陳文林,劉沖,于學(xué)健,張露,李婷,姚粟

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)

乳酸廣泛存在于人體、動(dòng)植物、微生物的代謝過程,其分子骨架中羧基α位碳原子為不對稱碳原子,可形成L(+)型和D(-)型2種旋光異構(gòu)體。正常情況下,人體血液中乳酸主要為L-乳酸[1],其代謝成動(dòng)態(tài)平衡[2],由于人體缺乏D-乳酸脫氫酶,D-乳酸代謝較慢而易在體內(nèi)積累[3],當(dāng)D-乳酸的產(chǎn)生/吸收超過消除速率,就可能在血液中積累[4],當(dāng)血液D-乳酸濃度≥3 mmol/L時(shí),則產(chǎn)生D-乳酸中毒,臨床表現(xiàn)為精神錯(cuò)亂、嗜睡、記憶喪失、頭痛和上肢運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀[5]。乳酸代謝清除主要在肝臟及腎臟中,而嬰幼兒因其肝腎功能不成熟導(dǎo)致對D-乳酸的代謝能力更低。人體中D-乳酸的來源主要由腸道微生物代謝產(chǎn)生,如Lactobacillusacidophilus,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis等微生物均可產(chǎn)生D-乳酸[6],食物、藥物的外源性攝入[7]與丙酮醛途徑代謝[3]產(chǎn)生的D-乳酸較少,腸道菌群的組成對D-乳酸的積累有重要影響[8],研究表明D-乳酸中毒與益生菌的攝入引起的腸道微生物群的改變有關(guān),停用益生菌后癥狀得以緩解[9];并有兒童短腸綜合征患者在服用含有嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌的益生菌產(chǎn)品后,反復(fù)出現(xiàn)D-乳酸中毒癥狀,血清D-乳酸水平高達(dá)11.4 mmol/L[10]。因此嬰幼兒及腸胃消化不良人群應(yīng)該選擇適宜的益生菌。

聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)提出一些GRAS批準(zhǔn)菌株具有產(chǎn)D-乳酸的代謝活性[11],存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。WHO也對D-乳酸攝取量進(jìn)行了限制(100 mg/kg體重)。此外,CXS 72—1981《嬰兒配方奶粉和嬰兒專用配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)》中指出在嬰兒配方奶粉及特殊醫(yī)療目的的配方奶粉中單產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)物可以被使用,并需證明在弱勢群體中使用的安全性。但國內(nèi)還未有法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)對食品用菌種產(chǎn)D-乳酸情況提出明確限定。僅在《食品用菌種安全性評價(jià)程序(征求意見稿)》中提出直接添加到供1歲以下嬰兒食用食品中的菌種,需按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法或其他等效方法進(jìn)行D-乳酸的測定。因此食品用菌種產(chǎn)L/D-乳酸的檢測與評價(jià)至關(guān)重要。

目前還未有適用于微生物發(fā)酵液中L/D-乳酸同時(shí)定性定量的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,GB 1886.173—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑乳酸》采用液相色譜定性,滴定法定量,其適用范圍為食品添加劑乳酸含量的測定。QB/T 5712—2022《發(fā)酵液中L-乳酸的測定酶電極法》是采用酶電極乳酸分析儀測定發(fā)酵液中L-乳酸含量,定量限為10.0 μg/mL,但不能進(jìn)行D-乳酸的檢測分析。ISO 8069—2005《奶粉-乳酸和乳酸鹽含量的測定》,利用L-乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)和D-乳酸脫氫酶(D-LDH)特異性反應(yīng),通過分光光度計(jì)可快速測定奶粉中L/D-乳酸含量,但此方法存在酶易失活、樣品中內(nèi)源性L-LDH與L-乳酸反應(yīng)生成中產(chǎn)物造成實(shí)驗(yàn)誤差的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。此外還有其他方法,如氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、中和滴定法、EDTA定鈣法、原子吸收光譜法等,均只能測定產(chǎn)品中乳酸總量不能區(qū)分其光學(xué)構(gòu)型[14]。高效液相色譜法通過手性色譜柱可實(shí)現(xiàn)對樣品中L/D-乳酸的分離,同時(shí)進(jìn)行定性分析和定量檢測,在測定D-乳酸時(shí)檢測范圍廣,并具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性,在微生物產(chǎn)D-乳酸評價(jià)具備良好應(yīng)用前景[15-16]。

本研究采用高效液相色譜結(jié)合手性柱建立一種適用于乳酸菌發(fā)酵液中L/D-乳酸的定量檢測方法,并對所建方法的專屬性、精密度、準(zhǔn)確性、定量限、線性范圍及穩(wěn)定性指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。利用該方法對乳酸菌類益生菌在特定培養(yǎng)條件下進(jìn)行L/D-乳酸的定量檢測,對不同種乳酸菌產(chǎn)D-乳酸情況系統(tǒng)分析,旨在為益生菌安全性評價(jià)等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)制定提供技術(shù)參考,對促進(jìn)益生菌在食品行業(yè)更加安全和廣泛的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株信息

實(shí)驗(yàn)所用菌株如表1所示,共收集18株乳酸菌菌株,包括可用于嬰幼兒食品的菌株、酸奶發(fā)酵劑菌株以及自行分離自食品的菌株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

L-乳酸(色譜純,98%純度)、D-乳酸(色譜純,90%純度),Sigma公司;異丙醇,色譜純,美國Fisher公司;甲醇(色譜純),美國Fisher公司;CuSO4·5H2O(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MRS培養(yǎng)基、半胱氨酸鹽酸鹽,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋,日本三菱化學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀,ThermoFisher公司;CRS10 W手性柱(4.6 mm×50 mm,3 μm),日本三菱化學(xué)公司;微量可調(diào)移液器、小型臺式冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司;生物安全柜,新加坡ESCO公司;分析天平,梅特勒公司;隔水式培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

表1 菌株信息Table 1 Information of selected strains

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱:CRS10 W(4.6 mm×50 mm,3 μm);流動(dòng)相:2 mmol/L CuSO4·5H2O水溶液;流速:0.5 mL/min;柱溫:25 ℃;紫外檢測器,檢測波長254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品和D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度4.0 mg/mL的L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。并將其稀釋為不同質(zhì)量濃度的L/D-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別為1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0、400.0 μg/mL。經(jīng)水系0.22 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測,根據(jù)檢測結(jié)果繪制峰面積及質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵液樣品制備

選擇廣泛適用于乳酸菌生長的MRS培養(yǎng)基,并添加還原劑半胱氨酸鹽酸鹽改善厭氧乳酸菌生長,提高菌株生長活力[17]。將乳酸菌菌株轉(zhuǎn)接至0.05%半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,雙歧桿菌屬在厭氧條件下培養(yǎng)。發(fā)酵液離心收集上清液,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后經(jīng)水系0.22 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC檢測。

1.3.4 專屬性驗(yàn)證

將L/D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白培養(yǎng)基樣品和菌株發(fā)酵液樣品分別進(jìn)行HPLC檢測,按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜圖。

1.3.5 檢出限及定量限測定

將L/D-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋后進(jìn)行HPLC檢測,通過信噪比(S/N=3)得出本方法中L/D-乳酸的最低檢出限(limit of detection,LOD),并通過信噪比(S/N=10)得出L/D-乳酸的定量限(limit of quantitation,LOQ)[18]。

1.3.6 精密度驗(yàn)證

選取菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI為驗(yàn)證菌株,每株菌株按照1.3.3節(jié)方法制備發(fā)酵液,并進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測,計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.7 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

以菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI為驗(yàn)證菌株,根據(jù)菌株發(fā)酵液中的L/D-乳酸含量,在發(fā)酵液中添加5種不同濃度的L/D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,檢測并計(jì)算加標(biāo)后的發(fā)酵液中L-乳酸、D-乳酸含量及回收率,每個(gè)濃度下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

回收率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.8 發(fā)酵液線性范圍驗(yàn)證

將菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發(fā)酵液進(jìn)行系列梯度稀釋,檢測不同濃度發(fā)酵液中L-乳酸、D-乳酸的含量,以檢測結(jié)果為因變量,樣品的預(yù)期濃度為自變量進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI的發(fā)酵液,在樣品制備0、8、16、24、32、48 h后進(jìn)行HPLC檢測,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量,計(jì)算不同貯藏時(shí)間檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.10 樣品測定

將18株乳酸菌菌株按照1.3.3節(jié)方法制備發(fā)酵液,并按照1.3.1節(jié)色譜條件檢測發(fā)酵液中的L-乳酸、D-乳酸含量。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),采用SPSS 25.0的單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan′s多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L/D-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照GB/T 35655—2017選取不同濃度范圍的L/D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立回歸方程,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。不同濃度范圍的L-乳酸和D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系,未發(fā)現(xiàn)明顯的離群值或異常值。因此得到L-乳酸和D-乳酸在1.0～ 400.0 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:y=0.148 6x+0.022和y=0.086 1x+0.018 9,用于乳酸菌發(fā)酵液中L/D-乳酸的定量分析。

2.2 專屬性驗(yàn)證結(jié)果

在建立的色譜條件下,L/D-乳酸色譜圖如圖1所示,混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中D-乳酸的保留時(shí)間為13.68 min,L-乳酸的保留時(shí)間為17.92 min,根據(jù)保留時(shí)間對樣品進(jìn)行定性分析。空白培養(yǎng)基樣品在L/D-乳酸位置處無干擾峰,在2株菌株發(fā)酵液中L/D-乳酸兩組分的分離度為4.0～6.0,可實(shí)現(xiàn)L-乳酸和D-乳酸的完全分離。

2.3 最低檢出限及定量限測定結(jié)果

通過將L/D-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋,并結(jié)合信噪比計(jì)算得出本方法中L/D-乳酸的最低檢出限為0.25 μg/mL,以及L/D-乳酸的定量限為0.80 μg/mL。

2.4 精密度驗(yàn)證結(jié)果

對菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測得發(fā)酵液中L/D-乳酸含量如表3所示,在2株乳酸菌的發(fā)酵液樣品中L/D-乳酸的RSD值均在3.5%以下,表明此方法的精密度、重復(fù)性良好。

表3 精密度驗(yàn)證結(jié)果 單位:mg/mL

2.4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

在菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發(fā)酵液中進(jìn)行加標(biāo)回收率檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,結(jié)果表明不同濃度的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在2株乳酸菌發(fā)酵液中的回收率為94.0%～103.7%;不同濃度的D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在2株乳酸菌發(fā)酵液中的回收率為90.0%～99.3%,因此檢測結(jié)果準(zhǔn)確,具有可靠性。

表4 菌株發(fā)酵液加標(biāo)回收率結(jié)果Table 4 Results of standard recovery of fermentation broth of strains

2.5 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

將菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發(fā)酵液樣品進(jìn)行逐步稀釋,將不同稀釋度下測得結(jié)果與預(yù)期濃度進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果如表5所示,2株菌株發(fā)酵液在進(jìn)行50～3 200倍的稀釋過程中,L/D-乳酸的檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的R2均在0.999以上,因此菌株發(fā)酵液在較大的稀釋范圍內(nèi),L/D-乳酸檢測結(jié)果具有良好線性關(guān)系。

表5 菌株發(fā)酵液線性范圍驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Results of linear range verification of fermentation broth

2.6 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

測定存儲(chǔ)0、8、16、24、32、48 h后的L.rhamnosusA和L.helveticusI菌株發(fā)酵液樣品,檢測結(jié)果如表6所示,在2株菌株發(fā)酵液中L/D-乳酸含量的RSD值均小于5.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在樣品制備48 h內(nèi)L-乳酸和D-乳酸含量檢測值變化差異不顯著,在檢測時(shí)間范圍內(nèi),L/D-乳酸在微生物發(fā)酵液中均可以穩(wěn)定存在。

表6 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果 單位:mg/mL

綜上,以上驗(yàn)證指標(biāo)結(jié)果符合《中國藥典》(2020版)0512高效液相色譜法方法學(xué)及9201藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證的要求,發(fā)酵液中L/D-乳酸兩組分的分離度>1.5、加標(biāo)回收率≥70%、精密度RSD≤35%、線性范圍回歸曲線R2≥0.98。

2.7 乳酸菌發(fā)酵液樣品檢測結(jié)果

乳酸的2種異構(gòu)體形式D(-)和L(+)可以通過不同的立體特異性NAD-依賴型乳酸脫氫酶(D-LDH或L-LDH),還原丙酮酸形成。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)根據(jù)L/D-乳酸產(chǎn)物的比例不同,可分為L-LAB、D-LAB和DL-LAB[19]。涵蓋4個(gè)屬8個(gè)種的18株乳酸菌菌株在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng),測得發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量如圖2所示,菌株S.thermophilusL和B.longumP～R發(fā)酵液中的L-乳酸光學(xué)純度均為100%,菌株在此條件下只產(chǎn)生L-乳酸。L.delbrueckiisubsp.bulgaricusK發(fā)酵液中的D-乳酸光學(xué)純度為100%,菌株在此條件下只產(chǎn)生D-乳酸。鼠李糖乳酪桿菌L.rhamnosusA～F發(fā)酵液中L-乳酸含量占比均在80%以上。B.animalisM～O同樣以產(chǎn)L-乳酸為主。L.acidophilusG、L.fermentumH、L.helveticusI呈現(xiàn)相似趨勢,產(chǎn)生的D-乳酸含量比例均在50%以上。

不同種乳酸菌產(chǎn)L/D-乳酸的情況具有顯著差異,同種乳酸菌產(chǎn)L/D-乳酸比例相近,而株間產(chǎn)L/D-乳酸的含量也具有差異,具有菌株特異性。6株L.rhamnosus產(chǎn)生少量D-乳酸,含量均在3.0 mg/mL以下,L-乳酸含量為12.5～14.7 mg/mL;2株L.helveticus的L-乳酸含量基本相同,D-乳酸含量具有顯著差異;3株B.animalis發(fā)酵液中D-乳酸在5%以內(nèi),L-乳酸含量具有顯著差異,為5.9～15.2 mg/mL。3株B.longum均不產(chǎn)D-乳酸,但其L-乳酸含量也具有顯著差異。同種乳酸菌具有相似的代謝模式,在18株菌株中Ld.subsp.bulgaricusK單產(chǎn)D-乳酸,并且D-乳酸量最高,為17.5 mg/mL,S.thermophilusL只產(chǎn)L-乳酸。研究表明S.thermophilus在發(fā)酵過程中只產(chǎn)生L-乳酸,S.thermophilus的基因組缺乏編碼D-LDH基因[20],L.delbrueckiisubsp.bulgaricus在生長過程中90%以上的丙酮酸通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為D-乳酸,其D-LDH基因表達(dá)水平或酶活性較高[21],很少或不產(chǎn)生L-乳酸。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法檢測范圍廣、準(zhǔn)確性較好,適用于多種乳酸菌發(fā)酵液樣品中L/D-乳酸含量的分析。

圖2 發(fā)酵液中L/D-乳酸含量Fig.2 Content of L/ D-lactic acid in fermentation broth

3 結(jié)論與討論

目前已有研究利用高效液相色譜法和手性柱同時(shí)檢測白酒和藥物原料中L-乳酸和D-乳酸的含量,檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好[22-23]。乳酸菌類食品用菌種合成D-乳酸的代謝活性已受到關(guān)注,因此對乳酸菌發(fā)酵液中L/D-乳酸的準(zhǔn)確檢測具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜結(jié)合手性柱建立了一種適用于乳酸菌發(fā)酵液中L/D-乳酸同時(shí)定性定量的檢測方法。所建方法中L/D-乳酸質(zhì)量濃度為1.0～ 400.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系,L/D-乳酸檢出限為0.25 μg/mL,定量限為0.80 μg/mL?；?株乳酸菌L.rhamnosus和L.helveticus的發(fā)酵液驗(yàn)證表明,該方法專屬性、精密度、準(zhǔn)確性、線性相關(guān)性和穩(wěn)定性指標(biāo)良好,適用于乳酸菌發(fā)酵液中L/D-乳酸的定量檢測。并對不同種乳酸菌產(chǎn)L/D-乳酸情況系統(tǒng)分析,利用該方法檢測18株乳酸菌菌株在改良MRS培養(yǎng)基中產(chǎn)生L/D-乳酸情況,結(jié)果表明,乳酸菌產(chǎn)L/D-乳酸含量及比例具有菌株特異性,因此對于乳酸菌產(chǎn)L/D-乳酸的評價(jià)需在菌株基礎(chǔ)上。此外,發(fā)酵條件如培養(yǎng)基種類、碳氮源、溫度、pH值、溶解氧含量等均可影響乳酸菌的生長,從而影響乳酸的產(chǎn)生,如在不同初始乳糖濃度下生長L.delbrueckii產(chǎn)D-乳酸的量隨乳糖增加而增加,由4.95到19.20 mg/mL[24]。因此未來基于此方法可進(jìn)一步分析多種乳酸菌在不同培養(yǎng)條件下、不同應(yīng)用場景中產(chǎn)L/D-乳酸情況。本研究所建立方法為食品用菌種安全性評價(jià)中菌株代謝產(chǎn)物D-乳酸的評價(jià)提供了有效數(shù)據(jù)支撐和實(shí)踐參考,以及為適用于嬰幼兒的益生菌資源的開發(fā)提供一定的技術(shù)參考,對促進(jìn)益生菌在食品行業(yè)更加安全和廣泛的應(yīng)用具有重要意義。