王小喬,李堅,許曉輝,石曉峰,2,3*,吳福祥,張生萍*,邵長春,張虹艷,潘秀麗,李赟

1(蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院/國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品中農(nóng)藥獸藥殘留監(jiān)控),甘肅 蘭州,730050) 2(甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,甘肅 蘭州,730050)3(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,甘肅 蘭州,730000)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是一個不斷增長的全球性行業(yè),預(yù)計2030年以后全球產(chǎn)量將達到2.02億t。雖然針對水產(chǎn)養(yǎng)殖、運輸中獸藥的合理利用有相關(guān)的管控和監(jiān)管措施,但依然存在一些影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的外源性風(fēng)險因子[1-3],例如在水產(chǎn)運輸中苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的違法使用。苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥具有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能,主要用于焦慮、鎮(zhèn)靜催眠,在水產(chǎn)運輸過程中可以降低新鮮活魚對外界的感知能力,減輕魚體的環(huán)境壓力,降低新陳代謝,保證其經(jīng)過運輸后仍然鮮活,但是鎮(zhèn)靜催眠藥在魚體內(nèi)的殘留可通過食物鏈傳遞給人類,人類食用超過一定劑量,會引起嗜睡疲乏、動作失調(diào)等,嚴重者還可能出現(xiàn)心律失常、昏迷等癥狀[4-5]。苯二氮卓類大多為1,4-苯并二氮卓的衍生物,包括咪達唑侖、艾司唑侖、硝西泮、阿普唑侖、氯硝西泮、三唑侖、地西泮等20余種物質(zhì),其中最常見的是地西泮,為獸藥典明確禁止在飼料和動物飲水中使用的獸藥,GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中將其列入不得在動物性源食品中檢出的獸藥,國家市場監(jiān)管部門也將地西泮納入風(fēng)險監(jiān)測項目或者監(jiān)督抽查項目。

有關(guān)苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥檢測的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)有SN/T 2113—2008《進出口動物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量的檢測方法》、GB 29697—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中地西泮和安眠酮多殘留的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》、SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》等。其中,前2項標(biāo)準(zhǔn)分別適用于肉類、腎臟中氯丙嗪和地西泮藥物殘留量的測定和豬的肌肉組織中地西泮和安眠酮殘留量的檢測,沒有涵蓋水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜催眠藥的檢測。依據(jù)國家市場監(jiān)管部門發(fā)布的《食品安全監(jiān)督抽檢實施細則(2023年版)》,國家水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃中的地西泮檢測選用SN/T 3235—2012標(biāo)準(zhǔn)。目前尚未見水產(chǎn)品中除地西泮外的其他苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑檢測的國家法定標(biāo)準(zhǔn),文獻報道的水產(chǎn)品中苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑檢測方法[6-14],其樣品前處理方法都比較繁瑣,不利于大樣本量的快速檢測。

超濾型高脂基質(zhì)凈化柱(multiplug filtration clean-up-QuEChERS,MPFC-QuEChERS)是一種基于傳統(tǒng)QuEChERS方法發(fā)展起來的操作更簡單、更有效、更經(jīng)濟的前處理方法,其采用多壁碳納米管和硫酸鎂為凈化材料,并且在凈化過程中不與目標(biāo)物發(fā)生作用,尤其改善部分平面結(jié)構(gòu)藥物的吸附問題,直接濾過凈化液就能夠很好去除基質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪等,其結(jié)合了QuEChERS方法和固相萃取(solid phase extraction,SPE)方法的優(yōu)點,相比傳統(tǒng)SPE和固相萃取,簡化了萃取凈化步驟,避免因溶劑轉(zhuǎn)移所帶來的結(jié)果損失,其凈化使用步驟是:在MPFC-QuEChERS柱下端套上有機濾頭,然后吸取1 mL提取液于凈化柱中,慢慢推送推桿,使凈化液一滴一滴流入進樣瓶,其使用過程見圖1。為了克服了水產(chǎn)品中苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑檢測傳統(tǒng)QuEChERS前處理方法的缺點,本研究的樣品采用乙腈和獸藥殘留專用萃取鹽包(內(nèi)含1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉)提取,提取液通過MPFC-QuEChERS凈化,采用超高效液相色譜-三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)建立了同時測定魚肉中7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥(咪達唑侖、艾司唑侖、硝西泮、阿普唑侖、氯硝西泮、三唑侖、地西泮)的分析方法,希冀為水產(chǎn)品中苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑的檢測提供參考。

圖1 MPFC-QuEChERS凈化流程Fig.1 Purification of MPFC-QuEChERS

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品鯽魚、鱸魚為市售產(chǎn)品,陽性供試樣品為自制。

標(biāo)準(zhǔn)品咪達唑侖、艾司唑侖、硝西泮、阿普唑侖、氯硝西泮、三唑侖、地西泮均購自中國食品藥品檢定研究院,具體信息見表1。甲醇、乙腈,色譜純,德國默克公司;乙酸銨、甲酸,色譜純,東京化成工業(yè)株式會社;檸檬酸·一水、磷酸氫二鈉·十二水、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)·二水、氫氧化鈉均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水,屈臣氏有限公司。MPFC-QuEChERS高脂基質(zhì)凈化柱(貨號:LM806-FC-723),北京綠綿科技有限公司;Agilent Bond Elut QuEChERS獸藥殘留專用萃取鹽包(內(nèi)含1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉),美國安捷倫有限公司;尼龍微孔濾膜(13 mm,0.22 μm),杭州Anow Microfiltration有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 Infinity液相色譜-6460C三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(配備安捷倫噴射流電噴霧離子源),美國安捷倫有限公司;MS105DU型電子天平,瑞士Mettler Toled有限公司;IKA振蕩器,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;Vortex-genie2渦旋儀,美國Scientific公司;5810R離心機,德國艾本德公司;SB-800 DT超聲波清洗機,寧波新芝股份有限公司。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 1 Information of standard substances

1.3 實驗方法

1.3.1 Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液的配制

取檸檬酸·一水12.9 g、磷酸氫二鈉·十二水10.9 g、乙二胺四乙酸二鈉·二水39.2 g,加水900 mL攪拌溶解,用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5.06,加水補足1 000 mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液:取咪達唑侖、艾司唑侖、硝西泮、阿普唑侖、氯硝西泮、三唑侖、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品各適量(約10 mg),精密稱定,于10 mL棕色容量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度均約為1 mg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,置 4 ℃冷藏備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品中間液:準(zhǔn)確量取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.025 mL,于25 mL棕色容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制成濃度均約為 1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液,置 4 ℃冷藏備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品使用液:精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶,用乙腈稀釋至刻度,配制成濃度均約為 100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液,置 4 ℃冷藏備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制:分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液適量,用空白基質(zhì)溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的系列溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

取魚肉適量,絞碎,均質(zhì)后,精確稱取5 g,置50 mL 具塞離心管中,加2 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液,充分渦旋,靜置20 min,加入乙腈10 mL,充分渦旋,再加入Agilent Bond Elut QuEChERS獸藥殘留專用萃取鹽包(含1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉),渦旋振蕩4 min,在4 ℃、3 900 r/min 條件下離心15 min,移取上清液于MPFC-QuEChERS高脂基質(zhì)凈化柱(下端安裝0.22 μm有機濾膜的濾頭)里面,用推桿慢慢推入,過濾至進樣小瓶中,即得供試品溶液。同法制備空白基質(zhì)溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱:Brownlee SPP C18柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);流動相:含0.1%(體積分數(shù))甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液(A)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B),梯度洗脫,程序見表2;流速:0.4 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μL。

表2 梯度洗脫程序Table 2 The procedure of gradient elution

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源:安捷倫噴射流電噴霧離子源(AJS ESI);離子極性:正離子;檢測模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM);干燥氣流速:6 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;毛細管電壓:4 000 V;鞘氣流速:10 L/min;鞘氣溫度:350 ℃;霧化器壓力:45 psi;7種鎮(zhèn)靜催眠藥的質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表3 7種鎮(zhèn)靜催眠藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 MRM parameters of seven kinds of sedative drugs

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件選擇

本研究測試的7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥(咪達唑侖、艾司唑侖、硝西泮、阿普唑侖、氯硝西泮、三唑侖、地西泮),化學(xué)性質(zhì)偏有機弱堿性,屬于中等極性化合物。本文選取空白魚肉樣品,采取加標(biāo)回收的方法,按1.3.3節(jié)方法前處理,分別考察了乙腈和甲醇為提取溶劑時的提取效果,結(jié)果顯示,乙腈為提取溶劑時,乙腈和水在鹽包作用下,出現(xiàn)分層,有機層溶液澄清(圖2-A);甲醇為提取溶劑時,甲醇和水在鹽包作用下,未出現(xiàn)分層,有機層溶液略顯渾濁(圖2-B),且乙腈為提取溶劑的回收率高于甲醇,因此選乙腈為提取溶劑。在萃取過程中,加入適量Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液分散樣品,后續(xù)通過加入Agilent Bond Elut QuEChERS獸藥殘留專用萃取鹽包,在低溫高速離心的條件下,水層和有機層有效分層,目標(biāo)化合物富集在有機層乙腈中。目前,對于凈化方法的選擇上,最傳統(tǒng)的是QuEChERS法和固相萃取柱法,其凈化填料幾乎都是乙二胺-N-丙基硅烷、C18、硫酸鎂等,只是填料比例上有差別,而且傳統(tǒng)的QuEChERS凈化,只適用于基質(zhì)簡單的樣品,過程繁瑣,無法適應(yīng)短時間內(nèi)快速前處理大量檢品的需求,而MPFC-QuEChERS高脂基質(zhì)凈化柱的填料為多壁碳納米管和硫酸鎂,可有效去除水溶性和脂溶性雜質(zhì),適用于高脂基質(zhì)樣品的濾過式凈化,與傳統(tǒng)的QuEChERS和固相萃取柱凈化相比,MPFC-QuEChERS可以在1 min 內(nèi)完成凈化,無需渦旋、離心、淋洗、洗脫和濃縮步驟,極大簡化了前處理過程,提高了檢測效率,而且能夠保證凈化效果。同時,本實驗采用的魚肉樣品就屬于高脂類樣品,因此,選擇以MPFC-QuEChERS凈化柱對提取液進行凈化。

圖2 乙腈和甲醇對目標(biāo)物的提取效果Fig.2 Extraction effect to target substance of acetonitrile and methanol

2.2 色譜條件優(yōu)化

本實驗選擇乙腈作為流動相的有機相,分別考察了乙腈-水、乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的水、含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液等不同組合的流動相體系,以各目標(biāo)檢測物的峰形、分離度及質(zhì)譜響應(yīng)為判斷指標(biāo),優(yōu)選最佳流動相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)流動相體系為含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液時,各目標(biāo)檢測物的峰形、分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)較好,故以其為樣品分析的流動相體系。7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的總離子流圖及色譜圖見圖3。

A-總離子流圖;B-色譜圖圖3 七種鎮(zhèn)靜催眠藥的總離子流圖及色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram and extraction chromatogram of seven kinds of sedative drugs

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在不安裝色譜柱的狀態(tài)運行UPLC-MS/MS聯(lián)用儀,在連接色譜儀與質(zhì)譜儀的二通閥部分,分別進樣質(zhì)量濃度均為50 ng/mL的各單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在正離子模式下采用一級質(zhì)譜掃描Scan,確定化合物的母離子,均得到穩(wěn)定的[M+H]+離子,然后設(shè)置不同的碎裂電壓,采用SIM掃描模式檢測,比較各個碎裂電壓下目標(biāo)峰的響應(yīng)值,以響應(yīng)值最高的碎裂電壓為最佳碎裂電壓;在優(yōu)化的最佳碎裂電壓下,對母離子進行二級Product Ion質(zhì)譜掃描,以離子豐度最高的2個碎片離子分別作為定性與定量離子,其中離子豐度較高的離子為定量離子;最后在最佳碎裂電壓下,分別給定性離子和定量離子設(shè)置不同的碰撞能量,以MRM掃描模式掃描,以離子峰的響應(yīng)值最高的為最佳碰撞能量,建立MRM采集方法,獲得的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表3,獲得的二級定性定量碎片離子見圖4。

圖4 二級定性定量碎片離子圖Fig.4 Secondary fragment ion of qualitative and quantitative

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

建立基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量,以測得的定量離子響應(yīng)值的峰面積為縱坐標(biāo),各單一標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,ng/mL),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥濃度在0～20 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,空白樣品加標(biāo)溶液進樣測定,以3倍和10倍信噪比時的濃度作為檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ),分別為0.25～2.0 μg/kg和1.0～4.0 μg/kg,見表4。

表4 七種鎮(zhèn)靜劑的線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 4 Linear relationship, LOD and LOQ of seven kinds of sedative drugs

2.5 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

對空白樣品進行加標(biāo)回收實驗,分別添加低(2.0 μg/kg)、中(4.0 μg/kg)、高(20 μg/kg)3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,每個加標(biāo)濃度設(shè)3個平行樣,照供試品溶液制備方法處理,按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)色譜和質(zhì)譜條件進樣2 μL測定其質(zhì)量濃度,計算回收率。得到7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為83.8%～114.2%和1.1%～8.7%,見表5。

表5 七種鎮(zhèn)靜劑的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 5 Recovery and RSD of seven kinds of sedative drugs (n=3)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜質(zhì)聯(lián)用適用于復(fù)雜樣品中微量組分的測定,往往樣品基質(zhì)中非揮發(fā)性組分會影響到待測物的離子化效率,干擾和影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實驗采用空白基質(zhì)溶液與乙腈配制質(zhì)量濃度均為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在相同的色譜質(zhì)譜條件下進樣分析以兩者的質(zhì)譜響應(yīng)的峰面積比值的百分數(shù)來表示基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME),若ME>100%,則存在基質(zhì)增強效應(yīng);若ME<80%,則為抑制效應(yīng);若ME為80%～100%,則不存在基質(zhì)效應(yīng)[15-16]。結(jié)果見圖5,結(jié)果顯示,咪達唑侖、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖表現(xiàn)為基質(zhì)弱效應(yīng),硝西泮、氯硝西泮、地西泮存在基質(zhì)抑制效應(yīng);為了消除基質(zhì)效應(yīng),采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正。

2.7 與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)比較

我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中,測定水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑地西泮的前處理方法所用提取溶劑為1%氨水-乙腈,萃取鹽包為無水硫酸鈉,分散固相萃取的吸附劑為100 mg乙二胺-N-丙基硅烷、40 mg C18和600 mg 無水硫酸鎂,經(jīng)過凈化的提取液需要進一步濃縮,測定低限為0.5 μg/kg。而本研究采用乙腈作為提取溶劑,沒有使用刺激性強的氨水,萃取鹽包為氯化鈉和硫酸鈉組合,采用MPFC-QuEChERS高脂基質(zhì)凈化柱一步凈化,無繁瑣的前處理步驟,提高了檢測效率,測定的7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥LOD為0.25～2.0 μg/kg,其中地西泮LOD為0.50 μg/kg,與國標(biāo)一致。相比國標(biāo)本方法涵蓋了除地西泮以外的6種常見苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥,可以有效防范鉆國標(biāo)檢測項目的空白。

圖5 七種鎮(zhèn)靜劑的基質(zhì)效應(yīng)Fig.5 Matrix effect of seven kinds of sedative drugs

2.8 實際樣品測定

在水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié),根據(jù)概率分布論,檢出陽性樣品存在一定概率,而且要保證足夠的樣本量。本研究采用自養(yǎng)魚飼喂加入含地西泮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的飼料,經(jīng)過一定時間的吸收、代謝之后,應(yīng)用本方法測定魚肉中殘留的地西泮,與應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 3235—2012 《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的測定值幾乎相近,其總離子流圖見圖6。

圖6 實際樣品的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of practical sample

3 結(jié)論

本研究以魚肉為樣品基質(zhì),采用超濾型高脂基質(zhì)凈化柱(MPFC-QuEChERS)結(jié)合UPLC-MS/MS建立了一種同時測定7種苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的方法。該方法以乙腈為提取溶劑,提取液經(jīng)Agilent Bond Elut QuEChERS獸藥殘留專用萃取鹽包萃取和MPFC-QuEChERS凈化柱凈化,相較以固相萃取小柱或者分散固相萃取凈化的傳統(tǒng)的QuEChERS技術(shù),操作更簡便、更節(jié)省時間,有效提高了檢測效率,適用于魚肉中常見苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的檢測。