羅文珊,杜曉儀,徐玉娟*,吳繼軍,余元善,李璐*
1(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室, 廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州, 510610)2(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌,330000)
遲菜心是以花薹為主食部分的葉菜,是菜心的一種,屬于十字花科蕓薹屬,產(chǎn)自中國廣州。遲菜心含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等多種營養(yǎng)成分,具有“菜心之冠”的美譽,長期食用遲菜心可起到清除腸道毒素、改善便秘、預(yù)防腸癌、增強身體免疫力等功效[1-2]。但目前遲菜心只取花薹部位食用,菜葉、菜梗和菜頭等副產(chǎn)物則被廢棄,不僅會造成資源的浪費,還會污染環(huán)境[3-4]。微生物發(fā)酵是果蔬副產(chǎn)物加工最常用的方法之一。將遲菜心副產(chǎn)物經(jīng)微生物發(fā)酵,研制健康安全型發(fā)酵蔬菜,在保留遲菜心副產(chǎn)物本身所含有的豐富營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上,為遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵制品增添多種功能因子并賦予其更豐富的風(fēng)味,既能提高遲菜心副產(chǎn)物的附加值,又能減少資源浪費和環(huán)境污染。
泡菜是我國傳統(tǒng)食品之一,歷史悠久,含有豐富的有機酸、維生素、氨基酸等生物活性成分,因其口感爽脆、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)價值高而深受消費者喜愛[5-6]。利用蔬菜表面的微生物進行自然發(fā)酵是制作泡菜的傳統(tǒng)方法,至今仍被廣泛使用[7]。然而,在自然發(fā)酵過程中,各種微生物的生長容易導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量差異,進而影響泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8-9]。目前,某些乳酸菌作為發(fā)酵劑在泡菜中的應(yīng)用已引起人們的關(guān)注,使用發(fā)酵劑可以縮短發(fā)酵周期,控制產(chǎn)品質(zhì)量并改善風(fēng)味[10]。
乳酸菌是泡菜發(fā)酵中的主導(dǎo)微生物,對泡菜的質(zhì)量、風(fēng)味和口感起著關(guān)鍵作用[11]。有研究表明,不同發(fā)酵原料適宜的乳酸菌發(fā)酵劑具有差異性,LEE 等[12]發(fā)現(xiàn)PK08短乳桿菌可以作為發(fā)酵劑來提高Napa卷心菜的安全性。WANG等[13]研究顯示經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的芥菜塊莖具有更好的風(fēng)味、質(zhì)地和安全性。盧宏皓等[14]認(rèn)為檸檬明串珠菌可以快速啟動竹筍發(fā)酵,發(fā)酵產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量更低。為了生產(chǎn)高品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品,有必要選擇適宜的菌種作為發(fā)酵劑。然而目前尚未有關(guān)于遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵菌株的研究報道。因此,本研究以腸膜明串珠菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌作為發(fā)酵劑,綜合比較不同乳酸菌發(fā)酵遲菜心副產(chǎn)物過程中活菌數(shù)、理化性質(zhì)和揮發(fā)性成分的差異,挖掘出適宜遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵的乳酸菌,旨在為高品質(zhì)遲菜心副產(chǎn)物泡菜的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
遲菜心副產(chǎn)物來自于廣東廣州市增城區(qū)遲菜心種植基地;食鹽、白糖,市售;腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)Z3、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)M25、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)F11、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) S1、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)G9為實驗室自有菌株。其中,腸膜明串珠菌Z3、嗜酸乳桿菌F11、植物乳桿菌S1、發(fā)酵乳桿菌G9均從泡菜中分離獲取,干酪乳桿菌M25從發(fā)酵乳制品中分離獲取。
葡萄糖、乳酸、乙酸、癸酸乙酯,上海源葉生物有限公司;MRS肉湯和MRS瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱有限公司;亞硝酸鈉,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD無菌操作臺,蘇州安康空氣技術(shù)有限公司;PB-10型pH計,德國Sartorius公司;WF-A2000榨汁機,美的集團公司;Biofuge Stratos Sorvall高速冷凍離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;高效液相色譜儀和UV1800紫外分光光度計,日本島津公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州金壇精達儀器制造有限公司;7890-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent科技公司;DF-101S集熱式磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器有限公司。
取-80 ℃冰箱保藏的5株乳酸菌(腸膜明串珠菌Z3、干酪乳桿菌M25、嗜酸乳桿菌F11、植物乳桿菌S1、發(fā)酵乳桿菌G9)分別于MRS固體培養(yǎng)基中劃線,然后于37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取各乳酸菌的單菌落分別接種于MRS液體培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)16 h,再按0.5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加到MRS液體培養(yǎng)基進行二次活化,作為各乳酸菌發(fā)酵劑的活化種子液。
準(zhǔn)備含有3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))糖的無菌水,遲菜心副產(chǎn)物清洗干凈后切成小段(5~7 cm),放入沸水中熱燙1 min,取出后瀝干水分,將遲菜心副產(chǎn)物和鹽水以1∶2(質(zhì)量比)的比例浸泡在泡菜罐中。將活化好的5種乳酸菌分別接入泡菜中,使各實驗組的初始乳酸菌數(shù)為7.00 lg CFU/mL左右,并以自然發(fā)酵為對照組,30 ℃密封發(fā)酵15 d。在遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵的第0、1、2、3、6、9、12、15天取樣后打漿,并保存在-20 ℃進行后續(xù)分析。
乳酸菌數(shù):取發(fā)酵液,參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗測定》中平板計數(shù)法測定。
pH值和總酸:pH值用pH計法直接測定發(fā)酵液,總酸則參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》。
還原糖:參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》的3,5-二硝基水楊酸法。
亞硝酸鹽:參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的分光光度法。
有機酸的測定:參照YU 等[15]的方法略作修改。取0.5 g泡菜漿,加入1.5 mL 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的偏磷酸溶液,超聲提取20 min,以12 000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm水相濾膜后,采用HPLC分析,色譜條件如下:C18(WondaSil 4.6 mm×250 mm)色譜柱,柱溫30 ℃,檢測波長210 nm,流動相0.1 mol/L的磷酸氫二銨溶液(pH=2.7),流速為1 mL/min,進樣量10 μL;檢測器為二極管陣列檢測器。
揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定:1)頂空固相微萃取:取5 g泡菜勻漿于20 mL頂空瓶中,加入10 μL 100 mg/L的癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物,用螺旋蓋密封頂空瓶并置于50 ℃水浴鍋中平衡10 min后,將老化完全的萃取頭插入頂空瓶內(nèi)萃取40 min,隨后取出萃取頭插至GC-MS進樣口,解析5 min并同時采集數(shù)據(jù);2)GC-MS條件:采用羅文珊等[16]的方法測定。
每個實驗3組平行,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗數(shù)據(jù)運用Excel 2021整理,IBM SPSS Statistics 20的Duncan’s multiple range tests進行方差分析,Origin2021作圖;GC-MS定性定量通過NIST譜庫檢索和解析,以匹配度>85%的物質(zhì)進行定性分析,采用內(nèi)標(biāo)法對各揮發(fā)性物質(zhì)定量。
如圖1所示,5種乳酸菌均能在遲菜心副產(chǎn)物泡菜體系中較好的生長。自然發(fā)酵組的初始乳酸菌數(shù)為2.96 lg CFU/mL,而其他實驗組由于接種乳酸菌所以初始活菌數(shù)較高(6.58 lg CFU/mL~7.03 lg CFU/mL)。在0~1 d內(nèi)所有實驗組乳酸菌處于對數(shù)期,活菌數(shù)急劇增加,接種組發(fā)酵1 d后乳酸菌數(shù)出現(xiàn)輕微的下降后在第6天進入一個維持波動但相對穩(wěn)定的階段,而自然發(fā)酵組在發(fā)酵第2天后才開始下降,第9天進入穩(wěn)定期,與先前的研究一致[17-18]。這可能是由于乳酸菌的急劇增加導(dǎo)致pH值快速降低,進而抑制乳酸菌的生長[19]。從圖1還可發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌S1組和發(fā)酵乳桿菌G9組在整個發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)均處于較高水平,而其發(fā)酵體系的pH值均維持在較低水平,表明這兩株菌較其他乳酸菌具有更強的耐酸能力[20]。
圖1 遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程乳酸菌數(shù)的變化Fig.1 Changes in the number of lactic acid bacteria during the fermentation of Chicaixin by-products
pH值和總酸會影響微生物的生長和代謝,是泡菜發(fā)酵過程中的重要指標(biāo)[21]。遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程中pH和總酸的變化情況如圖2所示。由圖2-a可知,隨著發(fā)酵的進行,自然發(fā)酵組和嗜酸乳桿菌F11組的pH值均呈先快速下降后緩慢下降的趨勢,其他發(fā)酵組的pH值在第1天快速下降后趨向于穩(wěn)定,但自然發(fā)酵組的pH值始終高于接種組;由圖2-b可知,各發(fā)酵組的總酸含量隨著發(fā)酵的進行均逐漸升高。其中,自然發(fā)酵組的總酸含量在發(fā)酵過程中一直低于接菌組,可能是由于發(fā)酵前期自然發(fā)酵組乳酸菌數(shù)較少,產(chǎn)酸能力弱,這與李俊健等[22]的研究結(jié)果一致。由圖2可知所有實驗組中,植物乳桿菌S1組的pH值在發(fā)酵過程中均維持在較低水平,而其總酸處于較高水平,兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果表明不同乳酸菌對發(fā)酵遲菜心副產(chǎn)物pH和總酸的影響存在顯著差異,其中植物乳桿菌S1在該體系中生長代謝較好。
還原糖的變化可以反應(yīng)發(fā)酵過程中微生物的生長代謝情況[23]。如圖3所示,所有實驗組的還原糖含量在發(fā)酵過程中均呈先上升后下降的趨勢,這可能是由于發(fā)酵前期微生物數(shù)量少,對還原糖的消耗較少,且遲菜心副產(chǎn)物自身還原糖溶解出來進而導(dǎo)致還原糖含量上升;而隨著還原糖溶解速度變慢,微生物數(shù)量增多,對還原糖的消耗也隨之增多而導(dǎo)致還原糖含量逐漸下降,這與陳大鵬等[24]的研究結(jié)果一致。其中,自然發(fā)酵組峰值最小(5.57 mg/100 g),結(jié)束時其殘?zhí)橇孔罡?2.79 mg/100 g),這可能是由于自然發(fā)酵組的初始乳酸菌數(shù)少,需要消耗更多的還原糖用于生長繁殖,而隨著發(fā)酵的進行,自然發(fā)酵組的乳酸菌數(shù)始終低于接種組,導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時其殘?zhí)橇扛哂谧匀话l(fā)酵組[21]。不同乳酸菌發(fā)酵組的峰值和殘?zhí)橇肯嘟?但存在顯著性差異,其中發(fā)酵乳桿菌G9組和植物乳桿菌S1組的變化量最大(5.26~5.46 mg/100 g),表明這兩種乳酸菌能夠在遲菜心副產(chǎn)物泡菜中較好的生長。
a-發(fā)酵過程pH值的變化;b-發(fā)酵過程總酸含量的變化圖2 遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程pH和總酸的變化Fig.2 Changes in pH and total acid during fermentation of Chicaixin by-products
圖3 遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程還原糖含量的變化Fig.3 Changes in reducing sugar content during fermentation of Chicaixin by-products
有機酸是構(gòu)成酸味的主要物質(zhì),是評價泡菜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[21]。已有研究表明,乳酸和乙酸是泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌代謝產(chǎn)生的主要有機酸[25]。遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程中乙酸和乳酸的變化如表1所示。發(fā)酵結(jié)束時各發(fā)酵組中乳酸含量均為最高,表明乳酸是遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機酸,其在發(fā)酵過程中呈上升的趨勢,且接菌組的乳酸含量始終高于自然發(fā)酵組。發(fā)酵結(jié)束時,所有發(fā)酵組中植物乳桿菌S1發(fā)酵的遲菜心副產(chǎn)物乳酸含量最高,其次是干酪乳桿菌M25和嗜酸乳桿菌F11,這與同型發(fā)酵產(chǎn)乳酸能力高于異型發(fā)酵的結(jié)論一致[26]。自然發(fā)酵是多種菌協(xié)同發(fā)酵,且前期多為異型發(fā)酵[27],其乙酸含量比同型發(fā)酵的3個實驗組高,而接菌組中作為異型發(fā)酵代表的腸膜明串珠菌Z3和發(fā)酵乳桿菌G9在第3天就達最大值,乙酸的峰值和最終含量均高于自然發(fā)酵組且提高了20%以上??傮w而言,接菌組中乳酸和乙酸產(chǎn)生的速率較快,可有效縮短遲菜心泡菜的發(fā)酵周期。
表1 遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程主要有機酸含量的變化 單位:mg/100 g
亞硝酸鹽一直是阻礙醬腌菜發(fā)展的食品安全問題,我國對其在醬腌菜中的含量進行了規(guī)定(≤20 mg/kg)[28]。泡菜發(fā)酵過程會形成“亞硝峰”,其主要是由蔬菜原料表面的微生物通過硝酸還原酶作用將蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽而形成的[29]。如圖4所示,在整個發(fā)酵過程中,不同發(fā)酵組的亞硝酸鹽含量均呈先升高后下降的趨勢;自然發(fā)酵組在第2天出現(xiàn)“亞硝峰”(57.39 mg/kg),而接菌組均在第1~2天陸續(xù)出現(xiàn),且峰值較低(1.23~6.72 mg/kg),這可能是由于自然發(fā)酵組在發(fā)酵開始時乳酸菌還未主導(dǎo)發(fā)酵,泡菜表面雜菌將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[30]。接菌組在發(fā)酵開始時就由乳酸菌主導(dǎo)發(fā)酵,能抑制遲菜心副產(chǎn)物表面雜菌的生長,并分泌亞硝酸鹽還原酶,分解亞硝酸鹽,從而降低泡菜中亞硝酸鹽的含量,改變“亞硝峰”的出現(xiàn)時間和峰值[7]。在所有發(fā)酵組中,植物乳桿菌S1發(fā)酵組的亞硝酸鹽含量始終保持在最低狀態(tài),說明植物乳桿菌S1具有較好的降解亞硝酸鹽的能力,可提升遲菜心副產(chǎn)物泡菜的安全性。
圖4 遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes in nitrite content during fermentation of Chicaixin by-products
采用GC-MS檢測不同乳酸菌發(fā)酵15 d時遲菜心副產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),如表2所示,共檢測到69種主要化合物。不同實驗組檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類存在差異,自然發(fā)酵組、腸膜明串珠菌Z3組、干酪乳桿菌M25組、嗜酸乳桿菌F11組、植物乳桿菌S1組和發(fā)酵乳桿菌G9組中分別檢測到30、35、49、28、42、36種主要化合物。按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為酸類(3種),腈類(3種),醇類(10種),烯烴類(22種),醛類(10種),酮類(9種),酯類(6種),烷烴類(4種)和其他(2種)。其中,烯烴類和酮類物質(zhì)占所有發(fā)酵組總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的66.02%。有研究表明,烯烴類的香味物質(zhì)閾值較低,對香氣有重要貢獻;而酮類多伴果香,對風(fēng)味也有一定貢獻[31]。
揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析中常用香氣活度值(odor activity value,OAV)≥1的物質(zhì)表示為樣品的特征風(fēng)味物質(zhì),OAV越高表明該物質(zhì)對整體香味的貢獻越多[32]。由表2可知,15種揮發(fā)性化合物存在于所有發(fā)酵組中,但其OAV差異較大。其中,OAV≥1的揮發(fā)性化合物有苯丙腈、4-異硫氰酸丁烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萘、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、壬醛、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、2-壬酮和香葉基丙酮,這些物質(zhì)可認(rèn)為是遲菜心副產(chǎn)物泡菜的特征風(fēng)味物質(zhì)。其中具有甜橙香味的D-檸檬烯、柑橘花香的癸醛以及黃瓜香味的壬醛OAV均大于100,表明這3種對發(fā)酵遲菜心副產(chǎn)物整體風(fēng)味貢獻最大。與自然發(fā)酵組相比,接種組中這3種物質(zhì)的OAV均較高,尤其是腸膜明串珠菌Z3組、植物乳桿菌S1組和發(fā)酵乳桿菌G9組,說明腸膜明串珠菌Z3組、植物乳桿菌S1組和發(fā)酵乳桿菌G9組的風(fēng)味更佳。除了以上3種風(fēng)味物質(zhì),β-紫羅蘭酮也是發(fā)酵蔬菜中常見的特征風(fēng)味物質(zhì)[33],其在自然發(fā)酵組中的OAV也超過100,但低于植物乳桿菌S1組。此外,不同發(fā)酵組總揮發(fā)性成分的含量存在較大差異。與自然發(fā)酵組相比,腸膜明串珠菌Z3組總揮發(fā)性成分的含量最高(10 194.76 μg/kg),植物乳桿菌S1組次之(9 730.51 μg/kg),嗜酸乳桿菌F11組含量最低(3 884.81 μg/kg)且低于自然發(fā)酵組,說明嗜酸乳桿菌F11對遲菜心副產(chǎn)物泡菜的風(fēng)味無促進作用。除此之外,接種組的共有特征風(fēng)味物質(zhì)(OAV≥1)總含量(1 828.63~3 562.77 μg/kg)均比自然發(fā)酵組(1 599.28 μg/kg)高。腸膜明串珠菌Z3組、干酪乳桿菌M25組和植物乳桿菌S1組還含有較高濃度的2-十一烷酮和2-十三烷酮,兩種物質(zhì)分別呈鳶尾花香和椰子清香,其中植物乳桿菌S1組中這兩種物質(zhì)的含量最高,分別為2 358.32 μg/kg和1 338.96 μg/kg。綜上,接菌發(fā)酵組的風(fēng)味優(yōu)于自然發(fā)酵,其中腸明膜串珠菌Z3和植物乳桿菌S1發(fā)酵組的風(fēng)味最為濃郁。
表2 遲菜心副產(chǎn)物泡菜的揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量 單位:μg/kg
續(xù)表2
本研究以遲菜心副產(chǎn)物為原料,腸膜明串珠菌Z3、干酪乳桿菌M25、嗜酸乳桿菌F11、植物乳桿菌S1、發(fā)酵乳桿菌G9為發(fā)酵菌劑,對比分析不同乳酸菌與自然發(fā)酵對遲菜心副產(chǎn)物泡菜品質(zhì)的影響。結(jié)果表明,不同發(fā)酵組的乳酸菌數(shù)、pH值、總酸、還原糖、亞硝酸鹽、乙酸、乳酸和揮發(fā)性風(fēng)味成分均表現(xiàn)出顯著差異。與自然發(fā)酵組相比,接種組的乳酸菌數(shù)高于自然發(fā)酵組,pH值迅速降低,總酸上升,可以快速啟動發(fā)酵;發(fā)酵后期接種組的乳酸菌數(shù)、總酸以及主要有機酸含量均優(yōu)于自然發(fā)酵組,且其pH值、還原糖含量和亞硝酸鹽含量均低于自然發(fā)酵組,其中植物乳桿菌S1的發(fā)酵性能最佳。通過GC-MS分析遲菜心副產(chǎn)物泡菜的揮發(fā)性風(fēng)味成分,結(jié)果顯示,發(fā)酵結(jié)束時經(jīng)腸膜明串珠菌Z3和植物乳桿菌S1發(fā)酵的遲菜心副產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量均優(yōu)于其他發(fā)酵組,整體風(fēng)味比其他發(fā)酵組更為濃郁??偠灾?植物乳桿菌S1具有作為遲菜心副產(chǎn)物發(fā)酵泡菜專用菌株的潛在優(yōu)勢,一方面可以顯著提高泡菜主要有機酸含量,降低亞硝酸鹽含量,進而提升泡菜的品質(zhì);另一方面還可以豐富遲菜心副產(chǎn)物泡菜的風(fēng)味,為遲菜心副產(chǎn)物的綜合利用提供理論依據(jù)。