21]；成年牛通常感染率和感染強度較低，但會成為危險的傳染源[22]，排出的糞便中攜帶大量的球蟲卵囊，污染周圍環(huán)境[23]。球蟲病有明顯的季節(jié)性，多發(fā)于夏秋季，此時溫暖潮濕的外界環(huán)境有利于卵囊的生長發(fā)育。

倪曉婷等[24]對寧夏3 個規(guī)?；膛龅那蛳x感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏各奶牛場大于12 月齡奶牛的感染率最高，其次是7～12 月齡奶牛和1～3 月齡奶牛；4～6 月齡奶牛感染率最低。張寬寬等[25]對庫車縣2 個規(guī)?；龉?8 份新鮮糞便樣品進行球蟲檢查和種類鑒定，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2 個牛場牛球蟲總感染率40.82%，小于6 月齡牛球蟲感染率最高，為78.57%。李豪等[26]對我國黑龍江、吉林省、遼寧、北京、天津、河北、寧夏、廣東等8 個省市（自治區(qū)）的43 個奶牛場球蟲感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，奶牛場球蟲的感染率為90.7%。倪曉婷等[27]對甘肅省榆中縣6 個規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場1 歲以內(nèi)荷斯坦奶牛犢牛球蟲感染情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛場平均感染率為46.15%，1～3 月齡奶牛感染率最高，為52.43%，其次是7～12 月齡奶牛，為43.37%，4～6 月齡奶牛感染率最低，為37.50%。本研究表明，該奶牛場總感染率為32.75%；產(chǎn)后母牛的球蟲感染率為12.00%，平均OPG 值為5 158；0～3 月和5～12 月齡犢牛的球蟲感染率分別為36.33% 和43.00%，平均OPG 值分別為615 和10 818。本次調(diào)查與上述文獻報道存在差異，可能與采樣數(shù)量、采樣季節(jié)和飼養(yǎng)管理等因素有關(guān)。忻州地區(qū)位于山西省北中部、黃土高原東端，屬溫帶大陸性季風氣候，四季分明。本次調(diào)查于5—9 月進行采樣，夏季溫暖多雨，牛舍內(nèi)環(huán)境較潮濕，利于球蟲卵囊發(fā)育，牛易感染球蟲病。該牛場犢牛球蟲感染率最高，符合牛球蟲病的發(fā)病特點，這與該場犢牛的飼養(yǎng)管理、牛舍的環(huán)境衛(wèi)生以及自身抵抗力有關(guān)。因此，保持牛舍清潔干燥，重視飼料營養(yǎng)均衡，提高奶牛的抗病力，對控制和預防牛球蟲病具有重大意義。

世界上報道的牛球蟲有27 種牛球蟲，其中，25 種艾美耳球蟲（Eimeria）、2 種等孢球蟲（Isospora）。

印度是報道球蟲種類最多的國家（20 種），其次為我國，目前我國報道的牛球蟲種類有19 種[3]。倪曉婷等[24]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)奶牛感染的球蟲以柱狀艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲為優(yōu)勢種；張寬寬等[25]研究表明，新疆庫車縣牛球蟲的優(yōu)勢蟲種為橢圓艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、柱狀艾美爾球蟲和邱氏艾美耳球蟲。李復煌等[15]研究表明，北京地區(qū)牛球蟲的優(yōu)勢種為牛艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲與橢圓艾美耳球蟲。金蘭梅等[28]研究表明，江蘇省牛球蟲的優(yōu)勢種為牛艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲。本研究中，山西省某奶牛場奶牛感染艾美耳球蟲4 種，即邱氏艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲。各年齡段牛均主要感染邱氏艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲，感染率最高的是邱氏艾美耳球蟲。據(jù)報道，球蟲感染常出現(xiàn)混合感染[9]。國外LOPEZ-OSORIO 等[12]，CHANDRA等[29]和我國倪曉婷等[24]、李復煌等[15]均報道了奶?；旌细腥厩蛳x的情況。本次調(diào)查也發(fā)現(xiàn)混合感染，混合感染率為44.66%，最多可混合感染4 種球蟲，多數(shù)為1 種，同時感染2、3、4 種球蟲的牛所占球蟲陽性牛的比例分別為30.15%、8.40% 和6.11%。

綜上，山西省忻州市某奶牛場存在球蟲感染現(xiàn)象。不同年齡段的奶牛中，5～12 月齡犢牛的球蟲感染最嚴重。在陽性樣品中鑒定出4 種牛球蟲，邱氏艾美耳球蟲為優(yōu)勢種；奶牛中有多重感染的情況，最多包括4 重感染。各奶牛養(yǎng)殖場在犢牛飼喂管理中，要針對性地加強預防，規(guī)范操作流程，減少因感染球蟲而造成的奶牛生產(chǎn)性能下降等問題，提高奶牛養(yǎng)殖效益。