摘要：茶小綠葉蟬廣泛分布于各地茶園，是茶園的主要害蟲，對茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)有著很大的影響。目前尚不清楚茶小綠葉蟬侵害對茶鮮葉持嫩性及其制成烏龍茶品質(zhì)代謝物浸出速率的影響。通過剪切力測定、碎茶率分析、烏龍茶沖泡、代謝物分析和相關(guān)性分析等方法，發(fā)現(xiàn)茶小綠葉蟬侵害顯著增加木質(zhì)素、纖維素和果膠等細(xì)胞壁物質(zhì)的含量，降低茶鮮葉嫩度和成品茶碎茶率，影響茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖、兒茶素組分、氨基酸組分和茶氨酸的浸出率。并且，除表兒茶素沒食子酸酯外，這些滋味物質(zhì)的浸出和茶鮮葉的嫩度均與細(xì)胞壁物質(zhì)的含量顯著相關(guān)。本研究探索了茶小綠葉蟬侵害后茶葉滋味品質(zhì)代謝物的浸出規(guī)律，從茶葉采摘、加工和沖泡飲用3 個(gè)方面探索了茶小綠葉蟬侵害對于品質(zhì)性狀的影響。

關(guān)鍵詞：茶樹；茶小綠葉蟬；細(xì)胞壁物質(zhì)；嫩度；浸出率

中圖分類號：S571.1；S435.711 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-806-17

茶葉由茶樹[Camellia sinensis （L.） O.Kuntze]的嫩梢加工而成，因其豐富的香氣、鮮爽的滋味和健康的功效風(fēng)靡世界[1-2]。我國是茶樹的起源地[3]，同時(shí)也是茶葉生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國。在茶樹生長過程中，蟲害的發(fā)生嚴(yán)重影響了茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。茶小綠葉蟬是危害較嚴(yán)重的茶樹害蟲之一，廣泛分布于中國、日本、越南、印度及其他亞洲國家的茶產(chǎn)區(qū)[4-5]。茶小綠葉蟬若蟲與成蟲均通過刺吸茶樹嫩梢攝取汁液，會顯著抑制茶樹的生長。此外，雌性成蟲還會在茶樹嫩梢內(nèi)產(chǎn)卵，導(dǎo)致嫩梢輸導(dǎo)組織受損，水分與營養(yǎng)供應(yīng)不足[6-7]。

被茶小綠葉蟬若蟲和成蟲刺吸后的茶樹嫩梢一般呈現(xiàn)典型的“葉蟬燒”癥狀[8]，受害茶樹葉緣變黃、葉脈變紅、葉片粗老和卷曲，嚴(yán)重時(shí)全葉焦枯易脫落，葉片質(zhì)地變脆，莖節(jié)節(jié)間變短[6-8]。有研究表明，茶小綠葉蟬取食會影響茶樹鮮葉中揮發(fā)性[9]和非揮發(fā)性物質(zhì)（葉綠素、多酚類、咖啡堿、氨基酸和可溶性糖等）[10-11]的組成和比例等，從而改變成品茶的香氣、色澤和滋味品質(zhì)[12]。然而，目前關(guān)于茶小綠葉蟬為害對茶樹其他品質(zhì)性狀影響關(guān)注較少，如新梢的嫩度。

新梢持嫩性是茶樹新品種選育的重要考察性狀之一，生產(chǎn)上認(rèn)為持嫩性是茶樹在一段時(shí)間內(nèi)保持嫩度的能力，持嫩性強(qiáng)則芽葉不易老化、品質(zhì)優(yōu)良[13]。嫩度是持嫩性研究的前提和基礎(chǔ)[14]。不同嫩度的茶鮮葉內(nèi)含物成分和含量不同，適制不同等級的茶葉，因而具有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也存在差異[15]。茶葉的風(fēng)味品質(zhì)是茶葉中化學(xué)成分通過沖泡在茶湯色、香、味上的綜合體現(xiàn)[16]。因此，品質(zhì)相關(guān)代謝物的浸出速率對于成品茶內(nèi)質(zhì)特征的體現(xiàn)具有重要影響。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中品質(zhì)代謝物的浸出含量隨茶樹鮮葉嫩度不同而存在差異[17-19]，表明茶梢嫩度差別可能會影響品質(zhì)代謝物浸出速率。

纖維素、木質(zhì)素和果膠等是組成植物細(xì)胞壁的主要成分，其中纖維素是植物初生壁和次生壁的最主要成分，約占植物干重的1/3；而木質(zhì)素主要出現(xiàn)在次生細(xì)胞壁中，是一種酚類聚合物；果膠則是一類以酸性糖基為主的多糖，茶樹新梢約含有7%的果膠類物質(zhì)[20-22]。研究表明，茶樹新梢纖維素和木質(zhì)素的含量與新梢嫩度呈負(fù)相關(guān)，而茶小綠葉蟬侵害會增加茶樹新梢的木質(zhì)素含量[23-25]。目前，茶小綠葉蟬侵害對于細(xì)胞壁組成成分、新梢嫩度與品質(zhì)代謝物浸出速率的影響尚不清楚。

為探索茶小綠葉蟬侵害對茶鮮葉細(xì)胞壁物質(zhì)含量以及成品茶品質(zhì)代謝物浸出率的影響，本研究通過分析烏龍茶多輪沖泡后茶湯中滋味物質(zhì)浸出率與細(xì)胞壁物質(zhì)的相關(guān)性，篩選茶小綠葉蟬侵害影響滋味代謝物浸出速率的關(guān)鍵細(xì)胞壁成分，從茶葉采摘、加工和沖泡飲用3 個(gè)方面綜合探索茶小綠葉蟬侵害對于品質(zhì)性狀的影響，為“東方美人茶”的科學(xué)沖泡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料

2022 年9 月于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所英德茶葉世界按照一芽三葉的標(biāo)準(zhǔn)采摘金萱茶樹的健康嫩梢（CK）和受茶小綠葉蟬侵害程度為2～3 級（2 級為紅脈期，葉脈、葉緣變暗紅；3 級為焦邊期，葉脈、葉緣紅色轉(zhuǎn)深，并向葉片中部擴(kuò)展，葉尖葉緣逐漸卷曲，焦頭、焦邊，芽葉生長停滯）的嫩梢（T），用于葉片硬度測定和烏龍茶加工。制得的烏龍茶毛茶用于后續(xù)滋味品質(zhì)相關(guān)代謝物的測定。

2019 年10 月于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所英德茶葉世界按照一芽三葉的標(biāo)準(zhǔn)采摘的金萱茶樹健康嫩梢，將嫩梢插在花泥上，然后放入廣口塑料瓶中，并用紗布封住瓶口。每瓶插入10 個(gè)嫩梢，其中處理組放入40 只茶小綠葉蟬，對照組不放葉蟬，隨后將瓶子置于人工氣候箱中培養(yǎng)48 h 和96 h，培養(yǎng)箱溫度為25 ℃，濕度為80%，光照強(qiáng)度為6 500 lux，16 h 光照/8 h 黑暗。每10 個(gè)嫩梢為1 個(gè)重復(fù)，每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理后的樣品用于木質(zhì)素合成途徑基因的表達(dá)分析。

1.2 茶樹嫩梢葉和莖的硬度分析

葉片硬度測定參照文獻(xiàn)[26]方法，用質(zhì)構(gòu)測試儀（FTC，美國）采用質(zhì)地多面分析（TPA）測定葉肉的硬度。10 個(gè)葉片整齊疊在一起，背面朝上，平放于置物臺上。參數(shù)設(shè)定如下：下壓樣品變形量為50%，測試前探頭下降速度為2 mm·s-1，測試速度為1 mm·s-1，測試后探頭回程速度為2 mm·s-1，觸發(fā)力為1 N，探頭高于樣品臺的距離為6 mm，探頭類型為圓柱型，兩次壓縮中停頓時(shí)間為5 s。

葉和莖的最大剪切力用于表征嫩度，測定方法參照文獻(xiàn)[27]。用質(zhì)構(gòu)儀測量葉片最大剪切力時(shí)，摘下新梢第3 葉，將葉片背面朝上水平放置在質(zhì)構(gòu)儀臺面，并將葉片主脈垂直于刀刃，然后對葉片中部依次進(jìn)行測量。第3 節(jié)莖垂直于刀具切至莖段斷裂，電腦記錄剪切力工作曲線。參數(shù)設(shè)定如下：測試速度為1 mm·s-1，測試后探頭回程速度為1 mm·s-1，觸發(fā)力為1 N，返回距離為20 mm，探頭類型為剪切探頭。

因茶小綠葉蟬侵害后茶樹新梢生長受阻，葉片變小，節(jié)間變短。第1 葉和第2 葉的葉面積小于探頭的面積，而第1 節(jié)和第2 節(jié)莖太短導(dǎo)致無法固定，因此本研究只測定了第3 葉的葉片硬度以及第3 葉和第3 節(jié)莖的最大剪切力。

1.3 木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的測定

木質(zhì)素、纖維素和果膠含量分別采用木質(zhì)素含量檢測試劑盒、纖維素含量檢測試劑盒和果膠含量檢測試劑盒測定（索萊寶科技有限公司，中國），具體方法參考試劑盒說明書。每個(gè)處理3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 碎茶率的分析和茶葉的沖泡

碎茶率的測定方法參照GB/T 8311—2013中粗形茶的茶碎測定方式。茶葉的沖泡方法參照GB/T 23776—2018，稍作修改。第一泡，5 min；第二泡，5 min；第三泡，5 min。每泡茶湯用于檢測茶湯中的滋味物質(zhì)。

1.5 茶多酚的測定

取0.2 g 的茶葉粉末，用10 mL 70%甲醇于70 ℃水浴中提取20 min，離心取上清液進(jìn)行稀釋。取40 μL 稀釋液（茶湯樣品為40 μL茶湯）于試管內(nèi)，加入200 μL 的福林酚，搖勻，反應(yīng)3～8 min 后加入160 μL 7.5%碳酸鈉（Na2CO3）溶液，室溫下放置60 min 后，用酶標(biāo)儀Tecan Infinite F50（Tecan Aust-RIAGmbH，瑞士）測定765 nm 波長條件下的吸光度。按同樣的方法測定0、10、20、30、40、50 μg穖L-1 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總多酚的含量。

1.6 游離氨基酸的測定

稱取100 mg 茶葉粉末，加入1 mL 沸水，渦旋2 min 沸水浸提15 min，5 000 g 離心10 min。取200 μL 上清液（茶湯樣品為200 μL 茶湯），加100 μL 緩沖液（pH=7.8），100 μL 茚三酮顯色劑，在沸水浴中加熱15 min。冷卻后，取100 μL 反應(yīng)液，加1.15 mL 水，用酶標(biāo)儀在570 nm 處測量吸光度。利用茶氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量。

1.7 可溶性糖的測定

稱取0.1 mg 茶葉粉末，加入5 mL 純水，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，10 000 g 離心5 min，取上清液用于可溶性糖含量檢測。取50 μL 測試液（茶湯樣品為50 μL 茶湯）于2 mL離心管中，依次加入450 μL 純水和100 μL 蒽酮乙酸乙酯溶液（20 mg·mL-1），混勻。緩慢加入1 mL 濃硫酸，混勻后沸水浴7 min，放置到室溫后，用酶標(biāo)儀Tecan Infinite F50 檢測620 nm 波長下其吸光度A。利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 氨基酸組分的測定

氨基酸組分測定參考文獻(xiàn)[28]的方法。取0.1 g 茶葉粉末，加入0.5 mL 預(yù)冷的甲醇，冰浴超聲提取15 min，加入0.5 mL 氯仿和0.2 mL冷水混合渦旋。12 000 r·min-1 離心5 min，收集上清液500 μL，用真空干燥器（RVC 2-18plus；Christ GmbH，Osteerode am Harz，德國）在40 ℃下濃縮，加入1 mL 5%磺基水楊酸復(fù)溶（茶湯樣品則取10 mL 茶湯經(jīng)冷凍干燥儀完全干燥后，加入1 mL 5%磺基水楊酸復(fù)溶），溶液靜置1 h 后，12 000 r·min-1 離心5 min，取上清液用0.45 μm 的濾膜過濾。用氨基酸自動(dòng)分析儀（Sykam GmbH，Eresing，德國）進(jìn)行檢測，色譜柱為高效鈉陽離子交換柱。流動(dòng)相為檸檬酸鋰（pH 為2.9、4.2 和8.0），UV-Vis檢測設(shè)置為570 nm 和440 nm。流動(dòng)相流速為0.45 mL·min-1，茚三酮（衍生試劑）流速為0.25 mL·min-1。柱溫為38 ℃，反應(yīng)設(shè)備（柱后）溫度為130 ℃。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為5 ℃，進(jìn)樣量為50 μL。

1.9 兒茶素組分和咖啡堿的測定

取0.2 g 茶葉粉末，加入10 mL 預(yù)熱的70%甲醇，混勻后70 ℃水浴20 min，12 000 r·min-1離心5 min，取1 mL 上清液（茶湯樣品為1 mL茶湯），經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)行檢測。檢測方法參照GB/T 30483—2013，稍作修改。采用高效液相色譜法檢測， 色譜柱為ZORBAX Eclipse C18（4.6 mm×150 mm，5 μm；Agilent，美國），進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ℃。溶劑相A 為含9%乙腈和2%冰醋酸的去離子水，溶劑相B 為含2%冰醋酸的乙腈。溶劑線性梯度為0.0～22.0 min，100% B；22.0～32.0 min，100%～70% B ； 32.0～52.0 min ， 72% B ；52.0～67.0 min，100% A；67.0～97.0 min，100%B。流動(dòng)相流速為1 mL·min-1。紫外吸收波長為278 nm。用標(biāo)準(zhǔn)品對表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ Epicatechin gallate ，ECG）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、兒茶素（Catechin，C）和兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，CG）進(jìn)行定性和定量分析。

1.10 基因表達(dá)分析

Eastep? Super 總RNA 提取試劑盒用于提取樣品RNA，PrimeScript? RT 試劑盒用于將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Roche LightCycler480 實(shí)時(shí)PCR 儀（Roche，瑞士）及SYBR GreenMix 熒光染料試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT 法分析基因的相對表達(dá)水平。CsEF1-α （ Genebank No ：KA280301.1）作為內(nèi)參基因，基因特異性引物見表1。

1.11 L-苯丙氨酸的測定

取50 mg 茶葉粉末，加入1 mL 70%乙醇。加入D8-L-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，混勻后冰浴超聲30 min，12 000 r·min-1 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 過濾膜過濾后，通過超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCQTOF-MS，Waters Corpatation，美國）進(jìn)行分析。色譜柱為Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm；Waters）。流速和進(jìn)樣量分別設(shè)置為0.45 mL·min-1 和5 μL。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈溶液。線性梯度洗脫如下：0～6 min，1%～50% B；6～7 min，50%～99% B；7～8 min，99%～1% B；9～10 min，1% B。

1.12 肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸的測定

取0.2 g 茶葉粉末，加入1 mL 甲醇（含0.2%維生素C），混勻后，冰浴超聲30 min，10 000 r·min-1 離心8 min，取上清液。重復(fù)以上步驟并合并上清液。通過氮吹儀濃縮干燥后用200 μL 甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用高效液相色譜- 質(zhì)譜儀（ HPLC-MS ，Ultimate 3000，Thermo Scientific，Waltham，美國）進(jìn)行分析。色譜柱為Acquity UPLC RHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm；Waters）。洗脫流速為1 mL·min-1，流動(dòng)相流速和進(jìn)樣量分別設(shè)置為0.3 mL·min-1 和2 μL。線性梯度程序參考文獻(xiàn)[29]，柱溫箱溫度35 ℃。

1.13 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 23.0 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表制作利用Excel 進(jìn)行。相關(guān)性分析用Pearson 相關(guān)性分析法，P＜0.05 表示具有顯著相關(guān)性。兩組間的差異用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 和P＜0.01 分別表示具有顯著和極顯著差異。3組間的差異采用單因素方差分析，P＜0.05 表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬侵害提高茶嫩梢細(xì)胞壁物質(zhì)含量與葉片硬度

檢測結(jié)果顯示，茶小綠葉蟬侵害后，茶樹嫩梢含水率顯著降低（圖1A）；木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量均顯著增加（圖1B）；第3 葉和第3 節(jié)的嫩度顯著降低（圖1C 和D）；而第3 葉的硬度顯著增加（圖1E）。木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量與葉片硬度、葉和莖的最大剪切力之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，木質(zhì)素、纖維素和果膠含量均與葉的最大剪切力顯著正相關(guān)（圖1F）；除果膠含量與莖的最大剪切力不相關(guān)以外，木質(zhì)素和纖維素含量均與莖的最大剪切力顯著正相關(guān)（圖1F）；木質(zhì)素、纖維素和果膠含量均與葉片硬度顯著正相關(guān)（圖1G）。以上結(jié)果表明，茶小綠葉蟬侵害提高第3 葉硬度及剪切力，可能是由于茶小綠葉蟬吸食了大量嫩梢汁液，同時(shí)提高了單位質(zhì)量下木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量，導(dǎo)致硬度增加。

2.2 茶小綠葉蟬侵害降低成品茶碎茶率

茶鮮葉硬度和嫩度的改變通常會影響茶葉在加工過程中的碎茶率，而茶碎的增多則會降低成品茶的品質(zhì)。本研究測定了茶小綠葉蟬侵害和未侵害的鮮葉加工而成的烏龍茶碎茶率。結(jié)果顯示，茶小綠葉蟬侵害會顯著降低碎茶率（圖1H）。這可能與烏龍茶加工采用熱揉，越嫩的鮮葉越容易碎相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，碎茶率與葉片硬度以及葉和莖的嫩度無顯著差異（圖1I 和1J），也與纖維素和果膠含量無顯著相關(guān)性，僅與木質(zhì)素含量顯著負(fù)相關(guān)（圖1K）。以上結(jié)果表明，茶小綠葉蟬侵害可能通過提高木質(zhì)素含量降低烏龍茶成品茶的碎茶率。

2.3 茶小綠葉蟬侵害降低茶多酚和游離氨基酸的浸出率

茶多酚、游離氨基酸和可溶性糖是茶葉中十分重要的呈味物質(zhì)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害后的茶葉中茶多酚顯著升高，游離氨基酸顯著降低，可溶性糖的含量無顯著變化（圖2A）。由于人們飲茶通常是多輪的沖泡，因此，茶湯中的呈味物質(zhì)含量變化也是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。本研究對各輪茶湯中呈味物質(zhì)含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著沖泡次數(shù)的增加，茶多酚、游離氨基酸和可溶性糖的含量顯著減少（圖2B）。此外，浸出率結(jié)果表明，茶多酚和游離氨基酸的浸出率顯著下降，但可溶性糖的浸出率在第3 次沖泡時(shí)顯著增加（圖2C）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，木質(zhì)素、纖維素和果膠含量均與茶多酚第1 泡的浸出率顯著負(fù)相關(guān)，茶多酚第2 泡和第3 泡的浸出率也與木質(zhì)素和纖維素含量顯著負(fù)相關(guān)，但是與果膠含量無顯著相關(guān)性（圖2D）。以上結(jié)果表明，木質(zhì)素和纖維素含量的增加顯著影響了茶多酚3 次沖泡的浸出率，而果膠含量的增加只影響第1 泡茶多酚的浸出率。與茶多酚結(jié)果類似，果膠含量只與第3 泡游離氨基酸浸出率顯著負(fù)相關(guān)，而木質(zhì)素和纖維素含量與第1 泡和第3 泡游離氨基酸浸出率顯著負(fù)相關(guān)（圖2E）。此外，木質(zhì)素、纖維素和果膠只與第3 泡可溶性糖的浸出率顯著正相關(guān)（圖2F），表明木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的增加可能會促進(jìn)可溶性糖的浸出。

2.4 茶小綠葉蟬侵害影響兒茶素組分和咖啡堿浸出率

兒茶素組分和咖啡堿（CA）同樣是茶葉十分重要的呈味物質(zhì)。測定結(jié)果顯示，非酯型兒茶素中EC、GC、EGC 和GA 含量在茶小綠葉蟬侵害后顯著增加，而C 無顯著變化（圖3A 和圖3C）。此外，咖啡堿含量（圖3B）、酯型兒茶素中CG 和ECG 含量在茶小綠葉蟬侵害后也顯著增加，但含量最高的EGCG 無顯著變化（圖3C）。進(jìn)一步檢測茶湯中的GA、CA 和兒茶素單體含量發(fā)現(xiàn)，除未受茶小綠葉蟬侵害樣品的第2 泡CA 含量無顯著變化外，其余樣品每泡茶湯中的GA（圖3D）、CA（圖3E）和兒茶素單體（圖3F）含量均顯著降低。浸出率分析結(jié)果顯示，CA 的浸出率并不受茶小綠葉蟬侵害的影響（圖4B），而處理組樣品中的C、EC、CG 和EGCG 在第1 泡和第2 泡的浸出率均顯著降低（圖4C），GC 和GA 只有在第1 泡的浸出率顯著降低（4A 和4C）。

并且，茶小綠葉蟬侵害不影響ECG 的浸出率（圖4C）。各物質(zhì)浸出率與木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，果膠的含量僅與第3 泡CA 的浸出率顯著負(fù)相關(guān)（圖4D）。細(xì)胞壁成分含量與酯型兒茶素相關(guān)性分析表明，ECG 的浸出率不受木質(zhì)素、果膠和纖維素含量增加的影響，第1 泡和第2 泡CG 的浸出率降低與果膠含量的增加相關(guān)，而EGCG 的浸出率與木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量均顯著負(fù)相關(guān)（圖4E），表明木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的增加可能會降低EGCG 的浸出率。在酯型兒茶素中，第1 泡和第2 泡C 的浸出率顯著降低，并與木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量顯著負(fù)相關(guān)（圖5）。第1 泡EC 的浸出率受纖維素和果膠的影響，而第2 泡EC 的浸出率受木質(zhì)素的影響（圖5A）。此外，木質(zhì)素和果膠還會影響第3 泡EC 的浸出率，但GC 的浸出率與木質(zhì)素含量無顯著相關(guān)性，與纖維素含量顯著相關(guān)，即GC 的浸出率不受木質(zhì)素的影響，受纖維素的影響（圖5A）。果膠也會影響第1泡GC 的浸出率（圖5A）。與其他滋味物質(zhì)相反，EGC 在第3 泡的浸出率顯著增加（圖4C），相關(guān)性結(jié)果表明這與木質(zhì)素和纖維素含量的增加顯著正相關(guān)（圖5A）。GA 在第1 泡的浸出率受纖維素含量的影響，在第2 泡GA 的浸出率受木質(zhì)素含量的影響，而在第3 泡GA 的浸出率不受細(xì)胞壁成分的影響（圖5B）。以上結(jié)果表明，木質(zhì)素、纖維素和果膠含量廣泛影響了兒茶素的浸出率。

2.5 茶小綠葉蟬侵害降低氨基酸組分含量及茶氨酸浸出率

氨基酸分為苦味氨基酸、甜味氨基酸、鮮味氨基酸和其他氨基酸，是茶葉中十分重要的呈味物質(zhì)。與游離氨基酸結(jié)果類似，茶小綠葉蟬侵害后，除了貢獻(xiàn)甜味的色氨酸以及其他氨基酸單體磷酸絲氨酸、天冬酰胺、α-氨基丁酸和γ-氨基丁酸的含量無顯著變化以外，大多數(shù)氨基酸單體含量顯著降低（圖6A～6D）。氨基酸組分中，茶葉重要滋味物質(zhì)茶氨酸的含量在茶小綠葉蟬侵害后顯著降低（圖6E）。茶湯中的茶氨酸隨著沖泡次數(shù)的增加，含量顯著減少，并且茶小綠葉蟬侵害后茶湯中的茶氨酸顯著低于對照組（圖6F）。但是，茶小綠葉蟬侵害只顯著降低了第1 泡茶氨酸的浸出率（圖6G）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，第1 泡茶氨酸浸出率的降低與木質(zhì)素、纖維素和果膠含量顯著負(fù)相關(guān)（圖6H），表明木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的增加可能影響了茶氨酸的浸出率。

2.6 茶小綠葉蟬侵害促進(jìn)木質(zhì)素合成途徑

為進(jìn)一步探究茶小綠葉蟬侵害如何影響細(xì)胞壁物質(zhì)的組成，檢測了木質(zhì)素合成途徑中的一些基因和部分前體物質(zhì)。結(jié)果顯示，在茶小綠葉蟬侵害后，除CsCOAOMT1，CsCAD1-1，CsCAD1-2，CsCAD9-1 和CsCAD9-2 外，其他木質(zhì)素合成途徑的基因被激活（圖7A）。盡管香豆酸含量在茶小綠葉蟬侵害后顯著下調(diào)（圖7B），但是下游的咖啡酸含量顯著升高，暗示茶小綠葉蟬侵害顯著促進(jìn)了香豆酸向咖啡酸的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而可能促進(jìn)木質(zhì)素的合成。

3 討論

植物細(xì)胞壁是植物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要來源于光合作用的同化產(chǎn)物，是地球上最豐富的可再生資源。植物細(xì)胞壁作為生物質(zhì)具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為可持續(xù)經(jīng)濟(jì)提供了各種有價(jià)值的成分，包括纖維、飼料、食品和燃料等[30]。

植物細(xì)胞壁的物理結(jié)構(gòu)保證了其參與與植物生長和適應(yīng)有關(guān)的大多數(shù)生理過程。例如，木質(zhì)素是高等陸生植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，具有加強(qiáng)細(xì)胞壁、促進(jìn)水分運(yùn)輸和作為病原體物理屏障的作用[31]。一般而言，茶小綠葉蟬更傾向于取食幼嫩的葉片與莖[4]，這些部位通常含有更低含量的細(xì)胞壁成分。本研究發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害后，茶樹葉片與莖中的木質(zhì)素、纖維素和果膠含量均顯著增加，硬度顯著增加，并且葉片的硬度與木質(zhì)素、纖維素含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（圖1），暗示茶樹可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞壁成分的蓄積抑制葉蟬的取食，從而增強(qiáng)自身對于脅迫環(huán)境的適應(yīng)性。表明細(xì)胞壁成分可能在茶樹響應(yīng)茶小綠葉蟬侵害的采前生長中發(fā)揮了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害后，新梢的嫩度、制得烏龍茶的碎茶率及其多數(shù)滋味品質(zhì)代謝物的浸出率均降低。研究表明，茶小綠葉蟬侵害會誘導(dǎo)大量香氣揮發(fā)物的蓄積[12]，從而影響茶葉的香氣品質(zhì)。綜合本研究的結(jié)果表明，茶小綠葉蟬侵害對于茶葉品質(zhì)性狀的影響是全方面的。目前已知的所有細(xì)胞壁成分木質(zhì)素聚合物都是由苯丙氨酸途徑產(chǎn)生或衍生[31]，而影響茶葉香氣品質(zhì)的許多香氣物質(zhì)也是由苯丙氨酸途徑衍生而來[32]。因此，茶小綠葉蟬侵害可能通過影響細(xì)胞壁成分，從而影響香氣物質(zhì)的代謝，進(jìn)而影響茶葉的香氣品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁成分中的一些成分與新梢嫩度、烏龍茶碎茶率和各種滋味品質(zhì)相關(guān)代謝物的浸出率呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，表明茶小綠葉蟬侵害通過影響細(xì)胞壁成分不僅影響了香氣品質(zhì)，還影響了諸多其他品質(zhì)。因此，細(xì)胞壁成分可能介導(dǎo)了茶小綠葉蟬侵害對于茶葉采后品質(zhì)的多方面調(diào)控。

品質(zhì)代謝物的浸出速率對于成品茶內(nèi)質(zhì)特征的呈現(xiàn)具有重要影響。研究茶葉成分浸出速率及浸出過程中的物理化學(xué)變化，對于茶葉內(nèi)含成分的提取，以及確定速溶茶和其他茶葉飲料制造中最經(jīng)濟(jì)的提取方法非常重要[33]。

茶多酚、咖啡堿、氨基酸、多糖、色素等特征成分在茶湯中的溶解與釋放不僅與化合物的理化性質(zhì)相關(guān)，而且與茶葉的種類、水質(zhì)、水溫、茶水比、沖泡時(shí)間、沖泡次數(shù)等相關(guān)[34-36]。然而，這些關(guān)于茶葉品質(zhì)代謝物水溶速率的研究多集中于沖泡水溫、時(shí)間和次數(shù)等沖泡階段的參數(shù)，而關(guān)于茶鮮葉采前階段的影響因子研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害顯著改變了茶樹葉片細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分的含量，進(jìn)而影響了成品茶沖泡階段滋味品質(zhì)相關(guān)代謝物的浸出情況。其原因可能是由于木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的增加導(dǎo)致細(xì)胞壁物理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響滋味相關(guān)物質(zhì)的含量。表明采前階段的昆蟲侵害對于成品茶品質(zhì)代謝物浸出速率的影響同樣值得關(guān)注。然而，中國常見茶樹害蟲約400 種[37]，其他茶樹害蟲對茶樹葉片細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分和品質(zhì)代謝物浸出規(guī)律的影響仍有待于進(jìn)一步研究。

已有研究表明，茶小綠葉蟬侵害有助于提升茶葉的香氣品質(zhì)，但會降低茶葉的色澤品質(zhì)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害會顯著影響茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖等品質(zhì)代謝物的含量并降低這些物質(zhì)在沖泡過程中的浸出率。以上研究結(jié)果表明，茶小綠葉蟬對于茶葉香氣、色澤和滋味品質(zhì)的調(diào)控存在差異。目前，與品質(zhì)相關(guān)的一些代謝物合成基因已在茶葉中被鑒定[1，38]。昆蟲侵害會誘導(dǎo)植物激素信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄組重排，從而導(dǎo)致植物表型發(fā)生變化[39]。

對于影響品質(zhì)代謝物的上游激素信號和關(guān)鍵調(diào)控基因的挖掘，尤其是共有調(diào)控信號路徑的闡明，將有助于人們理解茶小綠葉蟬侵害對于茶樹品質(zhì)性狀的綜合影響。Gu 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬侵害會影響油菜素內(nèi)酯的合成；Cao 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯信號途徑的重要轉(zhuǎn)錄因子PbBZR1 負(fù)調(diào)控中國梨中木質(zhì)素的合成。本研究結(jié)果表明，木質(zhì)素與茶葉大多數(shù)品質(zhì)性狀均顯著相關(guān)。然而，茶小綠葉蟬侵害是否有可能通過油菜素內(nèi)酯途徑調(diào)控木質(zhì)素的合成進(jìn)而影響這些品質(zhì)性狀仍有待進(jìn)一步揭示?；诠灿姓{(diào)控路徑的解析，通過特異性調(diào)控共有上游路徑，實(shí)現(xiàn)茶小綠葉蟬侵害下多品質(zhì)性狀的平衡，將是未來努力的方向。

本研究探索了茶小綠葉蟬侵害引起的細(xì)胞壁物質(zhì)含量升高對鮮葉嫩度及對成茶碎茶率和滋味物質(zhì)浸出率的影響，提出了圖8 所示模型。茶小綠葉蟬侵害后細(xì)胞壁組成物質(zhì)木質(zhì)素、纖維素和果膠的含量顯著增加。一方面，增加了茶鮮葉的硬度并降低了嫩度，影響茶葉的持嫩性；另一方面，降低了碎茶率，并且降低了茶多酚、游離氨基酸等的浸出率。除ECG外，這些滋味物質(zhì)的浸出率均受木質(zhì)素、纖維素和果膠含量的影響。本研究探索了茶小綠葉蟬侵害后滋味品質(zhì)相關(guān)代謝物的浸出規(guī)律，從新的角度解讀了茶小綠葉蟬侵害對于成品茶滋味品質(zhì)性狀的影響，同時(shí)為將來“東方美人茶”的科學(xué)沖泡提供理論依據(jù)。

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