張振東,李學(xué)富,肖秋楊,詹捷,趙慧君,郭壯,王玉榮*

1(黔南民族師范學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院,貴州 都勻,558000) 2(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽(yáng),441053) 3(湖北文理學(xué)院,乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 襄陽(yáng),441053)

乳酸菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性,過(guò)氧化氫酶一般呈陰性,形態(tài)包含球形或者桿狀的微生物菌群,它們能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸。如果是同型發(fā)酵乳酸菌,則以乳酸為主要產(chǎn)物,如果是異型發(fā)酵乳酸菌,除了乳酸外還能產(chǎn)生乙酸或酒精、CO2[1]。因此,富含乳酸菌的發(fā)酵食品如鲊廣椒和泡菜等都有濃郁爽口的酸味。一些乳酸菌被公認(rèn)為安全的(Generally Recognized as Safe,GRAS),可以用于發(fā)酵食品的制作。目前應(yīng)用較多的有植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、發(fā)酵粘液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)等[2]。我國(guó)有許多具有民族特色的發(fā)酵蔬菜,它們往往通過(guò)自然發(fā)酵方式制成,未添加人工發(fā)酵劑,因此發(fā)酵過(guò)程中的微生物往往來(lái)自制作環(huán)境以及制作原料。鲊廣椒就是這類(lèi)發(fā)酵食品中的代表,其原料中含有豐富的碳水化合物,并且制作過(guò)程往往處于缺氧狀態(tài),因此微生物菌群組成極為復(fù)雜,且其優(yōu)勢(shì)菌群往往為乳酸菌[3]。

鲊廣椒又叫鲊?yán)苯?鲊海椒,在我國(guó)重慶、湖北、湖南等多個(gè)省區(qū)被制作和食用。不同地區(qū)的鲊廣椒受到制作工藝和環(huán)境的影響,其滋味和氣味有所差別。但是研究發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)的鲊廣椒中均富含乳酸菌,包括伴生乳桿菌屬(Companilactobacillus)、乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、促生乳桿菌屬(Levilactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)等優(yōu)勢(shì)菌屬,可能還含有一些特異的菌群,且不同地區(qū)乳酸菌的比例有所不同[4-6]。重慶地區(qū)簡(jiǎn)稱(chēng)“渝”,位于青藏高原與長(zhǎng)江中下游平原過(guò)渡地帶的長(zhǎng)江上游地區(qū)。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn),重慶巫山和奉節(jié)地區(qū)的鲊廣椒目前仍然保留著固態(tài)自然發(fā)酵,不接種發(fā)酵劑,發(fā)酵原料和容器不消毒殺菌的特點(diǎn)。由于不同地區(qū)的鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)受制作原料與環(huán)境影響而存在差異,因此,該地區(qū)鲊廣椒可能蘊(yùn)藏著豐富多樣的乳酸菌資源,且可能含有一些特異的菌群。

近年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,以Illumina HiSeq為代表的高通量測(cè)序技術(shù)成本不斷下降,測(cè)序通量不斷提高,且該技術(shù)準(zhǔn)確度與精確度均較高,測(cè)序周期短,能規(guī)避分離鑒定方法受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件限制的短板[7],因此,被廣泛的應(yīng)用到包括食品在內(nèi)的各個(gè)領(lǐng)域的科學(xué)研究中。但是如果想要研究發(fā)酵食品中某種微生物的發(fā)酵特性或者開(kāi)發(fā)菌種資源,還需要結(jié)合分離鑒定方法。因此,本研究從重慶市奉節(jié)和巫山縣收集了自然發(fā)酵制作的鲊廣椒樣品,通過(guò)高通量測(cè)序方法分析其微生物多樣性,同時(shí)結(jié)合分離鑒定方法從收集的樣品中分離、純化和鑒定乳酸菌,以期為鲊廣椒產(chǎn)業(yè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐以及乳酸菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒樣品:從重慶市奉節(jié)和巫山地區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分別采集6個(gè)鲊廣椒樣品(不同樣品由不同家庭制作),編號(hào)分別為FJ1～6與WS1～6,后續(xù)分析分別將兩個(gè)地區(qū)的樣品標(biāo)記為FJ和WS。所采集的鲊廣椒樣品滋味和氣味均正常,無(wú)腐敗味。每個(gè)樣品收集200 g左右,分成2份,分別裝入無(wú)菌樣品袋,放入保溫箱迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,其中一份放入-70 ℃冰箱,用于高通量測(cè)序,另一份立即用于乳酸菌的分離與純化。

試劑和耗材:引物338F和806R(引物338帶有樣品特異性標(biāo)簽),上海桑尼生物科技有限公司;dNTPs Mix和DNA聚合酶Ex PremierTMDNA Polymerase,寶生物工程大連有限公司;E.Z.N.A.?food DNA試劑盒,美國(guó)Omega Bio-tek公司;GK1072細(xì)菌總DNA提取試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EDC-810型黑金剛基因擴(kuò)增儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)和DYY-6C型電泳儀電源,北京六一生物科技有限公司;K5800H自動(dòng)檢測(cè)超微量分光光度計(jì),北京凱奧科技發(fā)展有限公司;HITACHI CT 4D高速離心機(jī),日本日立公司;OxoidTMAG0025A厭氧罐,賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序

首先使用試劑盒E.Z.N.A.?food DNA對(duì)鲊廣椒中總DNA進(jìn)行提取,并檢測(cè)提取的DNA含量與純度后,參照GUO等[8]方法對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后,將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,基于Illumina HiSeq 4000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,確保每個(gè)樣品的測(cè)序量超過(guò)5萬(wàn)個(gè)tags。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

高通量測(cè)序后的下游分析使用QIIME v1.9.0[9]進(jìn)行。參照GUO等[6]的方法,首先對(duì)雙末端測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控和雙末端序列的合并,然后按照97%的閾值劃分分類(lèi)操作單元(operational taxonomic unit,OTU)[10]。隨后使用RDP分類(lèi)器[11]基于最新的數(shù)據(jù)庫(kù)v2.1.3(https://github.com/rdpstaff/classifier)進(jìn)行物種注釋。使用QIIME自帶腳本計(jì)算鲊廣椒樣品的α多樣性指數(shù),使用vegan分析鲊廣椒樣品的β多樣性,最后提取門(mén)和屬的分類(lèi)單元相對(duì)含量,使用威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析。最后,使用使用在線(xiàn)服務(wù)器分析(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)的線(xiàn)性判別分析效應(yīng)值(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)[12]分析地區(qū)間鲊廣椒的生物標(biāo)志物,分析中線(xiàn)性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值設(shè)置為3.0[12]。

1.3.3 乳酸菌的分離

乳酸菌屬于微好氧菌,通過(guò)設(shè)置微好氧條件對(duì)鲊廣椒中的乳酸菌進(jìn)行分離[13]。參照GUO等[8]的方法進(jìn)行乳酸菌的分離,首先進(jìn)行梯度稀釋:稱(chēng)取10 g鲊廣椒樣品與90 mL無(wú)菌生理鹽水充分混合均勻,為10-1樣品稀釋液。后續(xù)使用裝有無(wú)菌生理鹽水(0.85 g/L)的試管進(jìn)行梯度稀釋,每次稀釋10倍,最后取10-3～10-6的樣品稀釋液均勻涂布到提前倒好,且表面干燥的MRS平板(含1%碳酸鈣),最后放入?yún)捬豕拗?設(shè)置溫度為30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。厭氧罐通過(guò)厭氧產(chǎn)氣袋除去其中的多數(shù)O2,保持微好氧環(huán)境。待菌落長(zhǎng)好后,挑取具有透明圈的典型菌落,同樣使用MRS培養(yǎng)基劃線(xiàn)純化。將純菌進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢以及過(guò)氧化氫酶檢測(cè)后,使用含有25%甘油的MRS液體培養(yǎng)基重懸,保存到-70 ℃冰箱待用。

1.3.4 乳酸菌的鑒定

基于細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行菌株鑒定。將純化過(guò)的待鑒定菌活化后,收集菌體,使用GK1072細(xì)菌總DNA提取試劑盒進(jìn)行提取后,作為模板,使用引物27F和1495R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因[14]。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆:先將PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10 感受態(tài)細(xì)胞,使用含氨芐青霉素鈉(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆子,并對(duì)克隆子使用引物M13-47和/M13-48進(jìn)行PCR驗(yàn)證后,送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。待序列返回后,將雙端測(cè)序結(jié)果合并,并去掉引物和載體序列,在NCBI與模式菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得待鑒定菌的分離信息。使用待鑒定菌的16S rRNA序列與通過(guò)Blastn匹配到的模式菌序列使用Mafft v7.475比對(duì)(https://github.com/GSLBiotech/mafft),然后使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[15],以確定分離到的微生物的系統(tǒng)分類(lèi)地位。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

組間分類(lèi)單元相對(duì)含量的統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)(Wilcoxon test)使用R包ggpubr完成(https://cran.r-project.org/web/packages/ggpubr/);數(shù)據(jù)清洗使用tidyverse包(https://github.com/tidyverse)完成;文中作圖使用R軟件包ggpubr或者ggplot(https://github.com/tidyverse/ggplot2)或者origin v8.5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲊廣椒微生物多樣性分析

使用Illumina Hiseq平臺(tái)測(cè)序技術(shù)對(duì)采集自重慶市巫山縣和奉節(jié)縣的鲊廣椒樣品細(xì)菌V3～V4區(qū)域進(jìn)行了雙端測(cè)序。對(duì)雙端測(cè)序基于重疊區(qū)進(jìn)行了組裝,在過(guò)濾掉低質(zhì)量序列后,共得到441 218個(gè)高質(zhì)量序列。按照97%的分類(lèi)閾值,將這些序列共分成3 060個(gè)OTU。隨機(jī)提取代表性序列進(jìn)行注釋后,共得到19個(gè)細(xì)菌門(mén),35個(gè)細(xì)菌綱,67個(gè)細(xì)菌目,149個(gè)細(xì)菌科和324和細(xì)菌屬。相對(duì)來(lái)說(shuō),奉節(jié)地區(qū)的分類(lèi)單元數(shù)量小于巫山地區(qū)(表1)。

隨機(jī)抽取每個(gè)樣品的29 010個(gè)序列,使用QIIME分析平臺(tái)自帶腳本計(jì)算了兩個(gè)地區(qū)的α多樣性指數(shù),包括Chao1指數(shù),發(fā)現(xiàn)物種指數(shù)(observed species index),香濃指數(shù)(Shannon index)與辛普森指數(shù)(Simpson index),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。重慶市巫山和奉節(jié)兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒樣品,無(wú)論是豐富度還是多樣性均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 奉節(jié)和巫山地區(qū)鲊廣椒樣品序列與微生物多樣性Table 1 Sequence abundance and microbial diversity of zha-chili samples from Fengjie and Wushan County

圖1 奉節(jié)和巫山鲊廣椒α多樣性分析Fig.1 Analysis of α diversity of zha-chili that collected from Fengjie and Wushan County

另外,為進(jìn)一步分析來(lái)自重慶市兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒樣品之間的關(guān)系,還進(jìn)行了β-多樣性分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。無(wú)論是基于布雷柯蒂斯距離(Bray-Curtis Distance)還是歐式距離(Euclidean Distance),PCoA1和PCoA2均能解釋50%以上的總體變量,因此β多樣性結(jié)果能很好的反映樣品之間的關(guān)系。此外,基于兩種距離的結(jié)果都顯示,來(lái)自巫山和奉節(jié)兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒樣品在圖中交疊較少,基本是分別各自聚集在一起,顯示出兩個(gè)地區(qū)之間的鲊廣椒樣品菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。

A-布雷柯蒂斯(Bray-Curtis Distance)的PCoA圖; B-基于歐氏距離(Euclidean Distance)的PCoA圖圖2 奉節(jié)和巫山地區(qū)鲊廣椒樣品β多樣性分析Fig.2 CoA analysis of zha-chili samples from Fengjie and Wushan County

2.2 鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)分析

提取各樣品門(mén)與屬兩個(gè)水平的物種組成,對(duì)重慶市兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較與分析,將菌群相對(duì)含量>1%的物種定義為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。提取到的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)菌屬如圖3所示。由圖3-A可知,重慶鲊廣椒樣品共檢測(cè)到4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén),分別是厚壁菌門(mén)(Firmicutes,82.09%),變形菌門(mén)(Proteobacteria,8.54%),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes,6.94%),放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria,1.45%)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明,厚壁菌門(mén)在奉節(jié)鲊廣椒的相對(duì)含量顯著高于巫山鲊廣椒(P<0.01),與之相反的是,另一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)擬桿菌門(mén)在在奉節(jié)鲊廣椒的相對(duì)含量顯著低于巫山鲊廣椒(P<0.01),而其他兩個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒中無(wú)顯著差異(P>0.05)。

進(jìn)一步的,在屬水平上分析了兩個(gè)地區(qū)來(lái)源的鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)(圖3-B)。結(jié)果顯示,共檢測(cè)到11個(gè)優(yōu)勢(shì)屬,分別是乳桿菌屬(Lactobacillus,25.69%),促生乳桿菌屬(Levilactobacillus,17.50%),遲緩乳桿菌屬(Lentilactobacillus,9.68%),伴生乳桿菌屬(Companilactobacillus,8.03%),魏斯氏菌屬(Weissella,6.11%),普雷沃菌屬(Prevotella,5.93%),乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus,4.08%),克雷伯菌屬(Klebsiella,3.03%),肇源腐敗乳桿菌(Loigolactobacillus,2.66%),粘液乳桿菌屬(Limosilactobacillus,1.38%)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium,1.06%)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析將兩個(gè)地區(qū)的菌群進(jìn)行比較,僅優(yōu)勢(shì)屬中的普雷沃菌屬在兩個(gè)地區(qū)間的相對(duì)含量存在顯著差異(P<0.05):該屬在巫山鲊廣椒中相對(duì)含量顯著較高。促生乳桿菌屬普遍存在于多個(gè)地區(qū)的鲊廣椒中[4-6,16],研究顯示,重慶地區(qū)鲊廣椒中相對(duì)含量最為豐富的3個(gè)優(yōu)勢(shì)屬之一——促生乳桿菌可能與鲊廣椒的滋味品質(zhì)密切相關(guān)。GUO等[6]研究表明,促生乳桿菌屬促進(jìn)了鲊廣椒酸味酸味,并與鲊廣椒的豐厚度和后味B呈負(fù)相關(guān)。另外,值得注意的是,貴州松桃和湖南懷化鲊廣椒富含伴生乳桿菌,而重慶鲊廣椒中該屬相對(duì)含量較少。另外,貴州和湖南鲊廣椒中富含泛菌屬(Pantoea),而該屬在重慶鲊廣椒中的相對(duì)含量低于1%。另個(gè)一個(gè)隸屬于變形菌門(mén)的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)被檢測(cè)出相對(duì)含量超過(guò)了1%,而該屬在貴州與湖南鲊廣椒中的相對(duì)含量低于1%。這些分析表明,盡管不同地區(qū)的鲊廣椒物種組成相近,但是菌群組成的相對(duì)含量具有差異,且不同地區(qū)有一些特有的優(yōu)勢(shì)菌群。

另外,為尋找能區(qū)分這兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒的生物標(biāo)志物,使用LEfSe進(jìn)行了進(jìn)一步分析。如圖4所示,除了普雷沃菌屬以外,另外還有5個(gè)非優(yōu)勢(shì)屬在巫山鲊廣椒樣品中顯著富集,分別是Cutibacterium,梭菌屬(Clostridium),熱單胞菌屬(Thermomonas),青枯菌屬(Ralstonia)和另枝菌屬(Alistipes);此外,在奉節(jié)縣鲊廣椒中富集的微生物有塔特姆菌屬(Tatumella)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)。由于普雷沃菌屬和塔特姆菌屬的LDA值最高,因此可以分別作為巫山和奉節(jié)鲊廣椒的生物標(biāo)志屬。而乳桿菌科與乳桿菌目在奉節(jié)鲊廣椒中的顯著富集,也是厚壁菌門(mén)富集的直接原因。

A-優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén);B-優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬圖3 奉節(jié)和巫山鲊廣椒優(yōu)勢(shì)微生物平均相對(duì)含量組成Fig.3 Average relative abundance of dominant microbial taxa of zha-chili samples from Fengjie and Wushan County

此外,普雷沃菌為革蘭氏陰性桿菌,能定植在人類(lèi)口腔和腸道,其部分種與人類(lèi)疾病有關(guān),屬于條件致病菌;但是也有一些普雷沃菌能預(yù)防牛瘤胃酸中毒,對(duì)牲畜養(yǎng)殖有益[17]。然而,很少在發(fā)酵食品中檢測(cè)到普雷沃菌屬。有研究表明,普雷沃菌能表達(dá)與植物衍生多糖降解相關(guān)的酶[18],如外切-β-1,4-木聚糖酶、木聚糖-1,4-β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等,這可能是該屬菌群能在重慶地區(qū)鲊廣椒中存活的一個(gè)原因。盡管梭菌屬在鲊廣椒中的相對(duì)含量未超過(guò)1%,但是其在巫山鲊廣椒中顯著富集,且反映其富集程度的LDA值大于3.5。梭菌屬由革蘭氏陽(yáng)性、嗜溫和厭氧的菌種組成,一些種具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用,一些種還在工業(yè)過(guò)程中有應(yīng)用,涉及生物氫、丙酮、生物丁醇、生物燃料等的生產(chǎn)[19]。部分梭菌種如艱難梭菌、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌,也在一些食品環(huán)境檢出中;還有一些梭菌種對(duì)食品風(fēng)味有益,如一些梭菌與白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)前體己酸形成有關(guān)[20]。然而,限于所用技術(shù),本研究未能在種水平上對(duì)普雷沃菌屬和梭菌屬的菌群組成進(jìn)行分析。

2.3 鲊廣椒菌群功能分析

使用PICRUSt2軟件包基于蛋白質(zhì)COG數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)重慶鲊廣椒的微生物菌群功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果如圖5所示,發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)到的菌群COGs分別屬于26個(gè)功能大類(lèi)。一般來(lái)說(shuō),發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)與碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸的代謝有關(guān)。本研究注釋到屬于J(翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生)、E(氨基酸運(yùn)輸和代謝)和G(碳水化合物的運(yùn)輸和代謝)的COGs類(lèi)別豐度最高,表明采集到的鲊廣椒樣品中菌群的氨基酸與糖類(lèi)代謝活性較強(qiáng),很可能這些菌群通過(guò)氨基酸與糖類(lèi)的代謝形成了鲊廣椒的氣味與滋味物質(zhì)。與之相反,菌群屬于其他類(lèi)別的COGs豐度較低。

A-LDA得分圖;B-進(jìn)化分支圖圖4 基于LEfSe的奉節(jié)和巫山鲊廣椒生物中 生物標(biāo)志物分析Fig.4 Biomarker of zha-chili from Fengjie and Wushan County based on LEfSe analysis

2.4 乳酸菌分離與鑒定

微好氧條件下,通過(guò)MRS固體培養(yǎng)基,從重慶兩個(gè)地區(qū)的12個(gè)鲊廣椒樣品共分離到18株菌。經(jīng)劃線(xiàn)純化、革蘭氏染色與鏡檢,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)呈球形或者橢球型共有5株,而細(xì)胞形態(tài)呈桿狀或者短桿狀的菌株有13株。鏡檢結(jié)果顯示,所有分離得到的菌株均為革蘭氏陽(yáng)性。進(jìn)一步通過(guò)16S rRNA基因序列分析對(duì)分離到的18株菌株進(jìn)行了鑒定,并基于獲得16S rRNA基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知,分離到的18株菌被鑒定為8個(gè)屬,分別為伴生乳桿菌屬,包含3株食品伴生乳桿菌(Companilactobacillusalimentarius);乳植物桿菌屬,包括1株斯特拉斯堡乳植物桿菌(Lactiplantibacillusargentoratensis)和3株植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum);遲緩乳桿菌屬,包括1株布氏遲緩乳桿菌(Lentilactobacillusbuchneri);明串珠菌屬(Leuconostoc),共3株腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides);促生乳桿菌屬,包括2株短促生乳桿菌(Levilactobacillusbrevis);片球菌屬(Pediococcus),包括1株戊糖片球菌(Pediococcusacidilactici);葡萄球菌屬(Staphylococcus),包括1株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus);魏斯氏菌屬,包括1株希臘魏斯氏桿菌(Weissellahellenica)和2株泰國(guó)魏斯氏菌(Weissellathailandensis)。因此,基于16S rRNA的分子鑒定表明,所分離到的18株菌均為乳酸菌。

結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果和分離鑒定方法獲得的乳酸菌菌群結(jié)果,可以將重慶地區(qū)含量最高的3個(gè)優(yōu)勢(shì)屬中的兩個(gè)鑒定為短促生乳桿菌和布氏遲緩乳桿菌,遺憾的是,未分離到屬于另一個(gè)相對(duì)含量最高的屬(乳桿菌屬)的菌株。隸屬于相對(duì)含量最高的3個(gè)屬的乳酸菌同樣也出現(xiàn)在貴州松桃縣和湖南懷化的鲊廣椒中[6]。不同的是,貴州松桃和湖南懷化鲊廣椒中促生乳桿菌還包括副短促生乳桿菌(Levilactobacillusparabrevis)和昂仁促生乳桿菌(Levilactobacillusangrenensis),而遲緩乳桿菌屬還包括了類(lèi)谷糠遲緩乳桿菌(Lentilactobacillusparafarraginis),未在重慶鲊廣椒中分離得到這些菌;同樣的,在重慶鲊廣椒及貴州和湖南鲊廣椒中,均未分離到隸屬于乳桿菌屬的乳酸菌。

值得注意的是,在重慶鲊廣椒樣品中還分離到了一株可用于食品加工的葡萄球菌屬菌株木糖葡萄球菌。該類(lèi)微生物不運(yùn)動(dòng),不產(chǎn)孢,過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性,屬于兼性厭氧菌。該類(lèi)菌可在常見(jiàn)的發(fā)酵肉制品如香腸中檢測(cè)到,被認(rèn)為能產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶,因此能將原料中的蛋白質(zhì)和脂肪降解產(chǎn)生氨基酸和游離脂肪酸,并進(jìn)一步代謝產(chǎn)生一些小分子風(fēng)味物質(zhì)[21]。添加木糖葡萄球菌作為發(fā)酵劑制作的香腸,其pH顯著降低,硬度和咀嚼型增加,質(zhì)構(gòu)和色澤得到改善,因此該類(lèi)菌是目前商業(yè)肉品發(fā)酵劑中的常用菌種[22],然而,該類(lèi)菌在植物基的發(fā)酵食品中較為少見(jiàn)。

A- RNA加工和修飾;B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué);C-能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換;D-細(xì)胞周期控制,細(xì)胞分裂,染色體分割;E-氨基酸運(yùn)輸和代謝; F-核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;G-碳水化合物的運(yùn)輸和代謝;H-輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;I-脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝;J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生;K-轉(zhuǎn)錄; L-復(fù)制、重組和修復(fù);M-細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生;N-細(xì)胞能動(dòng);O-翻譯后修飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),伴侶蛋白;P-無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;Q-次生代 謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝;R-一般功能預(yù)測(cè)預(yù)測(cè);S-未知功能;T-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;U-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸;V- 防御機(jī)制 W-外細(xì)胞結(jié)構(gòu);X-原噬菌體,轉(zhuǎn)座子;Y-細(xì)胞核結(jié)構(gòu);Z-細(xì)胞骨架圖5 奉節(jié)和巫山地區(qū)不同來(lái)源鲊廣椒菌群功能差異分析Fig.5 Functional analysis of zha-chili flora from Fengjie and Wushan County

圖6 奉節(jié)和巫山鲊廣椒來(lái)源乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from zha-chili from Fengjie and Wushan County

3 結(jié)論

重慶地區(qū)巫山縣與奉節(jié)縣來(lái)源的鲊廣椒富含乳酸菌,優(yōu)勢(shì)屬為乳桿菌屬、促生乳桿菌屬和遲緩乳桿菌屬等11個(gè)菌屬,其中普雷沃菌屬和塔特姆菌屬分別在巫山和奉節(jié)鲊廣椒中富集,因此可以分別用來(lái)區(qū)分這兩個(gè)地區(qū)的鲊廣椒樣品。通過(guò)分離鑒定方法得到的18株菌均被鑒定為乳酸菌,它們包括伴生乳桿菌屬、乳植物桿菌屬和遲緩乳桿菌屬等。結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)與分離鑒定方法,可將重慶地區(qū)鲊廣椒的優(yōu)勢(shì)屬鑒定為短促生乳桿菌和布氏遲緩乳桿菌,前者屬于能在食品加工中使用的乳酸菌菌種?？偟膩?lái)看,重慶地區(qū)自然發(fā)酵制作的鲊廣椒中乳酸菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),但是也含有有害菌如克雷伯氏菌。本研究預(yù)期能為鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供菌株資源與數(shù)據(jù)支撐。