鄭雪麗,毛丙永,唐鑫,趙建新,張秋香,崔樹茂

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid, GlcA)重復(fù)二糖組成的一種線性糖胺聚糖,與HA特定蛋白質(zhì)TSG6或細胞膜受體CD44、RHAMM、HARE和TLR4/2相互作用,調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育、細胞存活和炎癥反應(yīng)[1],主要存在于皮膚真皮層、眼玻璃體液、滑膜關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)軟骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等,具有高黏彈性,能維持皮膚彈性和保持皮膚水分、減少關(guān)節(jié)摩擦、調(diào)節(jié)眼壓和參與神經(jīng)元網(wǎng)的形成的作用[2]。在健康個體中,HA的合成和降解處于一種動態(tài)平衡中。隨著機體的衰老,體內(nèi)HA的合成減少,降解增加,導(dǎo)致體內(nèi)HA總含量下降[3-4],隨之帶來一系列年齡相關(guān)問題,如眼花、皮膚老化、關(guān)節(jié)功能退化及僵硬、大腦記憶功能衰退等。因此增加相關(guān)部位HA的含量,可延緩機體的衰老癥狀。

口服外源性HA是目前增加組織部位HA含量的常用手段,但口服HA吸收利用率較低。一項研究發(fā)現(xiàn)大鼠口服99mTc-HA后糞便HA的排泄量達到92.3%[4]。口服125I-HA的動物實驗表明在2 h內(nèi)胃和小腸的放射性降低,而大腸的放射性升高,同時組織的放射性也較低,說明HA較難從胃腸道吸收[5]。此外,HA的半衰期約為1～1.5 d,外源性HA進入體內(nèi)迅速經(jīng)HA酶降解后多數(shù)被排泄,難以持續(xù)有效地在組織部位發(fā)揮功效[6]。針對上述問題,有研究者將注意力從外源攝入HA轉(zhuǎn)移到促進內(nèi)源HA合成上,以實現(xiàn)體內(nèi)HA含量增加。后生元是一種由滅活益生菌制備的新型微生態(tài)制劑,比益生菌更具安全性和穩(wěn)定性,也更易生產(chǎn)和貯存[7],其成分主要有肽聚糖、胞外多糖、磷壁酸、細菌素和有機酸等[8],研究發(fā)現(xiàn)一些由植物乳植桿菌制備的后生元具備促進HA合成的能力,例如,熱滅活的植物乳植桿菌L-137處理BALB/3T3成纖維細胞可提高HA含量和透明質(zhì)酸合成酶2(hyaluronic acid synthase, HAS2)mRNA表達[9],由植物乳植桿菌K8制備的后生元促進了HaCaT細胞的HA含量和并上調(diào)了HAS2 mRNA表達[10]。但是植物乳植桿菌對HA合成研究多數(shù)僅限于細胞實驗,缺乏體內(nèi)HA的合成數(shù)據(jù),本研究通過向小鼠注射D-半乳糖建立衰老模型,探討植物乳植桿菌CCFM1296及其制備的后生元對小鼠組織中HA合成的影響,并進一步分析了其對抗衰老的效果,為開發(fā)調(diào)控宿主HA含量和抗衰老的益生菌產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

植物乳植桿菌CCFM1295、植物乳植桿菌CCFM1296、植物乳植桿菌CCFM1297均來自江南大學(xué)食品生物技術(shù)保藏中心(江蘇無錫)。

實時熒光質(zhì)量PCR相關(guān)引物,上海生工公司;透明質(zhì)酸試劑盒,上海酶聯(lián)公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒,南京諾維贊公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)活性試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性試劑盒,南京建成公司;D-半乳糖,上海阿拉丁公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

隔水式恒溫生物培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;皮膚水分儀、皮膚彈性儀,德國CK公司;生化分析儀,深圳邁瑞公司。

1.2 菌懸液的制備

待植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297活化后將其接種于液體MRS培養(yǎng)基中37 ℃擴培24 h,于4 ℃、8 000 r/min離心20 min,無菌生理鹽水清洗菌泥2次,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 后生元的制備

后生元的制備參照ALMADA等[11]的總結(jié),采用了熱處理與高壓均質(zhì)聯(lián)合的方式,并對具體條件稍作改動。過夜培養(yǎng)的植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297,傾注法計算總活菌數(shù),并在制備前稀釋至與灌胃所需的活菌數(shù)一致,熱處理(65 ℃,30 min)并進行高壓均質(zhì)(800～1 200 MPa,3次)后,得到后生元并凍干備用。

1.4 動物實驗設(shè)計

雄性BALB/c實驗小鼠(8周齡,SPF級,體重20～22 g)購于維通利華。動物實驗方案獲得江南大學(xué)實驗動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號為:JN.No20211215b2050601)。將40只實驗小鼠隨機分為空白組(Control)、模型組(Model)、植物乳植桿菌CCFM1295活菌組(CCFM1295-L)、植物乳植桿菌CCFM1295后生元組(CCFM1295-D)、植物乳植桿菌CCFM1296活菌組(CCFM1296-L)、植物乳植桿菌CCFM1296后生元組(CCFM1296-D)、植物乳植桿菌CCFM1297活菌組(CCFM1297-L)、植物乳植桿菌CCFM1297后生元組(CCFM1297-D),每組5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,除空白組(Control)外,其余各組小鼠每天皮下注射生理鹽水配制的D-半乳糖(500 mg/kg)[12],造模9周。造模期間,CCFM1295-L組、CCFM1296-L組、CCFM1297-L組小鼠每只每天灌胃5×109CFU/kg體重的菌懸液[13],CCFM1295-D組、CCFM1296-D組、CCFM1297-D組小鼠每天灌胃500 mg/kg體重的后生元溶液?？瞻捉M和模型組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。最后一次干預(yù)造模24 h后,稱記小鼠體重,處死小鼠,立即取樣。

1.5 皮膚水分、彈性測定

造模9周后,用無菌剃毛刀剃凈小鼠頸背部毛發(fā),用皮膚水分和彈性測定儀[14]檢測每只小鼠的下背部至臀部區(qū)域的左側(cè)和右側(cè)皮膚水分,交替測量10次,分別剔除2個最低值和最高值后,以剩余6個值的平均數(shù)為小鼠皮膚水分和皮膚彈性,測量時固定小鼠,保證儀器表面與待測皮膚垂直接觸。

1.6 HA含量測定

取小鼠背部皮膚、關(guān)節(jié)組織、腦和眼球加入預(yù)冷的PBS于高通量組織研磨儀制成10%、16%、33%和20%勻漿后,4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,按照HA ELISA試劑盒說明書檢測各組織中HA含量。

1.7 實時熒光定量PCR檢測小鼠組織的mRNA表達

采用提RNA試劑盒按說明書提取小鼠皮膚、關(guān)節(jié)、眼、腦組織總RNA,用Nanodrop檢測OD260/OD280的數(shù)值,將1 μg總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成20 μL cDNA,以SYBR Green qPCR Master Mix用于實時熒光定量PCR反應(yīng)體系配制。以GAPDH作為內(nèi)參基因,基于2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

1.8 血清指標(biāo)測定

采用眼眶靜脈叢采集小鼠血液,靜置2 h,3 000 r/min 低溫離心10 min,取上清液。采用生化分析儀測定與衰老相關(guān)的血清生化指標(biāo),包括C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、膽堿酯酶(cholinesterase,CHE)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)。

表1 小鼠用引物序列Table 1 Primer sequences of mice

1.9 皮膚組織CAT活力、GSH-Px和T-AOC測定

取小鼠背部皮膚加入預(yù)冷的PBS于高通量組織研磨儀制成10%勻漿后,于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明測定小鼠皮膚CAT活力、GSH-Px和T-AOC。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件來對顯著性差異進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示,組間比較使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠體重的影響

實驗過程中,空白組小鼠皮毛順滑光亮,行動比較靈活;模型組小鼠毛色黯淡疏松,行動遲緩;而CCFM1296-L和CCFM1296-D組的小鼠毛色和活力相比較模型組有一定程度改善。各組小鼠在實驗期間體重均出現(xiàn)緩慢增長,組間無明顯差異(圖1),表明灌胃植物乳植桿菌和后生元對小鼠無副作用。

2.2 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚水分、彈性的影響

D-半乳糖的過量積累可引起皮膚發(fā)生氧化應(yīng)激,其產(chǎn)生的自由基可攻擊HA聚合物導(dǎo)致HA降解[15],同時攻擊真皮層纖維細胞,導(dǎo)致屏障功能受損,發(fā)生皮膚水分和彈性均下降的衰老跡象[16]。由圖2-a和圖2-b所示,模型組小鼠皮膚水分和彈性相比于空白組組顯著降低(P<0.001),CCFM1296-L組顯著增加了D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠的皮膚水分和彈性(P<0.001),而CCFM1296-D雖然也提高了皮膚水分與彈性,但皮膚水分與模型組相比無顯著性差異(P>0.05),其他植物乳植桿菌以及制備的后生元對注射D-半乳糖后的皮膚水分和皮膚彈性無顯著影響(P>0.05)。皮膚微生物組成具有年齡相關(guān)性,年輕女性的皮膚微生物多樣性高于年老女性[17],一些研究表示口服益生菌或后生元能夠改善皮膚微生物多樣性,減少皮膚衰老跡象[18],其次,腸道微生物群失衡導(dǎo)致的腸道微生態(tài)失調(diào),與皮膚不良反應(yīng)有關(guān)。腸道微生態(tài)失衡后分泌的游離苯酚和對甲酚進入循環(huán)并蓄積在皮膚中,導(dǎo)致角質(zhì)細胞尺寸減小和水分流失[19]。口服益生菌和后生元可減少苯酚和對甲酚水平,并增強角質(zhì)層水合作用[20-21],這表明益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道或皮膚微生物群平衡來恢復(fù)皮膚穩(wěn)態(tài)。

圖1 實驗期間小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes in different groups of mice

a-皮膚水分;b-皮膚彈性圖2 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚水分、彈性的影響Fig.2 Effects of different Lactiplantibacillus planturum and postbiotics on skin moisture and elasticity in mice注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(下同)。

2.3 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠組織HA含量的影響

HA在皮膚組織中含量最高,并因為其極端的親水性和黏彈性保持著皮膚中的水分含量和彈性[22]。作為機體的天然潤滑劑,HA對眼睛和關(guān)節(jié)健康也至關(guān)重要[23],此外,HA構(gòu)成的神經(jīng)元網(wǎng)還涉及神經(jīng)元的成熟[24]。灌胃不同植物乳植桿菌和后生元對小鼠皮膚、眼球、關(guān)節(jié)、腦的HA含量影響如圖3所示。相較于空白組,模型組的HA含量顯著降低(P<0.001),說明在衰老過程中,HA的流失增加。向小鼠給予CCFM1296-L和CCFM1296-D均顯著地增加了皮膚、眼球和關(guān)節(jié)組織的HA含量(P<0.05)。但是,CCFM1296-L干預(yù)并未對腦組織的HA含量產(chǎn)生顯著影響(P>0.05),只有CCFM1296-D相比模型組增加了HA含量(P<0.05),其他植物乳植桿菌及其制備的后生元對小鼠皮膚、眼、腦、關(guān)節(jié)等組織的HA含量無顯著影響(P>0.05)。上述結(jié)果表明CCFM1296-L顯著地提高了皮膚、眼球、關(guān)節(jié)的HA水平,而CCFM1296-D不但顯著增加了皮膚、眼球、關(guān)節(jié)組織的HA含量,也增加了腦組織的HA含量。CCFM1296-L和CCFM1296-D對腦HA含量影響的差異可能與活菌與后生元不同的免疫活性有關(guān)。在一項研究中發(fā)現(xiàn)植物乳植桿菌 L-137制備的后生元在激活I(lǐng)FN-γ或TNF-α后誘導(dǎo)了細胞HA的產(chǎn)生,若抑制IFN-γ或TNF-α則可限制HA的產(chǎn)生[9],這說明植物乳植桿菌活菌可能限制了IFN-γ或TNF-α的釋放抑制了腦中HA產(chǎn)生。

a-皮膚;b-眼球;c-關(guān)節(jié);d-腦圖3 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚、眼球、關(guān)節(jié)、腦的HA含量影響Fig.3 Effects of different Lactiplantibacillus planturum and postbiotics on HA content in skin, eye, joint, and brain of mice

2.4 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠組織HA合成酶基因表達的影響

在HA合成過程中有4種重要的合成酶類,其活性直接調(diào)控著HA的含量,分別為UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase, UGDH)、HAS1、HAS2、HAS3。其中,UGDH是催化UDP-葡萄糖向UDP-GlcA轉(zhuǎn)化的限速酶,產(chǎn)生UDP-GlcA后,由HAS在細胞膜上通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵交替連接UDP-GlcA和UDP-GlcNAc,生成長鏈HA,而HAS的3種同工酶都能參與催化不同分子質(zhì)量HA的合成[25]。為了探討影響機體HA合成的機制,進一步檢測了CCFM1296-L和CCFM1296-D干預(yù)后小鼠組織HA合成酶的表達情況(圖4)。在皮膚、關(guān)節(jié)、眼、腦組織中,與空白組比較,模型組UGDH、HAS1、HAS2、HAS3的mRNA相對表達量均顯著性降低(P<0.01),CCFM1296-L的干預(yù)顯著上調(diào)了關(guān)節(jié)中UGDH mRNA和HAS1 mRNA的表達(P<0.05),而CCFM1296-D顯著上調(diào)了腦UGDH mRNA和眼HAS1 mRNA的表達(P<0.05);對于皮膚、關(guān)節(jié)、眼組織的HAS2 mRNA表達,CCFM1296-L和CCFM1296-D口服均顯著上調(diào)(P<0.05),且CCFM1296-D還顯著上調(diào)了腦HAS2 mRNA的表達(P<0.01);另外,口服CCFM1296-L也顯著增加了皮膚HAS3 mRNA的表達(P<0.05)。HAS2是HA合成過程中最重要的一類合成酶,對哺乳動物的生存影響最大,HAS2在胚胎心臟形態(tài)發(fā)生的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成中起重要作用,其缺失導(dǎo)致機體嚴重畸形和死亡[26],研究表明促進細胞中的HAS2 mRNA過表達可使HA水平增加3倍以上[27],這說明CCFM1296-L和CCFM1296-D可能通過促進HAS2 mRNA表達水平來增加組織部位HA含量。

a-UGDH mRNA;b-HAS1 mRNA;c-HAS2 mRNA;d-HAS3 mRNA圖4 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠皮膚、眼球、關(guān)節(jié)、腦的HA合成酶基因表達的影響Fig.4 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on the expression of HA synthase gene in skin, eye, joint and brain of mice注:a～d圖中從左至右依次為皮膚、關(guān)節(jié)、眼球、腦。

2.5 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠血清指標(biāo)的影響

為了進一步評估具有促進HA合成能力的CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠衰老的影響,我們檢測了血清中CRP的含量和ALT、AST、ALP、CHE、CK的活力狀況。由圖5-a～圖5-f可知,與空白組相比,模型組的CRP含量、ALT、AST、ALP、CK水平顯著增加(P<0.001),CHE水平顯著降低(P<0.05)。給予小鼠CCFM1296-L和CCFM1296-D則顯著地降低了血清中CRP、ALT、AST、ALP、CK水平,并上調(diào)了CHE活性(P<0.05)。綜合以上結(jié)果表明,植物乳植桿菌CCFM1296及其制備的后生元均具有緩解小鼠衰老的作用。

2.6 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠皮膚CAT、GSH-Px、T-AOC活力的影響

HA在體內(nèi)具有良好的抗氧化能力,能夠提高機體抗氧化酶活性實現(xiàn)抗衰老作用[28],故對能夠促進HA合成的CCFM1296-L和CCFM1296-D的抗氧化能力進行檢測。圖6展示了皮膚的抗氧化水平,D-半乳糖誘導(dǎo)的模型組與空白組相比,顯著降低了CAT、GSH-Px和T-AOC活力(P<0.001),這意味著D-半乳糖引發(fā)了皮膚氧化應(yīng)激。利用CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠進行干預(yù)后,結(jié)果CCFM1296-L組表現(xiàn)出了抑制氧化應(yīng)激的行為,顯著提高了CAT、GSH-Px和T-AOC活力(P<0.05),增強了皮膚的抗氧化能力,而CCFM1296-D雖也增強了抗氧化能力,卻未與模型組表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05),這可能與CCFM1296-L比CCFM1296-D調(diào)控皮膚HA合成能力更強有關(guān)。一項研究表明裸鼴鼠體內(nèi)分泌高水平的HA,使裸鼴鼠具有更強抵抗衰老和疾病的能力,降低HA含量后裸鼴鼠的抵抗能力也隨之下降[29],本研究中CCFM1296-L在皮膚中產(chǎn)生的HA水平高于CCFM1296-D,說明促進HA合成的益生菌能夠增強皮膚防御,且促HA合成能力越強,效果越強。

a-CRP;b-ALT;c-AST;d-ALP;e-CHE;f-CK圖5 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on serum biochemical indexes in mice

a-CRP;b-ALT;c-AST;d-ALP;e-CHE;f-CK圖6 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠皮膚CAT、GSH-Px、T-AOC活力的影響Fig.6 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on the activities of CAT, GSH-Px and T-AOC in mice skin

3 結(jié)論

本研究利用D-半乳糖構(gòu)建動物衰老模型,研究了植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297活菌和制備的后生元對內(nèi)源性HA合成和衰老的影響,結(jié)果表明植物乳植桿菌CCFM1296活菌和制備的后生元能夠增加衰老小鼠的內(nèi)源性HA含量,并通過增加CHE水平和降低血清AST、ALT、ALP、CK、CRP水平來抑制衰老的不健康狀態(tài),同時增加小鼠皮膚含水量、皮膚彈性、CAT、GSH-Px和T-AOC活力,具有一定的體內(nèi)抗衰老作用,為通過口服益生菌增加內(nèi)源性HA含量并改善機體衰老提供了一種新的思路,然而植物乳植桿菌CCFM1296活菌及后生元調(diào)控宿主HA合成的關(guān)鍵功能成分和具體作用機制還需要進一步通過代組學(xué)技術(shù)和菌群分析進行確定。