摘要：茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而長期宿根連作鐵觀音茶園存在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、病害加重等連作障礙問題，探究鐵觀音茶樹連作障礙形成的分子機(jī)制對尋求有效的防控技術(shù)具有重要意義。采用微生物分離純化、平板對峙等方法對鐵觀音茶樹根際病原菌及其拮抗菌進(jìn)行分離、鑒定，并對不同宿根連作年限（0、1、10、20 a）鐵觀音茶樹根際土壤中的病原菌和拮抗菌數(shù)量進(jìn)行定量分析；同時運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析不同連作年限根際土壤中酚酸含量變化，并模擬土壤中各酚酸配比，研究酚酸類物質(zhì)對茶樹根際病原菌及其拮抗菌的影響。結(jié)果顯示，從連作20 a 患病鐵觀音茶樹根系分離鑒定到1 株病原真菌鏈格孢菌（Alternaria sp.），并從根際土壤中篩選到1 株拮抗菌假單胞菌（Pseudomonas sp.）。熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，與1 a 茶園相比，20 a 茶園土壤中的鏈格孢菌絕對含量顯著偏高，而假單胞菌含量卻顯著偏低。連作茶園根際土壤中共檢測到對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、阿魏酸5 種酚酸類物質(zhì)，其平均配比為38∶229∶11∶11∶3。連作條件下酚酸類物質(zhì)并未在土壤中累積，而是隨種植年限的延長呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。模擬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中低濃度（30～120 μmol·L-1）的混合酚酸能夠顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長，單一酚酸對羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸在低濃度（30 μmol·L-1 和60 μmol·L-1）時也能夠顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長。對羥基苯甲酸對假單胞菌的生長有抑制作用，并且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，混合酚酸以及其他單一酚酸對假單胞菌的生長無明顯作用。由此可見，鐵觀音根系分泌物酚酸類物質(zhì)對根際土壤關(guān)鍵微生物菌群具有不同的生態(tài)效應(yīng)，是引起微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、病害增加等連作障礙問題的重要因素。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示鐵觀音茶樹連作障礙機(jī)理提供一些理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶樹；連作障礙；酚酸類物質(zhì)；鏈格孢菌；假單胞菌

中圖分類號：S571.1；S435.711 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-823-12

我國是全球最大的茶葉生產(chǎn)與消費(fèi)國。長期困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的連作障礙問題，在茶樹栽培中表現(xiàn)也很嚴(yán)重。據(jù)報道，貴州省的鳥王茶在連作10 a 后茶葉產(chǎn)量開始下降，連作11～15 a的產(chǎn)量比連作6～10 a 的降低了69.1%[1]。福建省安溪縣連作20 a 的鐵觀音茶樹其光合特性、茶葉產(chǎn)量以及品質(zhì)都顯著低于連作10 a 的[2]。為追求經(jīng)濟(jì)利益，大部分茶農(nóng)通過增施氮肥、噴施農(nóng)藥等措施維持茶葉產(chǎn)量，再結(jié)合茶樹本身喜酸富鋁的生物學(xué)特性，宿根連作多年后的茶園土壤普遍出現(xiàn)酸化嚴(yán)重、養(yǎng)分非均衡性退化、微生物多樣性減少以及種群結(jié)構(gòu)惡化等生態(tài)環(huán)境問題[3-4]，使茶葉生產(chǎn)陷入惡性循環(huán)。因此，探究茶樹連作障礙形成機(jī)制及其防控措施，對促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，大多數(shù)研究表明，根際土壤微生物區(qū)系惡化以及微生物群落失衡是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要原因。據(jù)報道，花生[5]、黃瓜[6]、茄子[7]、草莓[8]等作物連作后，根際微生物區(qū)系逐漸由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，根際病原真菌增加，致使作物發(fā)生嚴(yán)重病害。鐵觀音茶樹長期單一種植，也會引起根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如微生物量減少、群落多樣性降低、代謝能力降低，根際土壤環(huán)境質(zhì)量變差[9]。此外，隨著連作年限增加，鐵觀音茶樹根際土壤中對植物生長有益的細(xì)菌屬[如假單胞菌（ Pseudomonas spp. ）、產(chǎn)黃桿菌（ Rhodanobacter spp. ）、慢生根瘤菌（ Bradyrhizobium spp. ）、分枝桿菌（ Mycobacterium spp. ）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas spp.）]急劇減少，某些病原菌數(shù)量（如鏈格孢菌，Alternaria spp.）卻不斷增加[4，10]。隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，植物根系分泌物的間接生態(tài)效應(yīng)及其引起的土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致連作障礙的主要因素[11-12]。據(jù)報道，黃瓜植株根系分泌物的化感自毒物質(zhì)肉桂酸能抑制根系生長，增加黃瓜枯萎?。‵usarium oxysporum）的發(fā)病率[13]；西瓜根系分泌物中的精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸可誘導(dǎo)多黏類芽孢桿菌SQR-21 對西瓜根系的趨化性并促進(jìn)其在西瓜根際的有效定殖[14]。可見，根系分泌物在植物-土壤-微生物之間的根際對話中起重要作用，可以通過直接或間接方式對土壤微生物發(fā)揮調(diào)控作用。

酚酸類物質(zhì)是常被報道的重要化感物質(zhì)，在作物連作障礙形成過程中起重要作用[15]。連作7 a 黃瓜土壤中香草酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸總含量顯著高于正茬和重茬3 a 土壤中的含量，外源添加酚酸類物質(zhì)至盆栽基質(zhì)中，可使黃瓜幼苗根長及莖粗顯著降低，使株高及干物質(zhì)量略有下降[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜化感自毒物質(zhì)香豆酸能顯著促進(jìn)土壤中病原菌尖孢鐮刀菌的生長繁殖[17]。草莓苗期枯萎病的發(fā)生與阿魏酸密切相關(guān)，相對高濃度（50～100 mg·L-1）的阿魏酸能誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌的增殖進(jìn)而引發(fā)病害[18]。可見，酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要原因。然而，目前對連作條件下茶樹根系分泌物酚酸類物質(zhì)的含量變化及其對根際關(guān)鍵微生物的調(diào)控作用尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

課題組前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，假單胞菌（有益菌）和鏈格孢菌（病原菌）是鐵觀音茶樹根際的優(yōu)勢菌，并且隨著連作年限的增加，假單胞菌豐度急劇減少，而鏈格孢菌豐度卻有增加的趨勢[4，10]。因此，本研究首先分離、篩選與鐵觀音茶樹連作障礙密切相關(guān)的關(guān)鍵病原菌及其拮抗菌，并對其進(jìn)行定量分析。同時，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析不同連作年限根際土壤中酚酸含量變化，并模擬根際土壤中各酚酸配比，研究酚酸類物質(zhì)對茶樹根際病原菌及其拮抗菌的影響。以期為深入揭示鐵觀音茶樹連作障礙形成的分子生態(tài)學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤取樣

在福建省安溪縣感德鎮(zhèn)鐵觀音茶園定點(diǎn)觀測試驗(yàn)站（25°18′ N，117°51′ E）內(nèi)，選取海拔高度、坡向、坡位以及管理水平基本一致的1、10、20 a 茶園各3 個，小區(qū)面積不小于15 m×15 m，鄰近未種植過茶樹的荒地土壤作為對照（0 a）。于2020 年5 月3 日采用5 點(diǎn)取樣法對根際土壤進(jìn)行取樣，用于微生物實(shí)時熒光定量（qPCR）分析和酚酸提取與測定。

1.2 病原微生物的分離與鑒定

采用組織分離法篩選病原微生物。將患根腐病的鐵觀音茶樹根系先用自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺中用無菌水清洗。將病原菌侵染的根部切成薄片，用75%的乙醇浸泡30～40 s，然后用無菌水沖洗3 次，接種在MS 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，分離單菌落。采用CTAB 法對真菌基因組DNA 進(jìn)行提取，PCR 擴(kuò)增采用通用引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTG CG G-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'）。

PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol·L-1 Mg2+），1.0 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），1.0 μL dNTP（10 mmol·L-1），1.5 μL ITS1 引物（10 μmol·L-1），1.5 μL ITS4引物（10 μmol·L-1），1 μL 基因組DNA 和39 μLddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶樣品送至上海派森諾基因科技有限公司純化并測序。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 進(jìn)行序列比對，將獲得的準(zhǔn)確序列遞交至GenBank獲得登錄號，使用MEGA 7.0 軟件（Neighborjoining，NJ 鄰位相連法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，抽樣次數(shù)為1 000。

1.3 拮抗菌的篩選與鑒定

將活化的病原真菌接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基平板中心位置，在距離中心2.5 cm 處的4 個方向分別接種一株活化培養(yǎng)的細(xì)菌（前期從連作鐵觀音根際土壤中篩選到的微生物），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，觀察抑菌圈的形成，分離篩選對病原真菌有拮抗效應(yīng)的細(xì)菌。

對分離篩選到的拮抗菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16 S rDNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol·L-1 Mg2+），1.0 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），1.0 μL dNTP（10 mmol·L-1），1.5 μL 27F 引物（10 μmol·L-1），1.5 μL 1492R引物（10 μmol·L-1），1 μL 基因組DNA 和39 μLddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將電泳檢測的目的條帶進(jìn)行膠回收并送至上海派森諾基因科技有限公司測序。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 微生物致病性的驗(yàn)證

基于前期已建立的鐵觀音無菌組培苗體系，向鐵觀音組培苗中添加已活化的病原菌和拮抗菌，對照組加入等量的液體培養(yǎng)基代替，將組培苗置于光照培養(yǎng)箱觀察其生長情況。

1.5 土壤關(guān)鍵菌群qPCR 分析

土壤總DNA 采用BioFast 土壤基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）進(jìn)行提取。鏈格孢菌qPCR 定量正向引物序列為5'-GCCCACCACTAGGACAAACA-3'，反向引物序列為5'-TCCCTACCTGATCCGAGGTC-3'。假單胞菌qPCR 定量引物序列為Ps-for（5'-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3'）和Ps-rev（5'-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3'）。反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×SYBR GreenI SuperReal Premix，上下游引物各0.5 μL，10 ngDNA 模板，ddH2O 補(bǔ)足到20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

將特異引物擴(kuò)增的目的片段與pMD-19T載體連接，經(jīng)感受態(tài)轉(zhuǎn)化、陽性克隆挑選、質(zhì)粒提取獲得含有目的片段的質(zhì)粒，用于制備各關(guān)鍵菌群qPCR定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在對不同連作年限鐵觀音根際土壤中各關(guān)鍵菌群的含量進(jìn)行分析時，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行計(jì)算。

1.6 土壤酚酸提取及HPLC 分析

稱取5 g 鐵觀音茶樹根際土壤，加入20 mL1 mol·L-1 NaOH 溶液，放置于搖床上（25 ℃，180 r?min- 1） 振蕩12 h，再漩渦振蕩30 min，離心棄沉淀，上清液用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2.5，再次離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取5 次，收集有機(jī)相（上層），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液蒸干（溫度35 ℃），用5 mL 色譜級甲醇復(fù)溶，–80 ℃避光保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜贖PLC 分析。

運(yùn)用HPLC 技術(shù)對酚酸含量進(jìn)行定量分析，待檢測的酚酸包括沒食子酸、香豆酸、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸。色譜條件如下：C18 色譜柱（Inertsil ODS-SP，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為甲醇，流動相B 為2%冰醋酸溶液，洗脫梯度為72%流動相B 等梯度洗脫，柱箱溫度為30 ℃，流速為0.7 mL?min-1，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.7 酚酸類物質(zhì)對鏈格孢菌生長影響的試驗(yàn)

基于鐵觀音根系分泌物酚酸類物質(zhì)含量的測定結(jié)果，依據(jù)各酚酸在根際土壤中的平均配比（對羥基苯甲酸∶香草酸∶丁香酸∶香蘭素∶阿魏酸=38∶229∶11∶11∶3）制備一系列單一酚酸和混合酚酸濃度梯度為0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1 的酚酸-PDA 平板。制備方法如下：將稀釋8 倍的PDA 培養(yǎng)基（1/8 PDA）滅菌后冷卻至40～50 ℃，然后加入適量經(jīng)0.22 μm超濾膜除菌過濾的各酚酸儲備液（甲醇溶解后加水定容），立即倒平板，冷卻凝固后獲得不同酚酸濃度梯度的酚酸-PDA 平板。將已活化培養(yǎng)的鏈格孢菌菌餅接種于酚酸-PDA 平板中心位置，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d 后，測量菌絲直徑。對照組以添加雙蒸水代替，同時加入與試驗(yàn)組等量的甲醇以排除甲醇對鏈格孢菌生長的影響。每個處理3次重復(fù)。

1.8 酚酸類物質(zhì)對假單胞菌生長影響的試驗(yàn)

制備一系列單一酚酸和混合酚酸濃度梯度為0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1的1/8 LB 培養(yǎng)基。制備方法如下：配制1/8濃度LB 培養(yǎng)基，每支試管分裝39.5 mL，121 ℃ 高溫高壓滅菌20 min 后冷卻至40～50 ℃，然后分別向試管中加入0.5 mL 經(jīng)0.22 μm 超濾膜除菌過濾的單一酚酸或混合酚酸儲備液。每支試管接種10 μL 已活化的假單胞菌菌液，置于37 ℃，180 r·min-1 搖床中培養(yǎng)8 h，取200 μL 菌液于96 孔酶標(biāo)板中，測定OD600 的吸光值。對照組以添加雙蒸水代替，同時加入與試驗(yàn)組等量的甲醇以排除甲醇對假單胞菌生長的影響。每個處理3 次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 和Matlab 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan 法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌和拮抗菌的分子鑒定及致病性驗(yàn)證

病原真菌F26 測序獲得的DNA 片段長度為532 bp，提交至GenBank 中的NCBI 登錄號為OR462358。通過BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 中Alternaria alternata 的序列相似度高達(dá)100%，結(jié)合基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），確定該菌屬于鏈格孢菌屬。

采用平板對峙方法分離篩選對病原菌有拮抗效應(yīng)的細(xì)菌，其中T4 菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗性（圖2）。該菌株經(jīng)測序獲得的DNA 片段長度為1 410 bp，提交至GenBank 中的NCBI登錄號為OR462360。通過BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 中Pseudomonas koreensi的序列相似度高達(dá)99.43%，結(jié)合基于16 SrRNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），確定該菌屬于假單胞菌屬。

將分離到的病原菌和拮抗菌與鐵觀音茶樹組培苗進(jìn)行共培養(yǎng)，病原菌Alternaria sp.（F26）對鐵觀音組培苗有較強(qiáng)的致病性（圖4A），拮抗菌Pseudomonas sp.（T4）對鐵觀音組培苗無致病性（圖4B）。

2.2 不同連作年限根際土壤關(guān)鍵菌群含量變化

對不同連作年限茶樹根際土壤中的關(guān)鍵菌群鏈格孢菌和假單胞菌進(jìn)行qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，與1 a 茶園相比，10 a 和20 a 茶園中鏈格孢菌的絕對含量顯著增加；而20 a 茶園中假單胞菌的絕對含量顯著低于1 a 和10 a 茶園（表1）?？梢?，鐵觀音茶樹宿根連作導(dǎo)致根際土壤病原菌數(shù)量增多，有益菌數(shù)量減少，這與前期高通量測序結(jié)果一致[4，10]。

2.3 不同連作年限根際土壤酚酸含量變化

不同宿根連作年限鐵觀音根際土壤中共檢測到5 種酚酸類物質(zhì)，分別為對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素和阿魏酸（圖5）。種植鐵觀音茶樹根際土壤的酚酸含量要高于對照土壤。隨著連作年限的增加，對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸并未在土壤中累積，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。與1 a 和10 a 茶園土壤相比，20 a 茶園土壤中對羥基苯甲酸含量分別顯著降低了53.20%和45.26%，香草酸含量分別顯著降低了9.88%和10.86%。依據(jù)測定結(jié)果，可以得到5 種酚酸類物質(zhì)在鐵觀音根際土壤中的平均配比為對羥基苯甲酸∶香草酸∶丁香酸∶香蘭素∶阿魏酸=38∶229∶11∶11∶3。

2.4 酚酸類物質(zhì)對鏈格孢菌生長的影響

設(shè)定一系列混合酚酸和單一酚酸的濃度梯度（0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1），分析室內(nèi)模擬連作條件下，單一或混合酚酸物質(zhì)對病原菌鏈格孢菌生長的影響。結(jié)果表明，中低濃度的混合酚酸（30～120 μmol·L-1）對鏈格孢菌菌絲生長有顯著的促進(jìn)作用（圖6）。當(dāng)混合酚酸濃度為240 μmol·L-1 時，對鏈格孢菌菌絲生長的促進(jìn)作用不明顯；而濃度高于480 μmol·L-1 時，對其菌絲生長有抑制作用。5種單一酚酸對鏈格孢菌菌絲生長的影響不同，其中：（1）對羥基苯甲酸和丁香酸表現(xiàn)出低促高抑的作用，即在中低濃度（30～120 μmol·L-1）時促進(jìn)鏈格孢菌菌絲生長，在高濃度（480 μmol·L-1和960 μmol·L-1）時抑制菌絲生長；（2）香草酸只有在30 μmol·L-1 時顯著促進(jìn)菌絲生長，在高濃度（480 μmol·L-1 和960 μmol·L-1）時顯著抑制菌絲生長；（3）香蘭素在高濃度（480 μmol·L-1和960 μmol·L-1）時對菌絲生長有明顯的促進(jìn)作用；（4）阿魏酸對鏈格孢菌生長無明顯影響，只有高濃度（960 μmol·L-1）時抑制其生長。

綜上所述，并非所有酚酸都對鏈格孢菌菌絲生長具有促進(jìn)作用。

2.5 酚酸類物質(zhì)對假單胞菌生長的影響

同樣設(shè)定0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1 濃度梯度的單一酚酸和混合酚酸，分析其對有益拮抗菌假單胞菌生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的混合酚酸對假單胞菌的生長無明顯影響（圖7）。同時，不同濃度梯度的單一酚酸對假單胞菌生長的影響不同，其中：（1）對羥基苯甲酸對假單胞菌的生長有抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)；（2）香草酸對假單胞菌的生長具有促進(jìn)作用，特別在120 μmol·L-1 和240 μmol·L-1濃度下促進(jìn)作用顯著；（3）丁香酸、阿魏酸、香蘭素對假單胞菌的生長基本沒有明顯影響。可見，酚酸類物質(zhì)對病原真菌和有益拮抗菌的生長具有不同的生態(tài)效應(yīng)。

3 討論

酚酸類物質(zhì)是一種常見的化感物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著大豆[19]、蘋果[20]、草莓[21]、茄子[22]等作物連作年限的增加，酚酸類物質(zhì)會在土壤中累積，對作物生長有明顯抑制作用，是導(dǎo)致這些農(nóng)作物連作障礙發(fā)生的重要原因。但進(jìn)一步量化測定后發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)在田間條件下很難達(dá)到抑制作物生長發(fā)育所需的濃度[12]。

因此，之前的研究方法和思路過分強(qiáng)調(diào)根系分泌物的直接生理作用，并且受試濃度往往過高（與田間自然狀況下的實(shí)際濃度不符），同時也未考慮到土壤的吸附過程以及土壤微生物分解利用等過程[23]。事實(shí)上，作物根系分泌的酚酸類物質(zhì)釋放到土壤后可能被微生物分解、轉(zhuǎn)化和加工[24]。Lin 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，將水稻的主要化感化學(xué)物質(zhì)（對羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、肉桂酸）添加到土壤中3～7 d 后，這些酚酸減少了50%～90%，這可能與土壤微生物的分解和利用有關(guān)。有研究表明，土壤中酚酸累積及其對作物生長的抑制作用并不是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的直接原因，很可能是由于酚酸介導(dǎo)下作物和特定微生物之間的相互作用造成的[26]。本研究中，隨著連作年限的增加，茶園根際土壤中的對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素含量并未在土壤中持續(xù)累積，而且對羥基苯甲酸和香草酸在連作20 a 茶園土壤中的含量顯著低于1 a 和10 a茶園土壤，這可能是由于不同連作年限下鐵觀音茶樹根系分泌強(qiáng)度不同以及土壤微生物分解代謝綜合作用的結(jié)果。Zhou 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，連作7 a 的黃瓜生物量最低、連作障礙問題最為嚴(yán)重，然而7 a 后作物生物量又逐漸增加，連作障礙有所緩解；此外，土壤總酚、阿魏酸、對羥基苯甲酸和香豆酸等酚酸類物質(zhì)含量也都呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，說明黃瓜連作障礙問題并不是由于連作土壤中高濃度酚酸類物質(zhì)直接作用導(dǎo)致的，可能是酚酸類物質(zhì)通過改變微生物區(qū)系來間接影響植物的生長發(fā)育。

鏈格孢菌是一種普遍存在于環(huán)境中的病原體和腐生菌，在三七根腐病、草坪根腐病中都有分離鑒定到[27-28]。本研究從20 a 茶齡的患病鐵觀音根系分離鑒定到1 株鏈格孢菌，并驗(yàn)證了該菌對鐵觀音茶樹的致病性；同時發(fā)現(xiàn)，較低濃度的對羥基苯甲酸（60 μmol·L-1）、香草酸和丁香酸（30 μmol·L-1）能顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長，中低濃度（30～120 μmol·L-1）的混合酚酸也能顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長，說明土壤中酚酸類物質(zhì)有促進(jìn)病原菌鏈格孢菌增殖的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與作物個體相比，病原菌對酚酸類物質(zhì)及其濃度更加敏感，土壤中酚酸類物質(zhì)還未達(dá)到對作物致害的濃度時，微生物群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)開始發(fā)生變化[29]。在黃瓜[17]、草莓[18]、西瓜[30]和甜瓜[31]等作物的研究中也發(fā)現(xiàn)，根系分泌物酚酸類物質(zhì)可以顯著促進(jìn)病原菌的生長，導(dǎo)致土壤傳播疾病的增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，對羥基苯甲酸對拮抗菌假單胞菌的生長有抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，對羥基苯甲酸對病原真菌和有益拮抗菌的生長表現(xiàn)出不同的作用。Wu 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，太子參根系分泌的8 種酚酸類物質(zhì)能促進(jìn)病原菌大量生長，抑制有益菌的生長繁殖，從而導(dǎo)致土壤特殊菌群失衡，與本研究結(jié)果相似。

本研究對根際關(guān)鍵微生物菌群進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，根際土壤病原菌數(shù)量增多，有益菌數(shù)量減少，這可能與鐵觀音茶樹根系分泌物酚酸類物質(zhì)可以選擇性地促進(jìn)或抑制病原菌和有益菌的生長有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為調(diào)節(jié)根部微生物群落以提高鐵觀音茶葉產(chǎn)量和可持續(xù)生產(chǎn)提供了新的思路。今后可以通過施用微生物肥料和有機(jī)改良劑來保持茶園根際土壤中微生物群落的平衡，或通過調(diào)控根系分泌物等方法緩解茶園連作障礙問題。

參考文獻(xiàn)

[1] 羅倩， 張珍明， 向準(zhǔn)， 等. 不同種植年限鳥王茶產(chǎn)地土壤物理性質(zhì)及生長特征[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 30（12）：2746-2750.

Luo Q， Zhang Z M， Xiang Z， et al. Soil physical propertiesof Niaowang tea growing area with different cultivationyears and growth characteristics of Niaowang tea [J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2017，30（12）： 2746-2750.

[2] 李艷春. 不同宿根年限鐵觀音茶園酸化土壤微生物群落特征及改良措施研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2017.

Li Y C. Microbial community characteristics of acidifiedTieguanyin tea soils with different ratooning ages andimprovement measures [D]. Fuzhou： Fujian Agriculture andForestry University， 2017.

[3] Han W Y， Kemmitt S J， Brookes P C. Soil microbial biomassand activity in Chinese tea gardens of varying stand age andproductivity [J]. Soil Biology Biochemistry， 2007， 39（7）：1468-1478.

[4] Li Y C， Li Z W， Arafat Y， et al. Studies on fungal communities and functional guilds shift in tea continuouscropping soils by high-throughput sequencing [J]. Annals ofMicrobiology， 2020， 70（1）： 2762-2770.

[5] 孫秀山， 封海勝， 萬書波， 等. 連作花生田主要微生物類群與土壤酶活性變化及其交互作用[J]. 作物學(xué)報， 2001，27（5）： 617-621.

Sun X S， Feng H S， Wang S B， et al. Changes of mainmicrobial strains and enzymes activities in peanutcontinuous cropping soil and their interactions [J]. ActaAgronomica Sinica， 2001， 27（5）： 617-621.

[6] 胡元森， 劉亞峰， 吳坤， 等. 黃瓜連作土壤微生物區(qū)系變化研究[J]. 土壤通報， 2006， 37（1）： 126-129.

Hu Y S， Liu Y F， Wu K， et al. Variation of microbialcommunity structure in relation to successive cucumbercropping soil [J]. Chinese Journal of Soil Science， 2006，37（1）： 126-129.

[7] 周寶利， 徐妍， 尹玉玲， 等. 不同連作年限土壤對茄子土壤生物學(xué)活性的影響及其嫁接調(diào)節(jié)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2010， 29（2）： 290-294.

Zhou B L， Xu Y， Yin Y L， et al. Effects of different yearscontinuous cropping and grafting on the biological activitiesof eggplant soil [J]. Chinese Journal of Ecology， 2010，29（2）： 290-294.

[8] Li A Y， Wei Y， Sun Z J， et al. Analysis of bacterial and fungalcommunity structure in replant strawberry rhizosphere soilwith denaturing gradient gel electrophoresis [J]. AfricanJournal of Biotechnology， 2012， 11（49）： 10962-10969.

[9] 林生， 莊家強(qiáng)， 陳婷， 等. 不同年限茶樹根際土壤微生物群落PLFA 生物標(biāo)記多樣性分析[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2013，32（1）： 64-71.

Lin S， Zhuang J Q， Chen T， et al. Microbial diversity inrhizosphere soils of different planting year tea trees： ananalysis with phospholipid fatty acid biomarkers [J].Chinese Journal of Ecology， 2013， 32（1）： 64-71.

[10] Li Y C， Li Z， Li Z W， et al. Variations of rhizospherebacterial communities in tea （Camellia sinensis L.）continuous cropping soil by high-throughputpyrosequencing approach [J]. Journal of AppliedMicrobiology， 2016， 121（3）： 787-799.

[11] 林文雄， 陳婷， 周明明. 農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)的新視野[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 20（3）： 253-264.

Lin W X， Chen T， Zhou M M. New dimensions inagroecology [J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2012，20（3）： 253-264.

[12] Li X G， Ding C F， Hua K， et al. Soil sickness of peanuts isattributable to modifications in soil microbes induced bypeanut root exudates rather than to direct allelopathy [J].Soil Biology amp; Biochemistry， 2014， 78： 149-159.

[13] Ye S F， Zhou Y H， Sun Y， et al. Cinnamic acid causesoxidative stress in cucumber roots， and promotes incidenceof Fusarium wilt [J]. Environmental and ExperimentalBotany， 2006， 56（3）： 255-262.

[14] 沈怡斐， 鄂垚瑤， 陽芳， 等. 西瓜根系分泌物中氨基酸組分對多黏類芽孢桿菌SQR-21 趨化性及根際定殖的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2017， 40（1）： 101-108.

Shen Y F， E Y Y， Yang F， et al. Effects of amino acids in rootexudates of watermelon on the chemotactic reaction and rootcolonization of Paenibacillus polymyxa SQR-21 [J]. Journalof Nanjing Agricultural University， 2017， 40（1）： 101-108.

[15] 張淑香， 高子勤. 連作障礙與根際微生態(tài)研究Ⅱ. 根系分泌物與酚酸物質(zhì)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2000， 11（1）： 152-156.

Zhang S X， Gao Z Q. Continuous cropping obstacle andrhizospheric microecology Ⅱ. Root exudates and phenolicacids [J]. Chinese Journal of Applied Ecology， 2000， 11（1）：152-156.

[16] 胡元森， 吳坤， 李翠香， 等. 酚酸物質(zhì)對黃瓜幼苗及枯萎病菌茵絲生長的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2007， 26（11）：1738-1742.

Hu Y S， Wu K， Li C X， et al. Effects of phenolic compoundson the growth of Cucumis sativus seedlings and Fusariumoxysporum hypha [J]. Chinese Journal of Ecology， 2007，26（11）： 1738-1742.

[17] Zhou X G， Wu F Z. p-Coumaric acid influenced cucumberrhizosphere soil microbial communities and the growth ofFusarium oxysporum f.sp. cucumerinum Owen [J]. Plos One，2012， 7（10）： e48288. doi： 10.1371/journal.pone.0048288.

[18] Tian G L， Bi Y M， Cheng J D， et al. High concentration offerulic acid in rhizosphere soil accounts for the occurrenceof Fusarium wilt during the seedling stages of strawberryplants [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2019， 108： 101435. doi： 10.1016/j.pmpp.2019.101435.

[19] 張淑香， 高子勤， 劉海玲. 連作障礙與根際微生態(tài)研究Ⅲ.土壤酚酸物質(zhì)及其生物學(xué)效應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2000，11（5）： 741-744.

Zhang S X， Gao Z Q， Liu H L. Continuous cropping obstacleand rhizospheric microecology Ⅲ. Soil phenolic acids andtheir biological effect [J]. Chinese Journal of AppliedEcology， 2000， 11（5）： 741-744.

[20] 孫海兵， 毛志泉， 朱樹華. 環(huán)渤海灣地區(qū)連作蘋果園土壤中酚酸類物質(zhì)變化[J]. 生態(tài)學(xué)報， 2011， 31（1）： 90-97.

Sun H B， Mao Z Q， Zhu S H. Changes of phenolic acids inthe soil of replanted apple orchards surrounding Bohai Gulf[J]. Acta Ecologica Sinica， 2011， 31（1）： 90-97.

[21] 李賀勤， 劉奇志， 張林林， 等. 草莓連作土壤酚酸類物質(zhì)積累對土壤線蟲的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2014， 33（1）：169-175.

Li H Q， Liu Q Z， Zhang L L， et al. Accumulation of phenolicacids in the monocultured strawberry soils and their effecton soil nematodes [J]. Chinese Journal of Ecology， 2014，33（1）： 169-175.

[22] Chen S L， Zhou B L， Lin S S， et al. Accumulaion ofcinnamic acid and vanillin in eggplant root exudates and therelationship with continuous cropping obstacle [J]. AfricanJournal of Biotechnology， 2011， 10（14）： 2659-2665.

[23] Kaur H， Kaur R， Kaur S， et al. Taking ecological functionseriously： soil microbial communities can obviateallelopathic effects of released metabolites [J]. Plos One，2009， 4（3）： e4700. doi： 10.1371/journal.pone.0004700.

[24] Eisenhauer N， Scheu S， Jousset A. Bacterial diversitystabilizes community productivity [J]. Plos One， 2012， 7（3）：e34517. doi： 10.1371/journal.pone.0034517.

[25] Lin R Y， Wang H B， Guo X K， et al. Impact of appliedphenolic acids on the microbes， enzymes and availablenutrients in paddy soils [J]. Allelopathy Journal， 2011，28（2）： 225-236.

[26] Zhou X， Yu G， Wu F. Soil phenolics in a continuouslymono-cropped cucumber （Cucumis sativus L.） system andtheir effects on cucumber seedling growth and soil microbialcommunities [J]. European Journal of Soil Science， 2012，63（3）： 332-340.

[27] 羅文富， 喻盛甫， 賀承福， 等. 三七根腐病病原及復(fù)合侵染的研究[J]. 植物病理學(xué)報， 1997， 27（1）： 85-91.

Luo W F， Yu S F， He C F， et al. On the combined infection ofroot rot pathogens on Panax notoginseng [J]. ActaPhytopathologica Sinica， 1997， 27（1）： 85-91.

[28] 孫炳劍， 袁紅霞， 邢小萍， 等. 鄭州地區(qū)冷季型草坪草根腐病病原鑒定[J]. 草原與草坪， 2007（6）： 51-54.

Sun B J， Yuan H X， Xing X P， et al. Identification ofturfgrass root rot disease in Zhengzhou [J]. Grassland andTurf， 2007（6）： 51-54.

[29] 田給林， 畢艷孟， 孫振鈞， 等. 酚酸類物質(zhì)在作物連作障礙中的化感效應(yīng)及其調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國科技論文，2016， 11（6）： 699-705.

Tian G L， Bi Y M， Sun Z J， et al. Progression allelopathiceffect and regulation of phenolic acids for continuouscropping obstacle system [J]. China Sciencepaper， 2016，11（6）： 699-705.

[30] Hao W Y， Ren L X， Ran W， et al. Allelopathic effects of rootexudates from watermelon and rice plants on Fusariumoxysporum f. sp. niveum [J]. Plant and Soil， 2010， 336（1）：485-497.

[31] 楊瑞秀， 高增貴， 姚遠(yuǎn)， 等. 甜瓜根系分泌物中酚酸物質(zhì)對尖孢鐮孢菌的化感效應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2014， 25（8）：2355-2360.

Yang R X， Gao Z G， Yao Y， et al. Allelopathic effects ofphenolic compounds of melon root exudates on Fusariumoxysporum f.sp. melonis [J]. Chinese Journal of AppliedEcology， 2014， 25（8）： 2355-2360.

[32] Wu H M， Wu L K， Wang J Y， et al. Mixed phenolic acidsmediated proliferation of pathogens Talaromyces helicus andKosakonia sacchari in continuously monocultured Radixpseudostellariae rhizosphere soil [J]. Frontiers inMicrobiology， 2016， 7： 335. doi： 10.3389/fmicb.2016.00335.