唐佳靈,郭星藍,饒鈞玥,楊茂杰,曹蕓榕,韓國全,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院,四川 雅安,625014)2(四川農(nóng)業(yè)大學食品加工與安全研究所,四川 雅安,625014)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)隸屬于弧菌科弧菌屬,為革蘭氏陰性嗜鹽性海洋細菌,VP主要存在于淺海地區(qū),并且在幾乎所有水生生物中可大量生長繁殖。常存在于魚、蝦、貝等日常食用的海產(chǎn)品中,是在我國沿海地區(qū)導致食物中毒和夏季腹瀉的主要病原菌,臨床上可引起人類腹痛、嘔吐及腹瀉等癥狀,甚至會導致死亡;由于其生成的被膜加強了自身的抗性,導致其對環(huán)境有著很強的抵抗力,普通的加熱方式難以將其殺滅,該菌也是高居微生物性食物中毒的榜首[1],因此探究生物被膜(biofilm,BF)的生成機制極其重要。表1是我國部分地區(qū)VP的檢出率。由表1可以得知,在我國各地的水產(chǎn)品中,VP的檢出率均較高。

表1 我國部分地區(qū)副溶血性弧菌陽性檢出率Table 1 Positive detection rate of V.parahaemolyticus in some regions of China

BF是微生物在特定條件下形成的一種特殊群體結(jié)構(gòu),是細菌為了適應環(huán)境、利于自身生存的一種存在形態(tài),具有很強的抗性,當形成至成熟階段,不僅容易產(chǎn)生毒素污染食品,還容易造成食物中毒,危害人民群眾健康安全。BF是微生物群落附著在各種載體上,通過分泌多糖、纖維蛋白與脂質(zhì)蛋白等胞外基質(zhì),將載體包繞其中而形成的大量高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物。據(jù)美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)統(tǒng)計,人類細菌性感染中大約65%是由BF引起的[8]。同時,隨著廣譜抗菌藥物的大量使用,多重耐藥的VP的檢出率越來越高,有研究表明,其耐藥性的產(chǎn)生與生物被膜形成密切相關[9]。

VP能夠在生物和非生物表面形成BF,甚至可以黏附到人體的腸道中,進而引發(fā)一系列疾病。有研究表明,BF還會促使更多的細菌協(xié)同共生,使宿主表面污染的更加嚴重,例如在VP的BF里,會與單增李斯特菌協(xié)同生長,對人體或者食品起著更大的破壞作用[10]。同時在自然環(huán)境中,BF是大部分細菌的溫室,它使得細菌對環(huán)境的壓力抗性增強。目前,關于研究細菌BF的形成機制中,多集中在銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌中,對VP生物被膜的形成原理的探討相對較少。因此,本文通過對VP BF形成的動態(tài)過程、信號分子以及它的具體調(diào)控過程進行綜合論述,為解決該菌的BF出現(xiàn)在人類疾病治療、食用食品和食品生產(chǎn)工具上等難題提供理論依據(jù),并期望從中得出解決辦法。

1 BF的形成過程

近年來,隨著越來越多的國內(nèi)外學者參與BF機制的研究,對BF的了解越發(fā)深入。BF的形成是一個復雜的動態(tài)過程,目前,學術(shù)界內(nèi)普遍將BF的形成過程分為5個階段,如圖1所示,即分別為可逆附著階段、不可逆附著階段、微菌落的形成、BF的成熟及最終的分散階段[11]。細菌在BF模式下抵抗力的強度是單個浮游細菌的上千倍,這就導致在宿主表面很難將其徹底消滅。

在第一階段,由于細菌與被接觸物體表面的非特異性相互作用,包括靜電力、疏水作用等,以附著在宿主表面。在此期間,菌體一般都是通過浮游細菌形式存在的。此時菌體與被附著物體之間相互作用不強,可通過簡單溫和的方式將二者進行分離。第二階段主要是細菌開始分泌群體感應分子和黏性聚合物,同時也因為細菌的一些附屬結(jié)構(gòu)(例如鞭毛和菌毛等),增強了與被接觸物品之間的相互作用,導致其從第一階段的可逆附著變?yōu)椴豢赡娓街Ｔ诘谌A段中,由于第二階段中的細菌數(shù)量逐漸增加,細菌會因為BF的形成而使得一些相關基因被激活和表達,在胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)內(nèi)繁殖形成單一菌落,隨后大量聚集而形成微菌落,同時大量的微菌落還會促使BF加厚。第三階段中,隨著大量的微菌落形成,BF的厚度逐漸增大,BF最終成熟并定殖于被附著物體表面。此階段的BF,對惡劣的環(huán)境有著更強的抗性。最后階段,細菌從成熟的BF中游離出來,再次轉(zhuǎn)變?yōu)楦∮螤顟B(tài),以尋求更適宜的生長環(huán)境,尋找適合的物體表面形成新的BF,形成浮游細菌-細菌BF-浮游細菌-細菌BF的循環(huán)形態(tài),以此進行大量增殖直至污染物體表面各處,這是一個沒有休止的循環(huán)。

成熟的BF對食品的加工過程和安全造成極大的影響。BF附著在食品,生產(chǎn)設備等表面,甚至還會附著在動物表皮、人的牙齒表面,對人體的健康以及財產(chǎn)造成極大的危害。其生長在食品表面,會造成食品的貨架期和保質(zhì)期的縮短,使經(jīng)濟遭受極大損失。李安琪[12]研究表明在VP(ATCC17802和VP-0)的生物被膜形成過程中,0～12 h為可逆黏附階段,12～48 h為不可逆黏附和微菌落形成階段,48～72 h為成熟階段,72～144 h為分散階段;這對VP的BF形成過程有了更進一步的了解,若在第一階段就將其消滅,就可得到良好的控制,這對食品生產(chǎn)具有指導意義。由于現(xiàn)實環(huán)境的復雜性,BF的形成與實驗室條件下存在一定差距,因此還需要更深一步研究。

階段1:可逆附著階段;階段2:不可逆附著階段;階段3:微菌落的形成;階段4:生物被膜的成熟;階段5:單個細菌從微菌落分散出來圖1 細菌生物被膜發(fā)育階段的模Fig.1 Model of the developmental stage of bacterial biofilm

2 影響生物被膜形成的調(diào)控因素

2.1 環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)調(diào)控生物被膜的形成

2.1.1 c-di-GMP的形成及作用

在細菌中,c-di-GMP是最重要和最常見的第二信使分子,主要是由兩分子的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)經(jīng)二鳥苷酸環(huán)化酶催化縮合形成的環(huán)狀二核苷酸[13],其通常存在于原核生物細胞中,在革蘭氏陰性菌中最為普遍;它是控制著細菌從游離狀態(tài)、表面附著、形成成熟的BF到再次改變?yōu)橛坞x狀態(tài)的核心調(diào)控因子[14],其具體作用為誘導效應蛋白構(gòu)象變化、轉(zhuǎn)錄激活、蛋白間的相互作用、基因下調(diào)和增強酶活性,從而調(diào)控生物被膜的形成、細菌動力和毒力因子等。c-di-GMP對細菌的BF形成具有重要的意義,不僅可以通過直接誘導蛋白產(chǎn)生BF,亦可通過間接調(diào)節(jié)EPS的方式來參與生成BF;但在不同生物中,EPS對生物被膜的形成和抗逆性了解的并不清晰,需更進一步的了解。

根據(jù)最近研究表明,c-di-GMP調(diào)節(jié)細菌下一步表型的方式大致有3種:c-di-GMP的受體蛋白與轉(zhuǎn)錄因子進行結(jié)合,進而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子對相關基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[15];c-di-GMP通過調(diào)控靶蛋白來影響細菌的生命活動[16];c-di-GMP作為核糖開關,在核糖體上的mRNA結(jié)合位點結(jié)合,進一步調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[17]。但是,通過第三步的方式來調(diào)控下游表型的細菌較少。

2.1.2 二鳥苷酸環(huán)化酶與磷酸二酯酶調(diào)控c-di-GMP的機制

含有GGEEF或GGDEF結(jié)構(gòu)域的二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclases,DGCs)和含有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)參與c-di-GMP的共同調(diào)節(jié)。最新的研究表明,含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的DGCs會導致c-di-GMP濃度增高,即DGCs可合成c-di-GMP。活性DGCs由2個被GGDEF結(jié)構(gòu)域整合的亞基組成,DGCs的催化活性位點插入到2個亞基的界面上,每個亞基可以結(jié)合一個GTP分子,這個位點對GGDEF基序有回應,并且這個基序處的任何突變都會導致DGCs失活[17]。具體合成c-di-GMP的機制是2個GTP以反平行的方式被DGCs的2個亞基結(jié)合,生成一個c-di-GMP分子。當細胞內(nèi)存在Mn2+和Mg2+時,具有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域活性的PDEs可以催化c-di-GMP降解,其中EAL結(jié)構(gòu)域降解c-di-GMP為2分子GMP,HD-GYP結(jié)構(gòu)域降解為5′-磷酸鳥苷酸-(3′-5′)-鳥苷(pGpG)[18]。對其晶體結(jié)構(gòu)的研究表明,EAL二聚體具有一種蛤殼狀的開啟和關閉機制,負責調(diào)節(jié)PDEs的活性,其保守的二聚界面由2個螺旋組成,其中一個是α5,通過形成β5-α5環(huán)直接連接到2個中心的Asp殘基,后者與活性位點上的金屬離子進行配位,從而調(diào)節(jié)PDEs的活性[19];此外,在EAL二聚體的打開和關閉運動中,β5-α5環(huán)可能發(fā)生顯著重排,該環(huán)可作為一個“鉸鏈關節(jié)”,通過金屬離子在活性位點上的定位,將EAL構(gòu)象與PDEs的活性進行聯(lián)系起來,一些含有c-di-GMP效應因子的EAL結(jié)構(gòu)域蛋白通過使用這種底物結(jié)合的二聚體和β5-α5重排來調(diào)節(jié)細菌生理過程,進而抑制c-di-GMP形成[20]。其次,各種不同的受體對c-di-GMP濃度變化的感應,導致c-di-GMP與受體共同作用于下游的靶標,將信號傳達下去,最后,將信號轉(zhuǎn)化成對各種生物學性狀的調(diào)控,具體如圖2所示[21]。近年來,也新發(fā)現(xiàn)了一系列的含GGDEF結(jié)構(gòu)域的基因,如cdgA、cdgB、cdgC、cdgD、cdgE、cdgF、cdgG和cdgH等,其中cdgF編碼的二磷酸環(huán)化酶通過控制細菌的生長方向來完成向生物被膜的轉(zhuǎn)換[22]。

圖2 c-di-GMP分子調(diào)控模式Fig.2 c-di-GMP molecular regulatory model

不過,GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域可能同時出現(xiàn)于同一個蛋白質(zhì)中,這種蛋白被稱作“混合型”蛋白質(zhì)[23]。二者任何一個結(jié)構(gòu)域被催化活化,另一個結(jié)構(gòu)域即獲得調(diào)控功能或出現(xiàn)第三方調(diào)控結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)二者功能的分離,進而影響生物被膜的形成。有研究表明,若是細菌胞內(nèi)的c-di-GMP濃度高于某一標準值,則可以促進生物被膜的形成,反之,若濃度過低,則可抑制生物被膜的形成[24]。GALPERIN等[25]發(fā)現(xiàn),弧菌比其他細菌含有更多的DGCs和PDEs,說明c-di-GMP對弧菌生物學的重要意義,也反映了c-di-GMP在調(diào)控生物被膜中的重要作用。對不同的菌種而言,細菌體內(nèi)的DGCs和PDEs含量不盡相同,但都處于動態(tài)平衡,在各自的生命活動中發(fā)揮著獨特作用。

2.1.3 VP中c-di-GMP的具體表達

VP中的c-di-GMP受到ScrA、ScrB、ScrC、ScrG等十幾個蛋白的調(diào)控,其中ScrA、ScrB、ScrC由操縱子scrABC編碼;當ScrC與ScrA和ScrB共同存在時,它可以作為磷酸二酯酶減少細胞中的c-di-GMP;相反,ScrC在ScrA和ScrB兩個都缺失的情況下,將作為二鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生c-di-GMP[26]。但沒有研究表明ScrC或ScrA缺失一個是否會對BF的形成有影響。ScrA是一種存在于胞漿中的磷酸吡哆醛依賴型的氨基轉(zhuǎn)移酶,其功能主要是產(chǎn)生分泌性信號(S信號),能與ScrB(一種存在于周質(zhì)中的依賴蛋白)發(fā)生相互作用[27],當細胞中出現(xiàn)S信號后并達到一定標準后,使蛋白ScrC(為一種潛在的感覺蛋白)的EAL結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出PDEs活性,使c-di-GMP發(fā)生降解,同時通過激活laf基因(鞭毛基因)使其運動能力增強,并抑制cps基因(莢膜多糖基因)的表達,從而使BF的形成能力減弱;當S信號濃度降低時,ScrC蛋白將會表現(xiàn)出GGDEF結(jié)構(gòu)域的作用,開始表現(xiàn)出DGCs活性,以此來促進c-di-GMP的合成[28]。不過當scrABC操縱子突變后,由于其抑制了laf基因和cps基因的表達,將會導致菌體的爬動能力逐漸喪失并且呈現(xiàn)出皺縮的菌落形態(tài),導致其比野生型菌株有更強的形成BF能力[29]。綜上可知,Scr轉(zhuǎn)錄因子家族在VP BF發(fā)育所需的靶基因中發(fā)揮了獨特和重疊的調(diào)控作用,如何避免或降低ScrABC操縱子突變率,也是抑制形成生物被膜的重要因素。

綜上,若能提前抑制DGCs或激發(fā)PDEs的活性,即可以使細菌胞內(nèi)的c-di-GMP含量降低到難以進行下一步表達的濃度,進而阻斷VP產(chǎn)生部分后續(xù)的生理效應。根據(jù)研究表明,一些物質(zhì)能提前抑制c-di-GMP的轉(zhuǎn)錄,具體見下表所示:

表2 抑制c-di-GMP轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)Table 2 Substances that inhibit c-di-GMP transcription

但上表介紹的2種抑制劑對人體都有著較強的毒性,因而應用面較窄;而藍光和NO的應用,卻有著較高的經(jīng)濟成本,故若能發(fā)現(xiàn)一種對人體無害、成本低、且能抑制BF形成的物質(zhì)或方法,將對食品行業(yè)帶來積極的影響。

2.2 群體感應系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的形成

群體感應(quorum sensing,QS)又稱為“細胞與細胞的交流”,是微生物間通過化學信號分子進行信息傳遞的一種方式,且需要信號分子濃度達到一定的數(shù)值時才能發(fā)生的感應現(xiàn)象;當信號分子達到一定閾值時,可與相對應的應答原件結(jié)合,改變細菌代謝狀態(tài)、某種特定蛋白轉(zhuǎn)錄及表達水平,進而形成對環(huán)境抗性極強的BF系統(tǒng)。這類分子被稱為自誘導物(autoinducer,AI),AI通?？杀环譃槿箢?自誘導子-2(autoinducer-2,AI-2)、N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acryl homoserine lactones,AHLs)和自誘導肽(autoinducing peptide,AIP)。AI-2是一種存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的信號分子,其可以實現(xiàn)細菌的種間交流,促進混合菌BF的形成[34]。AHLs是存在于大多數(shù)革蘭氏陰性菌的信號分子,其分子結(jié)構(gòu)主要是由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯環(huán)外加一個含4～18個碳的酰基側(cè)鏈構(gòu)成[35],這是一類水溶性、膜透過性分子,可自由出入細胞。被修飾后的寡肽分子AIP是革蘭氏陽性菌的主要信號分子[36],其氨基酸數(shù)量通常為5～17個,氨基酸側(cè)鏈一般含有異戊烯,硫內(nèi)酯環(huán)等修飾基因[37],但在不同細菌中產(chǎn)生的AIP信號分子,它的大小和結(jié)構(gòu)略有差異。本節(jié)主要從AI-2、AHLs 和AIP這3個研究的較為徹底的QS信號分子為例,闡述其參與調(diào)控細菌BF形成的機制。

2.2.1 AI-2的形成及表達

自誘導子-2也就是呋喃硼酸二酯(furanosyl borate diester, AI-2),是甲基循環(huán)中的前產(chǎn)物,其產(chǎn)生依賴于S-核糖同型半胱氨酸酶 (S-ribose homocysteinase, LuxS)蛋白。其合成過程中為,蛋氨酸(methione,MET)結(jié)合ATP在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)作用下生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM),SAM主要作為甲基供體,其在轉(zhuǎn)甲基酶作用下產(chǎn)生的中間產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosine homocysteine, SAH)被S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosine homocysteine nucleosidase, SAHN)水解成S-核糖同型半胱氨酸(S-ribose homocysteine, SRH)和腺嘌呤;LuxS蛋白催化SRH裂解成4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)和同型半胱氨酸(homocysteine,HCY),繼而DPD與硼酸結(jié)合產(chǎn)生高活性的AI-2并通過自由擴散轉(zhuǎn)運至細胞外,而HCY可接受甲基,繼續(xù)參與SAM的循環(huán)[38]。在所有的細菌中,幾乎都存在以AI-2為信號分子的群體感應系統(tǒng);在細菌各自的生理活動過程,不僅參與自身蛋白表達,也積極參與和其他細菌之間的信息交流,進而形成共同的群體表達,例如形成BF、產(chǎn)生多種不同的毒力因子等。

圖3 AI-2合成過程Fig.3 The AI-2 synthesis process

2.2.2 AHLs的形成及表達

AHLs的表達是由信號分子合成酶LuxI族蛋白和AHLs受體LuxR類結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活蛋白組成;LuxI蛋白為AHLs的合成酶,通常SAM的高半胱氨酸基團被?；?酰基化載體蛋白(acyl-acylated carrier proteins,acyl-ACP)上的?；鶄?cè)鏈結(jié)合,產(chǎn)生具有特異性的酰化高絲氨酸內(nèi)酯(homoserine lactone,HSL)分子,再內(nèi)酯化就形成了AHLs[39]。LuxR類蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域組成,分別是由N端負責識別并結(jié)合?；呓z酸內(nèi)酯(acyl homosilkolactone,Acyl-HSL)的結(jié)構(gòu)域和C端包含一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)結(jié)構(gòu)、并負責DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄激活功能的結(jié)構(gòu)域[40]。隨著細菌密度的不斷增加,AHLs合成后分泌到胞外,且當其濃度隨著細菌細胞密度的提高而不斷增加,達到一定閾值時,能被LuxR蛋白所感知并結(jié)合,形成LuxI-LuxR蛋白復合體,從而調(diào)控特定基因的表達,主要包括生物被膜的形成和毒力因子的釋放[41]。

革蘭氏陰性菌中除了典型的LuxI/LuxR型的QS系統(tǒng)外,還根據(jù)AHLs?；鶄?cè)鏈的排列不一致,分為Lasl/LasR和Abal/AbaR型等QS系統(tǒng),也都分別調(diào)控細菌的生物被膜和毒力因子的形成[42]。例如,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有Lasl/LasR和RhlR/Rhll兩個體系的群體感應系統(tǒng);鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)具有Abal/AbaR為體系的群體感應系統(tǒng)。兩者的研究表明在不同的細菌中,盡管具有調(diào)節(jié)蛋白和與它相結(jié)合蛋白功能的物質(zhì)都大致相同,但在具體的某種菌體內(nèi),調(diào)節(jié)系統(tǒng)都根據(jù)其自身性質(zhì)和具體環(huán)境條件而較為唯一。

2.2.3 AIP的形成及表達

AIP是由細胞中的核糖體合成的無活性的前體肽,在向細胞外輸出過程中經(jīng)過處理和修飾,經(jīng)過修飾的前體肽由ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter protein, ABCTP)輸出,并通過蛋白水解去除其前序列來進行激活[43]。當AIP的濃度隨細菌增長到一定閾值時,位于細胞膜上的AIP信號識別系統(tǒng)識別AIP并與之結(jié)合后,能夠進行自磷酸化,并激活細胞膜上的雙組分磷酸激酶系統(tǒng)(two-component phosphokinase system,TCS),磷酸化后的受體蛋白能與DNA特定靶位點相結(jié)合,兩者結(jié)合后使組氨酸蛋白激酶被激活從而調(diào)控QS相關基因的表達[44];細菌BF的生成并不僅僅是由單一調(diào)控機制而決定,還會與其他機制相結(jié)合來表達此種生理性狀。同時,因為不同細菌的AIP分子質(zhì)量不同、結(jié)構(gòu)不同,所以也會展示出不同的表達性,這就導致AIP信號分子只能用于細菌的種內(nèi)交流。

2.2.4 VP中QS系統(tǒng)及其表達

在VP中,有3種不同類型的QS系統(tǒng):利用CAI-1自我誘導的CqsA/S系統(tǒng),CqsS為感應信號分子;利用AI-2自誘導因子,由LuxS合成信號分子,由LuxP/Q為感應信號分子;利用HAI-1自動誘導LuxM系統(tǒng),由LuxN為感應信號分子[45]。在VP中,自誘導因子產(chǎn)生后,擴散穿過細胞膜再與膜上的受體蛋白結(jié)合,且AphA和OpaR蛋白是VP中群體感應2種主要調(diào)節(jié)因子,它們分別在低細胞密度(low cell density,LCD)和高細胞密度(high cell density,HCD)下大量產(chǎn)生和作用。當VP在低細胞密度中生長時,因與膜受體蛋白結(jié)合的自誘導因子濃度太低,受體蛋白作為激酶磷酸化磷酸轉(zhuǎn)移蛋白LuxU, LuxU將磷酸基團轉(zhuǎn)移到調(diào)控因子LuxO上,磷酸化的LuxO(LuxO-P)促進群體調(diào)節(jié)RNA(quorum regulatory RNAs,Qrr sRNA)的轉(zhuǎn)錄[46]。在LCD中,轉(zhuǎn)錄后的Qrr sRNA通過與aphA的mRNA堿基進行互補配對,促進轉(zhuǎn)錄因子AphA的翻譯,并與AphA一起抑制OpaR的翻譯,在此時期,AphA處于最高水平,OpaR處于最低水平;當VP在高細胞密度生長時,受體蛋白結(jié)合自動誘導劑轉(zhuǎn)換為磷酸酶,調(diào)節(jié)回路中的磷酸鹽使LuxO去磷酸化,促使Qrr sRNA不再表達,此時OpaR高表達,而AphA的表達受到抑制,OpaR開始積累并抑制aphA、opaR以及BF的相關基因的轉(zhuǎn)錄[46]。當所有的信號分子濃度達到穩(wěn)定時,群體感應開始結(jié)束,這也是VP從群體感應開始表達到結(jié)束的整個階段。跟絕大多數(shù)的細菌一樣,完成了從前期信號分子開始分泌,到感應期的基因進行表達,最后在到結(jié)束期的整個階段。

BF的形成是一個受多因素影響的過程。WANG等[47]研究表明BF的形成需要AphA;AphA屬于有翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子,其活性蛋白為二聚體結(jié)構(gòu),并具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,可以促進BF基因和毒力基因的轉(zhuǎn)錄,導致BF的形成。在ZHANG等[45]的研究中,OpaR通過降低細胞內(nèi)c-di-GMP的濃度來抑制野生型VP RIMD2210633菌株形成生物被膜,其主要是OpaR通過對編碼為GGDEF或EAL結(jié)構(gòu)域蛋白7個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來直接影響細菌內(nèi)c-di-GMP濃度的變化來影響B(tài)F的形成。雖然證實了AphA會促進BF的形成,但同時AphA會抑制MfqABC操縱子的轉(zhuǎn)錄,MfqABC是細胞膜融合轉(zhuǎn)運蛋白,也是一種促進BF發(fā)育的膜融合轉(zhuǎn)運蛋白;相反的是,OpaR卻會與MfqABC蛋白結(jié)合,增強其轉(zhuǎn)錄[48]。在VP的QS系統(tǒng)中,它會與c-di-GMP這個調(diào)控因素相結(jié)合,共同參與BF的生成。

圖4 副溶血性弧菌群體感應系統(tǒng)Fig.4 V.parahaemolyticus quorum sensing system

研究表明,越來越多的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)S系統(tǒng)進行干涉,抑制其BF的形成,例如:槲皮素[49]、青霉酸[50]和溴化噻吩酮化合物[51]可以提前對QS系統(tǒng)進行干預。

總之,VP的QS系統(tǒng)是一個十分復雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡,在毒力基因和BF基因轉(zhuǎn)錄之間起著非常重要的作用。該調(diào)控系統(tǒng)的復雜性和所需大量不同轉(zhuǎn)運蛋白是整合大量信號分子、并進化出最適合細菌生存條件所必需的。

2.3 雙組分系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的形成

2.3.1 TCS的組成及表達

雙組分系統(tǒng)(two-component system,TCS)是在所有生物中普遍存在的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。該系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中,后來的研究者發(fā)現(xiàn)在所有已測序的細菌基因組中幾乎都有TCS。TCS主要由2種蛋白組成:接受外部信號刺激的傳感器蛋白組氨酸激酶蛋白(histidine protein kinase,HK)和調(diào)控基因表達的響應調(diào)節(jié)蛋白(response regulator,RR),表明了這2種蛋白與BF形成的相關性、重要性。

HK是一個跨膜感應蛋白,是由2個亞基組成的同型二聚體的膜蛋白,每個亞基包含一個ATP結(jié)合的催化結(jié)構(gòu)域,一個二聚體結(jié)構(gòu)域和一個組氨酸磷酸化位點,且每個組氨酸磷酸化位點嵌入二聚體結(jié)構(gòu)域內(nèi);RR是胞內(nèi)蛋白,含有保守的N端接收器結(jié)構(gòu)域和C端可變的效應器結(jié)構(gòu)域。接收器結(jié)構(gòu)域中有一個保守的天冬氨酸(Asp)磷酸化位點,催化其同源組胺酸激酶的磷酸轉(zhuǎn)移,進而引起本身的構(gòu)象變化[52]。當細胞外刺激信號被HK接收時,激活自身和ATP結(jié)合部位,并將ATP轉(zhuǎn)化為ADP,然后ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到二聚體功能區(qū),與組氨酸結(jié)合,并在組氨酸殘基處發(fā)生自磷酸化反應,然后磷酸化的HK基團轉(zhuǎn)移至RR的N端處的天冬氨酸殘基位點處,于是磷酸化的RR被激活,暴露出DNA結(jié)合位點,再與靶細胞基因的啟動子序列進行特異性結(jié)合,從而調(diào)控特定基因的表達和蛋白的轉(zhuǎn)錄和合成[53]。同時,需要注意的是,不同細菌種類的HK和RR不同。例如,在銅綠假單胞菌中,目前鑒定出了60多種TCS,而GacS(HK)/GaxA(RR)是研究的最為深入的,同時也是控制BF形成的關鍵因素之一[54];在大腸桿菌中,KdpD(HK)/KdpE(RR)雙組分系統(tǒng)響應K+的刺激,進而調(diào)控生物被膜、細菌毒力等基因的表達[55]?？梢钥闯?不同細菌體內(nèi)的各種應答蛋白并不相同。

研究表明,一些化合物質(zhì)能夠抑制雙組分系統(tǒng)的表達,例如傳感器激酶的抑制劑噻吩并吡啶化合物,它可以干擾TCS系統(tǒng)自磷酸化和磷酸轉(zhuǎn)移反應[56];調(diào)節(jié)蛋白的抑制劑石膽酸,能夠干擾TCS系統(tǒng)磷酸化作用或阻止信號與靶DNA結(jié)合[57]。但此2種物質(zhì)應用面較為局限,只適用于金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌和幽門螺旋桿菌,本身也都具有一定的毒性,不可大規(guī)模使用在食品行業(yè)中。

2.3.2 VP中TCS系統(tǒng)及其表達

在VP中,TCS系統(tǒng)中的EvnZ(HK)/OmpR(RR)蛋白調(diào)控生物被膜的形成[58]。當環(huán)境滲透壓發(fā)生顯著變化時,EvnZ肽段C端的His消耗一個ATP,發(fā)生自磷酸化(其中His243是EvnZ自磷酸化點),將磷酸基團傳遞給細胞內(nèi)的OmpR上的Asp殘基(Asp55是磷酸化轉(zhuǎn)移的受體位點),激活OmpR磷酸化產(chǎn)生OmpR-R,從而調(diào)控膜孔蛋白OmpF和OmpC的表達來應對環(huán)境滲透強度的變化,進一步參與生物被膜形成的調(diào)控[59]。張藝蓓[60]通過EvnZ/OmpR對副溶血性弧菌毒力因子的調(diào)控實驗也驗證了EvnZ/OmpR會促進VP中BF的形成。但是否在該細菌中還有其他不同的HK和RR蛋白,還值得繼續(xù)探索。

3 總結(jié)

VP本身作為一種食源性致病菌,具有較強的致病性,而當VP形成生物被膜以后,其抗性和毒性也會不斷增加。綜上所述,VP生物被膜的形成機制是一個極其復雜的過程,涉及多因素的獨自參與、共同參與、直接參與或間接參與;QS系統(tǒng)會與c-di-GMP相結(jié)合,共同作用于生物被膜的生成,同時TCS系統(tǒng)與c-di-GMP和QS之間也存在著一些相同的功能。信使分子c-di-GMP對BF的形成有著核心調(diào)控作用,但是否還有效應蛋白能夠參與調(diào)控形成BF的生物行為還需進一步研究。大多文獻都探討了c-di-GMP和QS對BF的形成的重要性,但由于環(huán)境中微生物的多樣性、復雜性及微生物的種間交流,仍需要對TCS如何影響B(tài)F的形成進行更深入的研究,有助于探究抑制生物被膜的形成的方法,為食品生產(chǎn)提供安全指導,為人民健康生活提供有力保障。