詹勝群,葛城,劉金梅,丁玉珍,周榮杰,劉鋼,張浩,周鈞

(澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司,湖南 長沙,410200)

膽堿(choline),在自然界存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式,其中結(jié)合態(tài)有如乙酰膽堿、與磷脂結(jié)合成的磷脂酰膽堿、鞘磷脂等。膽堿具有保障神經(jīng)信息傳遞、促進(jìn)腦發(fā)育和脂肪代謝等作用[1-3],最新研究表明,膽堿能夠保護(hù)和補(bǔ)償細(xì)胞因子、與藥物組合幫助治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥、與丁酸鹽組合有益地調(diào)節(jié)腸道微生物組等[4-5]。左旋肉堿(L-carnitine)也存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式,具有促進(jìn)代謝、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、清除自由基等作用[6-8],最新研究表明,左旋肉堿在治療新生兒難治性線粒體心肌病、與其他藥物協(xié)同抗骨質(zhì)疏松并改善藥物毒性等方面作用巨大[9-10]。成人所需的膽堿和左旋肉堿可以自身合成,而嬰幼兒由于身體發(fā)育未全,合成有限,所以在嬰配奶粉中普遍將膽堿和左旋肉堿作為可選擇性營養(yǎng)強(qiáng)化劑進(jìn)行添加,保障嬰幼兒生長發(fā)育所需[11-12],故嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿的準(zhǔn)確測定具有重要意義。目前,國內(nèi)膽堿的最新標(biāo)準(zhǔn)為GB 5413.20—2022,該標(biāo)準(zhǔn)中第一、二、三法分別為酶比色法、離子色譜法和LC-MS/MS;左旋肉堿的標(biāo)準(zhǔn)為GB 29989—2013,標(biāo)準(zhǔn)中方法為酶比色法;即國內(nèi)并無色譜類標(biāo)準(zhǔn)方法檢測左旋肉堿,也無標(biāo)準(zhǔn)方法可同時(shí)檢測膽堿與左旋肉堿。故如若能建立同時(shí)檢測該2種物質(zhì)的方法,將顯著提升檢測效率并降低成本。

儀器法是大多數(shù)檢測方法的發(fā)展趨勢,特別是LC-MS/MS法,因其具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)和樣品定性不依賴保留時(shí)間的特點(diǎn),在諸多文獻(xiàn)方法中研究廣泛。王艷等[7]、劉玲君等[13]、劉艷明等[14]采用LC-MS/MS法測定了奶粉中的左旋肉堿,但未對(duì)膽堿進(jìn)行監(jiān)測;詹越城等[11]、唐吉旺等[15]的方法雖然能同時(shí)檢測膽堿、左旋肉堿,但方法采用外標(biāo)法定量,對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)等可能引起的損失暫未提及;李麗萍等[12]、李秀英等[1]、黃金鳳等[16]、黃燾等[17]的方法雖然都采用了同位素內(nèi)標(biāo)法,但李麗萍等[12]、李秀英等[1]的方法中內(nèi)標(biāo)的加入在水解之后,且前者還需要用到超濾管進(jìn)行冷凍離心凈化、后者需用微波消解儀消解,處理過程較為繁瑣的同時(shí)也可能造成目標(biāo)物質(zhì)的損失;黃金鳳等[16]的方法則稱樣量過小(0.2 g),其前處理采用亞鐵氰化鉀/乙酸鋅進(jìn)行凈化沉淀,但詹越城等[11]在研究中表明亞鐵氰化鉀/乙酸鋅進(jìn)行沉淀會(huì)導(dǎo)致回收率損失;黃燾等[17]的方法則在凈化上雖然考慮全面,但前處理無水解、消解等過程,這可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合態(tài)膽堿、左旋肉堿損失,最終使得測定結(jié)果偏低。因此,在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上,充分考察前處理過程及色譜、質(zhì)譜條件,以期建立一個(gè)完善的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)來同時(shí)測定嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸銨、甲酸(MS級(jí)),德國CNW公司;鹽酸(優(yōu)級(jí)純),國藥試劑;氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純),恒興試劑。標(biāo)準(zhǔn)品:膽堿酒石酸氫鹽(純度99.1%),上海安譜;左旋肉堿(純度98.2%),上海安譜;膽堿-D4(純度98.6%),加拿大TRC公司;左旋肉堿-D3(純度98.5%),加拿大CDN公司。質(zhì)控樣:嬰幼配方乳粉膽堿左旋肉堿?；撬峒〈假|(zhì)控樣(QC-IP-707),中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Endura高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI源),美國Thermo Fisher公司;Milli-Q超純水儀,美國Millipore公司;HWS-28電熱恒溫水浴鍋,上海一恒公司;ME204E電子天平、FE28 pH計(jì),梅特勒托利多公司;舒美牌KQ-500DE超聲波恒溫水浴振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司;ACQUITY UPLC HSS C18 SB柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),美國Waters公司;0.22 μm尼龍濾膜,上海安譜公司;2.5 mL聚丙烯注射器,湖南平安醫(yī)械科技有限公司;聚乙烯巴斯德塑料吸管(3 mL,160 mm),德國CNW公司。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相:A:甲酸銨水溶液[10 mmol/L,甲酸調(diào)pH值至(5.0±0.1)];B:乙腈;流速:0.5 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI+;鞘氣:50 Arb;輔助氣:5 Arb;吹掃氣:0 Arb;碰撞氣:氬氣(1.5 mtor);噴霧電壓:4 500 V;脫溶劑溫度:350 ℃;離子傳輸管溫度:300 ℃;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(multi reaction monitoring,MRM)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

a)膽堿、膽堿-D4、左旋肉堿及左旋肉堿-D3儲(chǔ)備溶液:質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL,均用10 mmol/L甲酸銨水溶液配制;b)膽堿、左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)混合中間液:膽堿、左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)混合中間液質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL;膽堿-D4、左旋肉堿-D3內(nèi)標(biāo)混合中間液質(zhì)量濃度分別為20 μg/mL,均用10 mmol/L甲酸銨水溶液配制;c)膽堿、左旋肉堿工作溶液:用乙腈將中間液逐級(jí)稀釋、混合,配成的工作液中膽堿左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.8、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0 ng/mL,其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為50 ng/mL。臨用現(xiàn)配。

1.3.4 前處理方法

準(zhǔn)確稱取1～5 g(精確至0.001 g)試樣,用溫水溶解后,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,冷卻至室溫后用水定容,混勻。吸取1 mL樣液于100 mL燒杯中,備用。在上述燒杯中,加1 000 μg/mL的膽堿-D4、左旋肉堿-D3內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液各50 μL后,加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL,小心搖晃均勻,用保鮮膜蓋住燒杯超聲振蕩5 min。樣液在(70±2) ℃水浴中加熱2 h(每隔30 min搖勻一次)冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0～5.3,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,用水定容,混勻。然后用乙腈將定容后的樣液稀釋10倍,經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中,待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化采用蠕動(dòng)泵注射質(zhì)量濃度為1 μg/mL 左右的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。電噴霧正離子模式下,通過MRM模式優(yōu)化各個(gè)碎片離子的去簇電壓和碰撞電壓。具體的化合物碎片二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相參照GB 5413.20—2022標(biāo)準(zhǔn)中第三法進(jìn)行配制,即水相為10 mmol/L甲酸銨水溶液[甲酸調(diào)pH值至(5.0±0.1)],有機(jī)相為乙腈。水相中加入一定量的甲酸可促進(jìn)目標(biāo)化合物的電離,起到提高離子化效率的作用;乙腈與水的體系對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)效果好于甲醇與水的體系,這在一些相關(guān)文獻(xiàn)方法中有應(yīng)用[11,15]。

表2 膽堿、左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of choline, L-carnitine, and their internal standards

2.3 色譜柱的選擇

膽堿、左旋肉堿化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有強(qiáng)極性的堿性季銨基團(tuán),故選擇親水性強(qiáng)的色譜柱有助于二者的保留。HILIC色譜柱在劉玲君等[13]、劉艷明等[14]、詹越城等[11]的研究中有采用,Amide色譜柱在李麗萍等[12]、黃燾等[17]的研究中有采用,而親水性的C18色譜柱在唐吉旺等[15]、潘拾朝等[18]、高進(jìn)等[19]的研究中有采用,故本次研究選擇了這3種應(yīng)用相對(duì)較多的色譜柱進(jìn)行對(duì)比。由圖1可知,鍵合相為三鍵鍵合的酰胺柱對(duì)于膽堿和左旋肉堿的響應(yīng)最高、峰形最好;無鍵合的BEH顆粒的HILIC色譜柱保留較酰胺柱稍強(qiáng),但響應(yīng)次之,且膽堿色譜峰存在拖尾,峰形也不對(duì)稱,故該柱僅合適分離左旋肉堿;無封端的HSS C18色譜柱保留最強(qiáng),對(duì)膽堿的分離峰形也較佳,只是響應(yīng)稍差,但左旋肉堿出現(xiàn)了峰展極寬的情形,故該柱單獨(dú)分離膽堿較合適。綜合對(duì)比下,同時(shí)分離膽堿、左旋肉堿采用Amide柱最佳。

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖1 不同色譜柱對(duì)膽堿、左旋肉堿的分離效果Fig.1 Separation effect of different columns on choline and L-carnitine

2.4 柱溫的選擇

柱溫不僅影響各化合物的分配系數(shù)同時(shí)也影響傳質(zhì)速率。本次研究預(yù)設(shè)了30、35、40 ℃ 3個(gè)不同水平以考察柱溫對(duì)色譜柱分離的影響。如圖2所示,柱溫升高,膽堿和左旋肉堿的保留均減弱,膽堿出峰提前更明顯,響應(yīng)和峰形上各化合物在不同柱溫下均相差不大,但柱溫的升高能顯著降低系統(tǒng)背壓,故選擇40 ℃作為色譜柱柱溫。

2.5 流速的選擇

流速與化合物的保留、峰形、響應(yīng)以及柱壓大小密切相關(guān)。膽堿國標(biāo)方法(GB 5413.20—2022)中液質(zhì)法的梯度條件參考流速為0.3 mL/min,本次研究預(yù)設(shè)了0.4～0.7 mL/min 4個(gè)不同的流速與其對(duì)比。如圖3所示,流速增加,膽堿和膽堿-D4色譜峰出峰提前、響應(yīng)明顯增強(qiáng);左旋肉堿和左旋肉堿-D3色譜峰出峰同樣提前,但響應(yīng)上基本無區(qū)別?？紤]到膽堿的響應(yīng)應(yīng)選擇高流速,而考慮系統(tǒng)背壓和溶劑節(jié)省等因素應(yīng)選擇低流速。因本研究中化合物響應(yīng)均較好,故折中選擇0.5 mL/min流速即可。

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖2 柱溫對(duì)色譜柱分離的影響Fig.2 Effect of temperature on column separation

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖3 流速對(duì)分離的影響Fig.3 Effect of flow rate on separation

2.6 溶劑效應(yīng)

2.6.1 溶劑效應(yīng)的影響

在前述色譜柱、柱溫、流速的選擇研究中,有注意到膽堿色譜峰底部存在肩峰或緊臨的干擾峰,而左旋肉堿容易過載,即在進(jìn)樣量稍微增加時(shí)左旋肉堿色譜峰易變形(無樣品基質(zhì)情況)。如圖4-a和圖4-b所示,對(duì)于膽堿,主要的溶劑效應(yīng)是導(dǎo)致色譜峰出現(xiàn)肩峰或分叉峰。在進(jìn)樣量0.5 μL增加至1.75 μL過程中,膽堿色譜峰從肩峰變成明顯的分叉峰且2個(gè)分叉峰分離度逐漸增加,主峰位置從左側(cè)轉(zhuǎn)換至右側(cè),在進(jìn)樣量從1.75 μL繼續(xù)增加至7 μL過程中,膽堿左側(cè)小的分叉峰逐漸減小直至消失,且與右側(cè)主峰的分離度逐漸增加。對(duì)于左旋肉堿,由圖4-c和圖4-d可知主要的溶劑效應(yīng)是色譜峰發(fā)生變形或?qū)е录绶?在進(jìn)樣量從0.5 μL增加至3.0 μL過程中左旋肉堿色譜峰峰形和響應(yīng)均較好,而進(jìn)樣量增加到4.0 μL時(shí)色譜峰左側(cè)開始變寬,在5.0、7.0 μL時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯肩峰,且底部峰展寬峰形極差。由此可見,溶劑效應(yīng)與進(jìn)樣體積因素密切相關(guān),同時(shí)會(huì)因存在樣品基質(zhì)而影響加重,對(duì)于膽堿,只有當(dāng)進(jìn)樣量大于至7 μL時(shí)溶劑效應(yīng)才會(huì)消除,而對(duì)于左旋肉堿只有當(dāng)進(jìn)樣量小于4 μL時(shí)溶劑效應(yīng)才不會(huì)對(duì)峰形造成影響,而這存在矛盾,故需要在最終樣液稀釋過程中選擇合適比例的稀釋溶劑消除溶劑效應(yīng),并確定合適的進(jìn)樣量。

a-膽堿(0.5～1.75 μL);b-膽堿(1.75～7.0 μL);c-左旋肉堿(0.5～1.75 μL);d-左旋肉堿(1.75～7.0 μL)圖4 不同進(jìn)樣體積下溶劑效應(yīng)的影響Fig.4 Influence of different injection volumes on solvent effects

2.6.2 溶劑效應(yīng)的消除

由于溶劑效應(yīng)受進(jìn)樣量影響,故本次研究設(shè)置1 μL和10 μL以分別考察不同進(jìn)樣體積下稀釋溶劑對(duì)溶劑效應(yīng)的消除作用,試驗(yàn)方法為用不同體積比的乙腈/甲酸銨水溶液(10 mmol/L)將水解定容后的樣液統(tǒng)一稀釋10倍。如圖5-a和圖5-b所示,對(duì)于膽堿,當(dāng)進(jìn)樣量為1 μL時(shí),膽堿存在右側(cè)肩峰或分叉峰,隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)從0%增加至30%,右側(cè)分叉峰逐漸縮小變成肩峰,在乙腈體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加直至100%時(shí),肩峰逐漸變小直至消失;當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí),隨著乙腈體積比增加,膽堿峰型從矮胖的肩峰逐漸變?yōu)槭莞叻?在30%處峰形有一次變化),即在乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為0%、10%、50%時(shí)峰形為肩峰,且主峰從左側(cè)轉(zhuǎn)換至右側(cè),保留時(shí)間也出現(xiàn)先縮短后延長的明顯變化,直至乙腈體積分?jǐn)?shù)為70%后峰形趨于穩(wěn)定。對(duì)左旋肉堿,由圖5-c和圖5-d可知,在進(jìn)樣為1 μL時(shí),所試驗(yàn)的乙腈體積比的變化對(duì)峰形均未造成影響,而在進(jìn)樣量為10 μL時(shí),乙腈體積比的增加使得峰形從明顯的前伸峰變成瘦高峰,且峰高增加并在100%處達(dá)到最大。綜上,故選擇純乙腈作為水解樣液的稀釋液,在稀釋10倍這一情況下,稀釋后的樣液體系與初始流動(dòng)相正好一致。

2.6.3 進(jìn)樣量的確定

消除溶劑效應(yīng)影響后,對(duì)同一樣液進(jìn)樣不同體積以考察進(jìn)樣量,如圖6所示,除膽堿和膽堿內(nèi)標(biāo)在進(jìn)樣0.5～3 μL過程中保留時(shí)間變化外,大于3 μL進(jìn)樣體積后的保留時(shí)間均穩(wěn)定,且膽堿和左旋肉堿及內(nèi)標(biāo)的峰高均隨進(jìn)樣體積增加而增加,進(jìn)樣至30 μL時(shí)峰形仍對(duì)稱良好,故考慮響應(yīng)和色譜柱載量預(yù)留等因素折中選擇10 μL為進(jìn)樣體積。

2.7 水解時(shí)間對(duì)結(jié)果測定的影響

水解時(shí)間的長短主要影響結(jié)合態(tài)的膽堿和左旋肉堿的測定。在同一樣液中均加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL,70 ℃下分別水解不同的時(shí)間[15],測定結(jié)果如圖7所示,相對(duì)于水解時(shí)間為0 h,在水解0.5、1 h時(shí)測定結(jié)果明顯隨水解時(shí)間延長而增加,而在1 h之后測定結(jié)果沒有明顯增加,說明樣品中存在結(jié)合態(tài)的膽堿和左旋肉堿,且在水解1 h時(shí)結(jié)合態(tài)部分的膽堿和左旋肉堿已基本水解完畢并全部游離出來。為保證樣品充分水解,可適當(dāng)延長水解時(shí)間,可選擇2 h。

a-膽堿(進(jìn)樣1 μL);b-膽堿(進(jìn)樣10 μL);c-左旋肉堿(進(jìn)樣1 μL);d-左旋肉堿(進(jìn)樣10 μL)圖5 不同稀釋溶劑對(duì)膽堿、左旋肉堿溶劑效應(yīng)的影響Fig.5 Effect of different diluted solvents on solvent effects of choline and L-carnitine

a-不同進(jìn)樣量下膽堿的響應(yīng)和保留;b-不同進(jìn)樣量下膽堿-D4的響應(yīng)和保留;c-不同進(jìn)樣量下左旋肉堿的響應(yīng)和保留; d-不同進(jìn)樣量下左旋肉堿-D3的響應(yīng)和保留圖6 進(jìn)樣量的確定Fig.6 Determination of injection volume

2.8 pH調(diào)節(jié)對(duì)測定結(jié)果的影響

根據(jù)膽堿國標(biāo)方法(GB 5413.20—2022)中的液質(zhì)法,前處理水解后需要將pH值調(diào)節(jié)至5.0～5.3,因?yàn)樗夂笕芤簆H值依舊小于2,而酰胺柱pH值耐受范圍為2～11,故需要對(duì)樣液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。如圖8所示,對(duì)同一水解后的樣液用氫氧化鈉溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié),結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值在2～9內(nèi)對(duì)測定結(jié)果基本無影響,故pH值的調(diào)節(jié)大致調(diào)至5.0左右即可。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)與過程回收率

采用提取后添加法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和過程回收率進(jìn)行評(píng)估[20]。由于未尋得絕對(duì)空白的膽堿、左旋肉堿嬰配奶粉樣品,故采用添加膽堿、左旋肉堿同位素內(nèi)標(biāo)的方式進(jìn)行考察。在空白試劑中進(jìn)行水解前和水解后的內(nèi)標(biāo)加標(biāo),分別測定加標(biāo)后的響應(yīng)值,通過t檢驗(yàn)可判斷水解過程是否存在回收率的損失;在樣品水解后的基質(zhì)中加內(nèi)標(biāo)并與試劑空白水解后加內(nèi)標(biāo)對(duì)比,通過t檢驗(yàn)可判斷是否存在基質(zhì)效應(yīng)。由表3和表4可知,參與比較的所有數(shù)據(jù)均方差同質(zhì),過程回收率均差異不顯著,但基質(zhì)效應(yīng)檢驗(yàn)上發(fā)現(xiàn)膽堿差異極顯著,在有基質(zhì)存在的情況下膽堿的測定結(jié)果較空白中低,存在基質(zhì)抑制,故對(duì)于膽堿的測定需采用同位素內(nèi)標(biāo)法來進(jìn)行校正。

a-膽堿;b-左旋肉堿圖7 水解時(shí)間對(duì)結(jié)果測定的影響(n=2)Fig.7 Effect of hydrolysis time on result determination (n=2)

a-膽堿;b-左旋肉堿圖8 pH調(diào)節(jié)對(duì)測定結(jié)果的影響(n=2)Fig.8 Effect of pH regulation on assay results (n=2)

2.10 質(zhì)控樣和回收率的測定

通過測定膽堿、左旋肉堿的質(zhì)控樣QC-IP-707和在含有本底的牛乳基質(zhì)樣品中進(jìn)行低、中、高三水平的膽堿、左旋肉堿加標(biāo)(n=3),以驗(yàn)證方法的正確性。由表5可知,膽堿、左旋肉堿的3平行測定結(jié)果均在質(zhì)控樣特性值范圍內(nèi),且均接近特性值;由表6可知,膽堿平均回收率為96.9%,左旋肉堿平均回收率為98.0%,且膽堿、左旋肉堿各重復(fù)水平的回收率均為95%～105%,均符合GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求,說明方法正確性均良好。

表3 膽堿、左旋肉堿的加標(biāo)測試結(jié)果Table 3 Spike test results of choline and L-carnitine

表4 膽堿、左旋肉堿的基質(zhì)效應(yīng)與過程回收率的t檢驗(yàn)Table 4 T-test for matrix effects and process recovery of choline and L-carnitine

表5 膽堿、左旋肉堿外部質(zhì)控樣測試結(jié)果Table 5 Choline and L-carnitine external quality control sample test results

表6 膽堿、左旋肉堿樣品加標(biāo)結(jié)果Table 6 Sample spike results of choline and L-carnitine

2.11 線性范圍

以待測物的濃度為橫坐標(biāo)、待測物信號(hào)強(qiáng)度與其內(nèi)標(biāo)的比值為縱坐標(biāo),并以1/X為權(quán)重的加權(quán)最小二乘法對(duì)各坐標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行線性回歸擬合。結(jié)果表明,膽堿和左旋肉堿均在0.8～200 ng/mL呈良好的線性關(guān)系,線性方程分別為,膽堿:Y=0.045 58X-0.007 751,相關(guān)系數(shù)R=0.999 7;左旋肉堿:Y=0.019 95X-0.010 51,相關(guān)系數(shù)R=0.999 8。

2.12 檢出限和定量限

采用信噪比法評(píng)估檢出限和定量限。當(dāng)稱樣量為2 g時(shí),以3倍信噪比定為檢出限、10倍信噪比定為定量限,通過對(duì)膽堿、左旋肉堿樣品的不斷稀釋,在低含量水平(0.3 ng/mL)下上機(jī)分析得到信噪比數(shù)據(jù),經(jīng)計(jì)算得到膽堿、左旋肉堿定量限分別為3、0.3 mg/kg,檢出限分別為1、0.1 mg/kg。

2.13 精密度

儀器精密度:通過對(duì)一質(zhì)量濃度為0.8 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)測定(n=8),結(jié)果表明,膽堿的均值為(0.921 6±0.016 27) ng/mL,RSD為1.77%,左旋肉堿的均值為(0.955 1±0.041 68) ng/mL,RSD為4.36%。方法精密度:通過對(duì)一嬰配奶粉樣品進(jìn)行平行測定(n=9),測定結(jié)果中膽堿均值為(209.7±5.0) mg/100 g,RSD為2.37%,左旋肉堿均值為(16.2±0.4) mg/100 g,RSD為2.71%。根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求,膽堿方法精密度≤2.7%、左旋肉堿方法精密度≤3.8%,儀器精密度需均≤5.3%,由以上數(shù)據(jù)可知均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

通過對(duì)色譜柱進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)Amide柱同時(shí)分析膽堿和左旋肉堿的效果較HILIC色譜柱和親水性的C18色譜柱好,故選擇鍵合相為酰胺基的色譜柱為分析柱,同時(shí)優(yōu)化確定了最佳柱溫、流速參數(shù);在溶劑效應(yīng)考察中發(fā)現(xiàn)在樣液的溶劑比例與初始流動(dòng)相不一致時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的溶劑效應(yīng),通過試驗(yàn)不同稀釋溶劑對(duì)溶劑效應(yīng)的消除作用,發(fā)現(xiàn)在稀釋10倍的情形下用純乙腈作為水解樣液的稀釋溶劑效果最好;溶劑效應(yīng)消除后,確定10 μL體積為進(jìn)樣量。在前處理?xiàng)l件優(yōu)化過程中,對(duì)水解時(shí)長的考察發(fā)現(xiàn),水解1 h后結(jié)合態(tài)的膽堿和左旋肉堿已基本游離釋放,對(duì)pH調(diào)節(jié)的考察發(fā)現(xiàn),pH值在2～9內(nèi)對(duì)測定結(jié)果基本無影響,回收率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過程無回收率損失,基質(zhì)效應(yīng)考察發(fā)現(xiàn)膽堿存在基質(zhì)抑制,故采用同位素內(nèi)標(biāo)法來進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的校正。本次研究建立了以同位素為標(biāo)記、酸水解法為前處理、酰胺柱為分析柱的UPLC-MS/MS法,方法限值低、前處理簡單、準(zhǔn)確性高,方法驗(yàn)證各項(xiàng)參數(shù)均滿足國標(biāo)要求,適用于嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿的同時(shí)測定。