張瀟雪,杜慧慧*,胡武靜,江鴻翎,肖國生,楊東林

1(重慶三峽學院,重慶,404120)2(重慶文理學院 創(chuàng)新靶向藥物國際研究院,重慶,402160)

檸檬(Citruslimon)富含檸檬酸、類黃酮、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì),具有降低膽固醇、預防心血管疾病、護膚美容和抗腫瘤等功效,是繼柑和橙之后的第三大柑橘品種, 在全世界范圍內(nèi)有廣泛的栽培。重慶市萬州區(qū)白羊鎮(zhèn)作為全國檸檬三大主產(chǎn)區(qū)之一,被譽為“重慶市檸檬之鄉(xiāng)”,檸檬年產(chǎn)量可達6萬t,但目前銷售模式多以鮮銷為主,加之檸檬加工產(chǎn)業(yè)起步較晚,加工產(chǎn)品單一,附加值較低,造成豐產(chǎn)不豐收的現(xiàn)狀[1]。因此,開發(fā)多樣化的檸檬加工產(chǎn)品是增加檸檬經(jīng)濟效益亟需解決的問題。

精油是從植物中提取的天然化合物,具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗焦慮等作用[2-3],其成分及生物活性越來越受到人們的關(guān)注[4-5]。有學者[6-8]對檸檬果皮精油進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析發(fā)現(xiàn),不同方法提取的檸檬果皮精油其揮發(fā)性成分均以烯類為主,醇類、酯類和醛類等含氧化合物次之。目前檸檬精油的研究和應用主要集中于芳香理療或改善神經(jīng)系統(tǒng)作用和膜材料的制備[9-10],隨著一些活性成分生理活性的發(fā)現(xiàn),檸檬精油作為功能食品及藥品化妝品的原料具有廣闊的應用和開發(fā)前景[11-12],需求將日益增加。為響應國家號召,堅持因地制宜、循序漸進的綠色發(fā)展理念和鄉(xiāng)村振興的戰(zhàn)略方針,本研究以萬州區(qū)白羊鎮(zhèn)尤力克檸檬果皮為原料,通過單因素、響應面實驗優(yōu)化提取工藝獲取檸檬精油,并探究檸檬精油的抑菌、抗氧化及抗腫瘤活性,以期為萬州檸檬深加工產(chǎn)業(yè)以及廢渣利用的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

萬州尤力克檸檬,重慶市萬州區(qū)白羊鎮(zhèn);結(jié)直腸癌細胞SW620、HCT116、膠質(zhì)瘤細胞U87、U251,宮頸癌細胞Hela、頭頸癌細胞SCC15、胰腺癌細胞BXPC-3、前列腺癌細胞PC3、人正常結(jié)直腸上皮細胞FHC,重慶文理學院創(chuàng)新靶向藥物國際研究院提供;金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌,重慶三峽學院生物與食品工程學院實驗室培養(yǎng)。

DPPH;碘化丙啶 (propidium iodide,PI)、核糖核酸酶(ribonuclease,RNase);噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT);二甲基亞砜 (dimethyl Sulfoxide,DMSO);RPMI-1640 (roswell park memorial institute-1640)液體培養(yǎng)基、DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)液體培養(yǎng)基、F12K液體培養(yǎng)基、無支原體胎牛血清、胰蛋白酶;抗體CDK1、CyclinB、LC3B、α-Tubulin;熒光二抗。

1.2 儀器與設(shè)備

GI80T高壓蒸汽滅菌鍋,上海躍進醫(yī)療器械有限公司;MINI G S25/Eppendorf AG輕小型離心機,德國艾本德股份公司;1-16K高速冷凍離心機,重慶市瑞利電子儀器設(shè)備有限公司;5K43734倒置顯微鏡,日本Olympus 公司;F2215-185A-460細胞計數(shù)器,賽默飛世爾科技;XB70-FZ/R34A制冰機,東南科儀有限公司;PowerPacTM Basic蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀,美國BIO-RAD公司;Cycation 5多功能酶標儀,美國BIO-TEK公司;ODYSSEY CLX LI-COR Odeyssey激光掃描儀,美國Gene limited company基因有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檸檬精油提取工藝流程

檸檬精油提取工藝流程如下:

新鮮檸檬→清洗→切皮、去白瓤→破碎→超聲→蒸餾→無水硫酸鈉干燥→精油

1.3.2 超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取檸檬精油

新鮮檸檬皮去除白瓤,高速粉碎機研磨1 min,稱取30 g粉碎后的新鮮檸檬皮置于1 000 mL圓底燒瓶中,按照對應比例加入適量蒸餾水,超聲一定時間后,連接揮發(fā)油提取裝置,蒸餾一定時間,計算精油的提取率,提取率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:c,提取率,%;v1,檸檬精油體積,mL;m2,新鮮檸檬果皮質(zhì)量,g。

1.3.3 單因素及響應面實驗優(yōu)化提取工藝

結(jié)合文獻[13-15],分別以液料比3∶1～15∶1(mL∶g),蒸餾時間30～210 min,超聲時間10～60 min,氯化鈉添加2～15 g/L為基礎(chǔ),進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以液料比(mL∶g)、超聲時間(min)、蒸餾時間(min)、氯化鈉添加量(g/L)為自變量,檸檬精油提取率(%)為響應值,按照B-Behnken Design原理[16]設(shè)計4因素3水平(表1),采用Design-Expert 8.0 軟件進行響應面實驗,根據(jù)實驗結(jié)果進行優(yōu)化分析,以得到最優(yōu)提取工藝。

表1 響應面因素水平表Table 1 Level of response surface experimental factors

1.3.4 GC-MS 分析檸檬精油成分

a)樣品預處理:取提取的檸檬精油用二氯甲烷稀釋 10 倍,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

b)氣相色譜條件:色譜柱為 HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm),載氣為高純氦氣(99.999%),流速為0.91 mL/min,不分流進樣。進樣口溫度為250 ℃,進樣量 0.4 μL。采用程序升溫模式:柱溫 80 ℃,保持3 min,再以 8 ℃/min升溫至280 ℃,保持23 min。

c)質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃,溶劑延遲2 min,EI電子源,電子能量70 eV,m/z掃面范圍1.5～1 090 amu。檢索庫為NIST庫。

1.3.5 抗氧化活性測定

稱取0.01 g DPPH,溶解于無水乙醇并定容至250 mL,配制成0.1 mmol/L DPPH溶液;取2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液和2 mL不同質(zhì)量濃度(3、105、185、264、343 mg/mL)的檸檬精油溶液,混合均勻,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A(chǔ)1;取2 mL無水乙醇溶液和2 mL不同濃度的檸檬精油溶液分別混合,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A(chǔ)2;取2 mL無水乙醇溶液與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A(chǔ)0;維生素C為陽性對照,所有樣品平行測定3次取平均值,根據(jù)公式(2)計算清除率(E):

(2)

1.3.6 抑菌活性測定

分別挑取金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種細菌單菌落,于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,菌液濃度稀釋至106～107CFU。分別取4種待測菌懸液100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基,待其完全吹干,將滅菌后的濾紙片呈“品”字型貼3片于培養(yǎng)基表面,每片濾紙滴加10 μL檸檬精油,同時要以相同的操作以無菌水代替檸檬精油做空白實驗,以慶大霉素為陽性對照,37 ℃培養(yǎng)24 h后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄,實驗重復3次,結(jié)果取平均值[7]。

1.3.7 細胞培養(yǎng)

取出凍存于液氮罐中的腫瘤細胞進行常規(guī)復蘇,即在37 ℃水浴鍋中迅速完全融化,于800 r/min離心5 min,棄去上清液。分別將結(jié)直腸癌細胞SW620,宮頸癌細胞Hela,膠質(zhì)瘤細胞U87、U251和頭頸癌細胞SCC15 接種于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,胰腺癌細胞BXPC-3接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,前列腺癌細胞PC3接種于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基,結(jié)直腸癌細胞HCT116接種于含10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基,人正常結(jié)直腸上皮細胞FHC接種于含10%胎牛血清的F12K+DMEM混合培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5%體積分數(shù)CO2、飽和濕度),定期換液,待細胞生長融合達80%～90%時,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.8 MTT法檢測細胞增殖活性

9種細胞均分為不同質(zhì)量濃度檸檬精油組(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)、陰性對照組為添加DMSO。分別取對數(shù)生長期的9 種細胞的細胞懸液200 μL(1×103個/孔)接種于 96 孔板,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁后,加入不同濃度的檸檬精油和DMSO(陰性對照),并將9 種細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出各組細胞,棄上清液后每孔加入200 μL DMSO,搖床10 min,酶標儀設(shè)定波長為570 nm,記錄吸光度值并計算檸檬精油對細胞增殖的抑制率,每組設(shè)6個復孔[17]。細胞增殖抑制率計算如公式(3)所示:

(3)

1.3.9 蛋白免疫印跡

取對數(shù)生長期的細胞2×106個接種于6 cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)12 h待細胞貼壁且變形后,分別加入檸檬精油,使得終質(zhì)量濃度為595、425、255 μg/mL,并以DMSO溶劑為對照組,培養(yǎng)24 h后收集細胞。使用Western及IP裂解液(含蛋白酶抑制劑)分別提取細胞的總蛋白質(zhì),并用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。上樣20 μg總蛋白質(zhì),進行10%～15% SDS-PAGE 膠電泳;采用濕轉(zhuǎn)方法(100 V,120 min)將PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上,再用5%(體積分數(shù))脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗滌5次,每次5 min;相應的一抗按照推薦稀釋濃度4 ℃孵育過夜,TBST 洗滌3次,每次10 min;IRDye標記二抗稀釋比例為1∶15 000,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次5 min;采用LI-COR Odeyssey激光掃描儀檢測目的條帶,并分析檢測結(jié)果[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

液料比、蒸餾時間、超聲時間及氯化鈉添加量均對檸檬精油的提取率有較大的影響,檸檬精油的提取率隨液料比的增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(圖1-a),當液料比達到1∶9左右時檸檬精油的提取率曲線出現(xiàn)峰值,即提取率達到最大值,表明檸檬精油在此時達到飽和,繼續(xù)增加液料比反而會使蒸餾時間延長,從而延長受熱時間,使精油發(fā)生分解,提取率下降。因此,確定液料比在1∶9左右時為最佳。

蒸餾時間在120 min之內(nèi)時,提取率隨著時間的延長呈穩(wěn)步上升的趨勢,120 min左右時,提取率達到最大,之后隨著時間的延長,提取率不斷下降(圖1-b)。蒸餾時間過長會引起精油分解,導致提取率降低,說明蒸餾時間過長不利于提取的順利進行,因此最佳蒸餾時間應保持在120 min左右。

超聲波輔助提取利用超聲波的空化效應增加溶劑穿透力[19],提高檸檬精油的溶出速度和溶出量,從而提高檸檬精油的提取率。而超聲波也可以增加物質(zhì)成分的擴散,若超聲時間過長,反而會使檸檬精油中的一些組分被破壞或成分揮發(fā),甚至加劇乳化,降低檸檬精油的得率。因此本實驗選取超聲20 min左右為宜(圖1-c)。

隨著氯化鈉添加量的增加,檸檬精油的提取效果呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,其中當氯化鈉添加量在6 g/L左右時,提取率達到最高值,此時的提取效果最佳(圖1-d)。

2.2 響應面實驗優(yōu)化檸檬精油提取工藝

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析[6](表2),得到了檸檬精油提取率與液料比(A)、超聲時間(B)、蒸餾時間(C)、氯化鈉添加量(D)的二次回歸方程模型:

Y=2.58+0.034A+0.10B+0.037C-0.047D+0.38AB+0.21AC+0.18AD+0.067BC+0.065BD+0.20CD-0.26A2-0.19B2-0.33C2-0.43D2

a-液料比;b-蒸餾時間;c-超聲時間;d-氯化鈉添加量圖1 液料比、蒸餾時間、超聲時間及氯化鈉添加量對檸檬精油提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, distillation time, ultrasonic time and sodium chloride addition amount on the extraction yield of lemon essential oil

表2 響應面實驗設(shè)計Table 2 Response surface experimental design

該模型的F=21.75,P<0.000 1(表3),表明該模型具有極顯著性,失擬項中P=0.185 6,說明僅有18.56%可能會因為各種因素影響導致模型不吻合,因而該模型擬合程度較好,實驗誤差小,可用此模型對檸檬精油提取率進行預測和分析。一次項中B(超聲時間)的P<0.05,說明超聲時間對檸檬精油提取率的影響顯著。二次項中C2、D2的P值均小于0.000 1,A2<0.01,B2<0.05,結(jié)合F值可知,各因素對檸檬精油提取率的影響大小依次為B(超聲時間)>D(氯化鈉添加量)>C(蒸餾時間)>A(液料比)。各因子交互作用的響應面中,兩兩交互作用的響應面都呈弧形(圖2),說明它們對響應值都具有顯著作用[20],根據(jù)響應面不難看出各因素對響應值的影響程度從大到小依次為B(超聲時)>D(氯化鈉添加)>C(蒸餾時間)>A(液料比),與方差分析中結(jié)果基本一致,進一步驗證了其結(jié)果。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significance results of regression model

通過響應面結(jié)果分析確定了最佳工藝的參數(shù)為液料比12∶1、超聲時間29.01 min、蒸餾時間133.21 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,在此條件下預測檸檬精油提取率可達2.72%。為方便實驗操作,調(diào)整工藝參數(shù):液料比12∶1、超聲時間29 min、蒸餾時間133 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,重復3次,檸檬精油的提取率為(2.61±0.12)%,與回歸模型預測值2.72%相近,說明該工藝條件可行。

圖2 兩因子交互作用對提取率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plot of the effect of two-factor interaction on extraction yield

2.3 檸檬精油組成成分分析

采用GC-MS對超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的檸檬精油進行定性分析后,得到檸檬精油揮發(fā)性成分的總離子流圖(圖3)。檸檬精油成分保留時間集中在8.2～13.3 min,出峰數(shù)占總峰數(shù)的比例為48%。從尤力克檸檬果皮精油中共得到102種化合物(表4),其中相對含量較大的主要成分有1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(17.26%)、檜烯(10.62%)、β-蒎烯(9.91%)、左旋-α-蒎烯(6.93%)、γ-松油烯(6.11%)、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(5.5%)、檸檬醛(4.39%)、檸檬醇(3.09%)。

圖3 檸檬精油揮發(fā)成分總離子流圖Fig.3 Total ion diagram of volatile constituents extracted from lemon essential oil

2.4 檸檬精油具有抗氧化活性

檸檬精油清除DPPH自由基的原理是DPPH有單電子,其醇溶液呈紫色,在517 nm處有最大吸收峰,當存在自由基清除劑時能夠與其單電子結(jié)合而使溶液顏色變淺[21]。檸檬精油對DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大,當質(zhì)量濃度達343 mg/mL時有最大的清除率92.68%(圖4)。與維生素C相比,檸檬精油對DPPH自由基的清除效果稍差一些,但隨著質(zhì)量濃度的增加,檸檬精油清除DPPH自由基的效果逐漸接近維生素C。由此可確定檸檬精油具有一定的抗氧化活性。

表4 尤力克檸檬精油的化學組分Table 4 Composition of essential oil from Eureka lemon

圖4 檸檬精油有效清除DPPH自由基Fig.4 DPPH radical scavenging effect of lemon essential oil

2.5 檸檬精油具有抑菌活性

檸檬精油對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌均具有一定的抑菌效果(表5),且維氏氣單胞菌對檸檬精油最敏感,嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌次之,副溶血性弧菌對檸檬精油敏感性最差。

表5 檸檬精油對4 種受試菌的抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of lemon essential oil against four tested bacteria

2.6 檸檬精油具有抗腫瘤活性

2.6.1 檸檬精油抑制腫瘤細胞的增殖

為了評價檸檬精油的抗腫瘤活性,測定了檸檬精油對8種腫瘤細胞的細胞活力。檸檬精油在不同濃度(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)分別作用于(結(jié)直腸癌細胞SW620、HCT116、宮頸癌細胞Hela、膠質(zhì)瘤細胞U87、U251、頭頸癌細胞SCC15、胰腺癌細胞BXPC-3、前列腺癌細胞PC3)8種腫瘤細胞和1種人正常結(jié)直腸上皮細胞FHC,48 h后測定細胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著檸檬精油質(zhì)量濃度的增加,細胞活力下降,抑制率顯著升高(圖5-a)。在人正常結(jié)直腸上皮細胞FHC中,IC50顯著高于腫瘤細胞,表明檸檬精油不影響人正常細胞的活力(圖5-b)。由此可見,檸檬精油增加細胞抑制率呈濃度依賴性,且具有抗多種腫瘤細胞的活性。

圖5 檸檬精油抑制腫瘤細胞增殖Fig.5 Inhibition of lemon essential oil on tumor cell proliferation注:***表示P<0.001。

2.6.2 檸檬精油誘導結(jié)直腸癌細胞周期阻滯

為分析檸檬精油抑制結(jié)直腸癌細胞增殖的機理,利用western blotting(WB)分析細胞周期相關(guān)蛋白表達情況(圖5-c),結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白Cyclin B1、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1隨檸檬精油質(zhì)量濃度的增加而被顯著下調(diào),表明檸檬精油可導致HCT116、SW620細胞周期發(fā)生阻滯,進而抑制細胞增殖。

2.6.3 檸檬精油促進結(jié)直腸癌細胞自噬

自噬在腫瘤細胞的生長過程中發(fā)揮重要作用,對自噬標志性蛋白進行WB檢測發(fā)現(xiàn)(圖5-d),檸檬精油促進結(jié)直腸癌細胞自噬,可見檸檬精油可以通過促進自噬抑制細胞增殖。

3 結(jié)論與討論

本研究通過超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取萬州尤力克檸檬精油,并通過單因素及響應面確定最佳工藝條件為:液料比12∶1(mL∶g)、蒸餾時間29 min、超聲時間133 min、氯化鈉添加量5.2 g/L,提取率達到2.72%。因氯化鈉溶于水不溶于油,可增大水的極性,且添加氯化鈉后,鹽水的密度增大,加速油層和水層的分離,進而提高了精油的提取率,該工藝方法比肖娟等[22]的水蒸氣蒸餾法的提取率高出0.75%,因此該工藝方法可以視為一種有效的提取方法。GC-MS測定組成成分發(fā)現(xiàn)萬州尤力克檸檬精油中烯類化合物居多,相對含量達62.89%,醇類、醛類、酯類化合物的相對含量次之,這與鄧紅梅等[7]和秦軼等[8]的研究結(jié)果相吻合。

萬州尤力克檸檬精油有較好的DPPH自由基清除能力,與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致[21,23],證明其具有較強的抗氧化能力。已有研究表明檸檬精油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等抑制顯著,其抑菌作用主要是因為醇類、醛類、酚類和萜烯類等化合物的存在[3,24],本研究驗證了檸檬精油對本實驗室現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種受試菌的抑制作用,且發(fā)現(xiàn)對維氏氣單胞菌抑制效果最明顯,表明萬州尤力克檸檬精油同樣具有良好的抑菌活性。

本研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油具有抗多種腫瘤細胞活性,可能是因為含有豐富的烯類化合物,已有研究表明,烯類化合物具有一定的抗腫瘤作用[25]。它們能夠通過阻滯細胞周期,誘導細胞發(fā)生凋亡或自噬等方式來抑制并殺死腫瘤細胞[26]。本研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油通過誘導結(jié)直腸癌細胞阻滯及促進自噬抑制細胞增殖。

綜上所述,通過本研究所優(yōu)化的提取工藝,萬州尤力克檸檬可獲得更高的精油產(chǎn)量,有利于檸檬深加工產(chǎn)品及廢渣的開發(fā)與利用。此外,檸檬精油具有明顯的體外抗腫瘤作用,但還需要用更多技術(shù)指標進行完整的體內(nèi)、體外評價,此方面的研究工作正在深入進行中。