羅威,黃曉月,鐘萍,,陳斯琪,區(qū)家豪,房志家,鄧旗,孫力軍,王雅玲*

1(嶺南師范學院 基礎教育學院,廣東 湛江,524084)2(湛江幼兒師范專科學校,廣東 湛江,524084) 3(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東 湛江,524088)4(廣東省江門市質量計量監(jiān)督檢測所,廣東 江門,529000)

殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)是一種由氨基葡萄糖組成的多糖類物質,聚合度在2～20,具有抗菌、抗氧化等多種生物活性功能[1-4]。殼寡糖可由殼聚糖降解制得,與殼聚糖相比,殼寡糖具有更低的黏度和更高的水溶性,有利于其在食品、藥理學和生物醫(yī)學等領域的廣泛應用[4-8]。本課題組前期對蝦源殼聚糖的酶解工藝進行優(yōu)化,得到高抗氧化活性的殼聚糖酶解物[1],但是該酶解產物包含的殼寡糖分子質量較寬泛,而不同分子質量的殼寡糖抗菌抗氧化活性有較大差異,因此有必要對該酶解產物進行乙醇分級沉淀以得到不同分子質量的殼寡糖,并探究其抗菌抗氧化特性,以提高目標酶解產物的利用率。有較多學者采用乙醇沉淀這一方法對殼寡糖進行提純,舒德海等[9]使用體積分數為75%的乙醇沉淀殼寡糖,得到主要成分為2～4糖的殼寡糖產品;孫婷[10]使用75%和87.5%的乙醇沉淀殼寡糖,分別得到主要聚合度9以上和聚合度7以上的殼寡糖;張青[11]使用體積分數為60%、75.0%、87.5%的乙醇對殼寡糖進行分級沉淀以獲得不同數均分子質量的殼寡糖。綜合前人的研究,本實驗擬采用體積分數為50%、60%、70%的乙醇對目標酶解產物進行分級沉淀,以獲得相應的目標產物。

關于殼寡糖的分子質量與其抗菌抗氧化特性的關系,學者們有不同的見解[5,12-13]。對于抗菌活性,張青[11]認為分子質量小的蠅蛆源殼寡糖抗菌效果更佳,而SNCHEZ等[12]則認為分子質量大的蜘蛛蟹源殼寡糖抗菌效果更好;對于抗氧化活性,普遍認為分子質量小的殼寡糖抗氧化效果更佳[5,11],但也有學者發(fā)現(xiàn)殼寡糖的超氧自由基清除活性隨著分子質量的增加而增加[13],因此,殼寡糖的分子質量與其抗菌抗氧化活性之間的特性與殼寡糖的來源、微生物的種類、抗氧化的指標等息息相關。本課題擬研究蝦源殼寡糖分子質量與其抗菌抗氧化活性之間的相關性,獲得抗菌抗氧化特性良好的優(yōu)選殼寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦源殼聚糖(批號:200820,脫乙酰度>85%),山東海得貝生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(固體,800 u/mg,CAS:9001-73-4),上海瑞永生物科技有限公司;D-鹽酸氨基葡萄糖標準品,中國藥檢;抗壞血酸,Sigma Aldrich公司。

ALYE G3-旋轉蒸發(fā)器,Heidolph公司;LGJ-10型真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;THERMO Varioskan Flash全自動酶標儀,賽默飛世爾科技公司;PHS-3E型pH計,上海雷磁;84-1A磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司。

1.2 四種不同分子質量殼寡糖產品的制備

參照文獻[1]的最優(yōu)酶解條件制備殼聚糖酶解物。將蝦源殼聚糖溶解于醋酸緩沖溶液中,調節(jié)pH值至4.80,按酶底比20%加入木瓜蛋白酶,于48.00 ℃溫度條件下水浴1 h,沸水浴10 min滅酶活,于冰水中快速冷卻,8 000 r/min離心,上清液為殼聚糖酶解物,然后進行真空濃縮,得到殼聚糖酶解物濃縮液。

參照張青[11]的方法進行乙醇分級沉淀。在殼聚糖酶解物濃縮液中加入等體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分數為50%,于4 ℃靜置沉淀6 h,離心分離沉淀和上清液,沉淀為50%乙醇沉淀殼寡糖(COS50)。上清液繼續(xù)加入0.25倍體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分數為60%,4 ℃靜置6 h后離心,沉淀為50%～60%乙醇沉淀殼寡糖(COS60)。上清液繼續(xù)加入0.33倍體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分數為70%,4 ℃靜置6 h后離心,沉淀為60%～70%乙醇沉淀殼寡糖(COS70),上清液為70%乙醇的上清殼寡糖(COS70 s),COS70 s經真空旋蒸后冷凍干燥,其余組分進行冷凍干燥,一共獲得4種殼寡糖產品(COS50、COS60、COS70和COS70 s)。

1.3 四種殼寡糖產品數均分子質量和產量的測定

參照文獻[1]的方法測定4種殼寡糖產品的數均分子質量和產量。

1.4 四種殼寡糖產品抗菌活性的測定

1.4.1 牛津杯法測定4種殼寡糖產品的抑菌圈

參照文獻[14]中的牛津杯法測定4種殼寡糖產品對5種指示菌[大腸桿菌(Escherichiacoli,菌種號:ATCC28922)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis,菌種號:CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,菌種號:ATCC29213)、假單胞菌(Pseudomonas)和希瓦氏菌(Shewanella)(來源于廣東海洋大學水產品質量安全實驗室保藏的南美白對蝦腐敗菌分離株)]的抗菌活性。

1.4.2 試管二倍稀釋法測定4種殼寡糖產品的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)

參照文獻[15]中的二倍試管稀釋法測定4種殼寡糖產品對5種指示菌的MIC。將濃度等于或高于MIC的試管繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸取培養(yǎng)液涂布于固體培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)24 h,觀察平板上有無菌落生長,無菌生長對應的最低濃度為MBC。

1.5 比色法測定4種殼寡糖產品的抗氧化活性

參照文獻[1]的方法測定4種殼寡糖產品的DPPH自由基清除率和總還原力。

1.6 數據分析

采用WPS office對數據進行整理和繪制圖表,采用SPSS 22進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 四種殼寡糖產品的數均分子質量和產量

由于多糖不溶于乙醇,因此將乙醇逐步加入殼聚糖酶解物,殼多糖會逐步沉淀析出,進而得到不同分子質量的殼寡糖[16]。采用乙醇分級沉淀法獲得的4種殼寡糖產品的數均分子質量分別為2 365、2 807、3 105、1 390 Da,產量分別為40.95%、25.28%、12.46%、8.12%(表1)。

表1 四種殼寡糖產品的數均分子質量和產量Table 1 Average molecular weight and yield of four chitosan oligosaccharides

2.2 四種殼寡糖產品的抗菌活性比較

2.2.1 四種殼寡糖產品的抑菌效果

表2顯示4種殼寡糖產品對5種指示菌的抑菌效果。其中殼寡糖產品COS50、COS60、COS70對5種指示菌均有抑菌效果,而COS70 s在實驗濃度下僅對希瓦氏菌有抑菌效果,對其余4種菌則無抑菌效果,表明COS70 s較其余3種殼寡糖的抑菌效果弱。對大腸桿菌,在10.00 mg/mL質量濃度下,COS60的抑菌圈顯著大于COS50和COS70(P<0.05),隨著殼寡糖濃度的降低,3種殼寡糖的抑菌圈大小的差異性減少,抑制效果:COS60>COS50>COS70;對枯草桿菌,COS50和COS60的抑菌效果沒有顯著性差異(P>0.05),但顯著優(yōu)于COS70的抑菌效果(P<0.05);對金黃色葡萄球菌,在殼寡糖質量濃度為2.50 mg/mL時,COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60和COS70(P<0.05),特別是COS50在質量濃度為1.25 mg/mL時仍有抑菌效果,而其余殼寡糖沒有抑菌效果;對假單胞菌,在殼寡糖質量濃度為0.62 mg/mL時,COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60和COS70(P<0.05);對希瓦氏菌,4種殼寡糖產品在質量濃度為0.31 mg/mL濃度下對希瓦氏菌即有抑菌效果,所需濃度遠低于上述4種指示菌,表明殼寡糖對希瓦氏菌有更強的抑制活性,在殼寡糖質量濃度為0.62 mg/mL時,COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60、COS70和COS70 s(P<0.05)。

表2 四種殼寡糖產品的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of four chitosan oligosaccharides

2.2.2 四種殼寡糖的MIC和MBC

表3分別為4種殼寡糖產品對5種指示菌的MIC和MBC,MIC值和MBC值越小,表明該物質的抑菌效果越強。對于大腸桿菌,殼寡糖產品COS50、COS60和COS70的MIC值和MBC值一樣,表明3種殼寡糖對大腸桿菌的抑菌效果一樣強;對于枯草桿菌,COS50和COS60的MIC和MBC值小于COS70,表明這2種殼寡糖的對枯草桿菌的抑菌效果強于COS70;對于金黃色葡萄球菌,COS50的MIC和MBC值小于COS60和COS70,表明COS50對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于其他2種;對于假單胞菌,3種殼寡糖的MIC值一致,但COS50和COS60的MBC值小于COS70,表明COS70對假單胞菌的抑菌效果弱于其他2種殼寡糖;對于希瓦氏菌,4種殼寡糖產品對其均有抑菌效果,其中乙醇沉淀的3種殼寡糖的抑菌效果強于COS70 s。上述結果表明,COS50、COS60和COS70對5種細菌均有抑菌效果,總體而言抑菌效果:COS50>COS60>COS70,即這3種殼寡糖的抑菌活性隨著殼寡糖分子質量的增加而減弱。

表3 四種殼寡糖產品對指示菌的MIC/MBC 單位:mg/mL

2.3 四種殼寡糖產品的抗氧化活性比較

對于DPPH自由基,樣品的IC50值越小表明其對DPPH自由基的抗氧化能力越強,結果表明4種殼寡糖產品對于DPPH自由基的抗氧化能力:COS50>COS70 s>COS60>COS70,其中COS50的抗氧化能力約為COS70 s的1.5倍(圖1)。對于總還原力,COS70 s>COS50>COS60>COS70,其中COS70 s的總還原力約為COS50的2.5倍(圖1)?？傮w而言,4種殼寡糖產品的抗氧化能力強弱排序為:COS70 s>COS50>COS60>COS70,即殼寡糖的抗氧化能力隨著分子質量的增加而減弱。

圖1 四種殼寡糖產品的抗氧化活性比較Fig.1 Comparison of antioxidant activity of four chitosan oligosaccharides

3 討論

殼寡糖是一種堿性多糖,具有抗菌抗氧化等生物活性,多項研究表明殼寡糖的生物活性與其分子質量相關[7]。本研究使用乙醇將目標酶解產物進行分級沉淀,得到4種不同分子質量的殼寡糖(COS50、COS60、COS70、COS70 s),并對其抗菌抗氧化活性進行探究,發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀的3種殼寡糖產品(COS50、COS60、COS70)對5種細菌均有抑制效果,表明這3種殼寡糖對細菌具有廣譜抑菌性,與前人發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑菌多種細菌生長的結果相一致[17];COS70 s(數均分子質量為1 390 Da)在同樣實驗濃度下只對希瓦氏菌有抑制效果,對其余指示菌沒有抑菌效果,這可能是由于該殼寡糖含有的抑菌有效成分較少,研究表明,對于殼1～5糖,聚合度低的殼寡糖抑菌效果更弱,長于六聚體的的殼寡糖抑菌效果更佳[18-19],而COS70 s的數均分子質量與其他3種殼寡糖相比,降低了40%～55%,含有殼6糖以上的抑菌有效成分更低,因此需要更高的濃度才可達到抑制菌種生長的效果,這也是該殼寡糖在相同實驗濃度下對某些實驗菌種沒有抑菌活性的原因。

乙醇沉淀的3種殼寡糖對5種指示菌均有抑菌效果,從MIC值上看,抑菌效果:COS50>COS60>COS70,即殼寡糖的抑菌活性隨著殼寡糖分子質量的增加而減弱,這與張青[11]認為分子質量小的殼寡糖抑菌活性更強的結論相一致,這可能是由于較低分子質量的殼寡糖除了能在細菌細胞膜的負電荷成分結合外,還能夠進入細菌細胞內,吸附DNA,阻斷RNA轉錄和蛋白質合成,從而達到抗菌的效果[3,20]。

殼寡糖的來源對其抗菌活性也有影響。張青[11]對蠅蛆殼聚糖酶解液進行乙醇分級沉淀,發(fā)現(xiàn)70.0%～87.5% EP-COS(數均分子質量為1 093 Da)對大腸桿菌的抑制效果最好,pH=5.0條件下的MIC為5 mg/mL。COS50(數均分子質量為2 365 Da)的分子質量比70.0%～87.5% EP-COS大,理論上其對大腸桿菌的抗菌活性會比它弱,但本研究卻發(fā)現(xiàn)其在pH=7.0條件下的MIC僅為2.5 mg/mL,說明蝦源殼寡糖的抑菌效果更好。

對于抗氧化活性,本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖的總還原力隨著分子質量的增加而減弱(COS70 s>COS50>COS60>COS70),與前人的研究結論一致[5,11,17],出現(xiàn)這種規(guī)律可能是由于較高的分子質量的殼寡糖具有更強的分子內氫鍵,導致結構更緊湊,進而削弱了羥基和氨基的活性,限制了它們的還原能力[17]。對于殼寡糖的自由基清除能力,本研究發(fā)現(xiàn)COS50>COS70 s>COS60>COS70,有人認為是不穩(wěn)定的自由基與殼寡糖的氨基和羥基反應形成相對穩(wěn)定的自由基[21],進而起到清除自由基的作用;由此可見殼寡糖的氨基和羥基外展的越多,清排自由基能力越強,一般認為分子質量越小,裸露的氨基和羥基越多。但本研究發(fā)現(xiàn),分子質量小的COS70 s比分子質量大的COS50對DPPH自由基的清除能力弱,可能是由于COS70 s中存在徹底降解的單糖(氨基葡萄糖),能與自由基有效結合的氨基和羥基減少,表現(xiàn)出抗氧化性更強的殼寡糖有效成分更少,本研究結果進一步說明殼寡糖的功能并不是簡單認為分子質量越小越優(yōu)。

本研究所用的木瓜蛋白酶與底物比為1∶5,酶的用量過大,酶解產物中可能存在木瓜蛋白酶自身水解產生的蛋白肽。但是,迄今為止沒有關于木瓜蛋白酶分解得到的多肽具有抗菌抗氧化活性的任何佐證,而且若存在多肽,在乙醇沉淀過程中多肽也會析出,特別是本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低,蛋白質水解更嚴重,若分解出的多肽存在抗氧化活性,那么pH越小,水解出來的產物抗氧化能力應該更強,但試驗結果卻表明,在pH 4.8時酶解所得產物抗氧化活性更強[1],這也間接說明了木瓜蛋白酶酶解法制備殼聚糖的抗菌抗氧化活性與酶自身水解的蛋白肽無關。

本研究對具有自主知識產權的4種殼寡糖產品進行抗菌抗氧化活性研究,發(fā)現(xiàn)數均分子質量適中的殼寡糖抑菌效果更強(抗菌效果排序為:COS50>COS60>COS70>COS70 s);殼寡糖的抗氧化能力隨著數均分子質量的增加而減弱(抗氧化效果排序為:COS70 s>COS50>COS60>COS70);綜合考慮抗菌抗氧化效果,認為COS50(數均分子質量為2 365 Da)為同時擁有抗菌抗氧化性能的優(yōu)選殼寡糖。本研究可為蝦源殼寡糖的開發(fā)應用提供理論參考。