裴慧敏,李亞蕾,曹松敏
(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021)
鹽池灘羊是生長在我國寧夏鹽池縣境內的一種特有的綿羊品種,其肉質細嫩鮮美、營養(yǎng)豐富且不膻不腥[1]。2019年以來,其飼養(yǎng)量穩(wěn)定在320萬只以上,羊肉產量達到2.75萬t,產值達12億元,同時每年產生大約5 000 t加工副產物——灘羊尾[2],由于其深加工不足造成資嚴重源浪費,制約了灘羊產業(yè)鏈的有效延伸。因此深入開展對灘羊尾脂的精深加工具有重要的經濟、環(huán)境和社會意義。
灘羊尾脂不僅風味獨特、膽固醇含量低,還富含共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)、油酸等功能性營養(yǎng)成分。研究表明,CLA有提高免疫力[3]、降血壓[4]、抑制腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗動脈粥樣硬化[7]以及減肥[8]等功能。我國對CLA的研究起步較晚,大多是從植物和微生物中提取或轉化。劉蕓[9]利用堿法異構法從黃秋葵種子中成功制備出CLA,并發(fā)現CLA-Arg對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的半抑制清除率IC50為2.76、1.43 mg/mL。趙俊[10]從茶油中合成了CLA,并利用A+硅膠層析柱對CLA進行了純化,使其純度由53.45%提高到了90.4%,CLA-Arg對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的IC50值分別為2.82、1.37、3.47 mg/mL。李垚等[11]利用嗜乳酸桿菌轉化成菜籽油并轉化CLA,通過響應面實驗優(yōu)化,CLA產量可達到(230.12±7.52) μg/mL。目前,國內外有關從動物體內提取功能性油脂多為魚油二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的研究,但以羊脂肪為原料提取CLA的報道較少。
有研究發(fā)現,CLA主要存在于反芻動物體內,其中羔羊的CLA含量最高,達到4.3~19 mg/g[12]。于洋等[13]用短程分子蒸餾法提取灘羊尾脂CLA,但由于設備價格昂貴、對材料密封及技術要求較高,初期投入比較大,生產能力有限,不利于工業(yè)化提取。本文以灘羊尾脂CLA的制備和生物活性分析為目標,以得率和純度為考察指標,首先采用低溫結晶和尿素包合法通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取工藝,進而探索對優(yōu)化條件下獲得的灘羊尾脂CLA的抗氧化活性和降膽固醇活性差異,旨在為今后灘羊尾脂CLA工業(yè)化提取及活性應用方面的研究提供理論指導。
灘羊尾,寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司;CLA標品,美國Sigma公司;石油醚(30~60 ℃)、正己烷、丙酮、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、甲醇(均為分析級),國藥集團化學試劑有限公司;DPPH、ABTS,北京酷來搏科技有限公司;鄰苯三酚,上海賢鼎生物科技有限公司;Tris-HCl、無水乙醇、無水硫酸鈉、氯化鈉、膽酸鈉,上海易恩化學技術有限公司;抗壞血酸,中國煙臺市雙雙化工有限公司;過硫酸鉀,阿拉丁試劑(上海)有限公司;膽固醇標品、?;悄懰徕c、油酸、甘氨膽酸鈉,上海源葉生物科技有限公司。
UV-1100紫外分光光度計,豪沃生物科技(上海)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;脂肪提取器,腰莊玻璃儀器制造廠;旋轉蒸發(fā)儀,上海秋佐科學儀器有限公司;TGL-16D冷凍高速離心機,常州中捷實驗儀器制造有限公司;電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司。
1.3.1 灘羊尾粗脂肪的提取
參考于洋等[13]方法,并略作修改。將斬拌好的灘羊尾脂稱取20 g并用濾紙包扎好,按照料液比1∶30倒入石油醚使其不斷回流抽提10 h,在45 ℃下旋轉蒸發(fā)直至完全蒸出石油醚,稱重計算粗脂肪提取率。
粗脂肪提取率的計算如公式(1)所示:
(1)
式中:X,粗脂肪提取率,%;m1,抽提后粗脂肪質量,g;m2,樣品質量,g。
1.3.2 灘羊尾脂CLA測定
1.3.2.1 標準曲線的繪制
準確稱取CLA標準樣品0.050 7 g,用正己烷定容至50 mL得到CLA標準樣品溶液,稀釋500倍,在紫外區(qū)200~300 nm掃描,確定CLA的最大吸收波長為233 nm。再分別吸取0.1~0.6 mL標準樣品溶液用正己烷定容至50 mL備用,在233 nm處測其吸光度,以CLA濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制CLA標準曲線。得到的線性回歸方程為Y=0.044 41x-0.005 79,相關系數為R2=0.999 23,線性范圍為1~12 μg/mL,檢出限為2 μg/mL。
1.3.2.2 樣品中CLA含量的測定
稱取一定量待測樣品,用正己烷進行稀釋,采用紫外分光光度計在233 nm處測其吸光值,利用標準曲線計算其含量,計算如公式(2)和公式(3)所示:
(2)
(3)
式中:X1,灘羊尾脂CLA得率,mg/g;X2,CLA純度,mg/g;c,灘羊尾脂CLA質量濃度,mg/mL;n,稀釋倍數;V,反應后CLA體積,mL;mi為反應前CLA質量,g;m0為反應后樣品質量,g。
1.3.3 混合脂肪酸的制備
將粗脂肪、NaOH、乙醇按照1∶0.4∶10(g∶mL∶g)的比例進行皂化,用水溶解后調節(jié)pH值為1~2,加入適量石油醚萃取2~3次,合并有機相,加入適量無水硫酸鈉脫水,過濾,旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑即得混合脂肪酸。
1.3.4 低溫結晶單因素試驗
取適量混合脂肪酸與有機溶劑混合,不斷攪拌直到完全溶解。然后將混合物在一定溫度下結晶,直到形成絮凝沉淀,取出后迅速抽濾,并旋蒸除去殘留溶劑。測定CLA純度和得率。
按照上述方法,探究不同有機溶劑(石油醚、丙酮、無水乙醇、正己烷),不同料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18,g∶mL),不同結晶時間(6、9、12、15 h),不同結晶溫度(4、-20、-40、-80 ℃)對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響。初始條件有機溶劑為無水乙醇,料液比為1∶12,結晶時間為9 h,結晶溫度為-20 ℃。所有單因素試驗參數的優(yōu)化均進行3組平行實驗。
1.3.5 低溫結晶正交試驗優(yōu)化
參考單因素試驗結果,選取結晶溫度(A),結晶時間(B),混合脂肪酸與無水乙醇加量比(g∶mL)(C)為考察因素,采用正交表L9(33)進行正交試驗設計,以CLA純度為指標進一步研究各因素對低溫結晶純化灘羊尾脂CLA最優(yōu)工藝的影響,實驗因素和水平如表1所示。
表1 低溫結晶正交試驗因素水平表Table 1 Low temperature crystallization orthogonal experiment factor level table
1.3.6 尿素包合單因素試驗
在冷凍結晶法純化基礎上選擇最優(yōu)條件進一步采用尿素包合的方法提純以得到純度更高的CLA。
參照李慧美[14]方法并略作修改。按一定配比使尿素和混合脂肪酸溶于乙醇中,并在70 ℃下回流30 min,最后放于適宜溫度下包合一定時間。包合結束后真空抽濾,并調節(jié)pH值為1~2,最后用石油醚萃取2~3次經旋轉蒸發(fā)儀除去有機溶劑后,即得純化后的灘羊尾脂CLA[15]。測定CLA純度和得率。
按照上述方法,探究包合溫度(25、4、-20、-40、-80 ℃),包合時間(6、12、18、24、30 h),脂肪酸與尿素質量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5),尿素與乙醇料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7,g∶mL)對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響。初始條件為包合溫度為4 ℃,包合時間為12 h,脂肪酸與尿素質量比為1∶3,尿素與乙醇料液比為1∶5。所有單因素試驗參數的優(yōu)化均進行3組平行實驗。
1.3.7 尿素正交試驗優(yōu)化
參考單因素試驗結果,選取包合溫度(A),包合時間(B),脂肪酸與尿素質量比(C),尿素與乙醇料液比(D)為考察因素,采用正交表L9(34)進行正交試驗設計,以CLA純度為指標進一步研究各因素對尿素包合純化灘羊尾脂CLA最優(yōu)工藝的影響,實驗因素和水平如表2所示。
表2 尿素包合正交試驗因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal experiment of urea inclusion
1.3.8 灘羊尾脂CLA的抗氧化活性
1.3.8.1 DPPH自由基清除能力的測定
參考LAI等[16]的方法,并略作修改。分別取2 mL不同濃度的樣品與2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液振蕩搖勻,常溫避光反應30 min后在517 nm處測定吸光值,以維生素C為陽性對照,每個樣品測定3次,DPPH自由基清除率的計算如公式(4)所示:
式中:A0,無水乙醇+DPPH溶液吸光值;A1,樣品溶液+DPPH溶液吸光值;A2,樣品溶液+無水乙醇吸光值。
1.3.8.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測定
參考劉蕓[9]的方法。
1.3.9 灘羊尾脂CLA的降膽固醇活性
1.3.9.1 模擬膽汁膠束法
參照高婕[17]的方法,以膽固醇濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為Y=0.073 58x-0.008 74(R2=0.999 25)。
1.3.9.2 體外結合膽酸鹽法
參照劉曉靜[18]的方法,以CLA濃度為橫坐標,膽酸鹽結合率為縱坐標。得到牛磺膽酸鈉標準曲線方程為:Y=0.262 69x-0.001 79,R2=0.999 45;甘氨膽酸鈉標準曲線方程為:Y=0.284 09x+0.011 19,R2=0.999 15;膽酸鈉標準曲線方程為:Y=0.267 35x-0.013 08,R2=0.994 47。
所有實驗均設置3個平行組,實驗結果以平均值±標準差表示,采用SPSS 26和正交軟件助手對實驗數據進行顯著性分析和方差分析,(P<0.05為差異顯著),繪圖采用Origin 2021軟件。
2.1.1 不同溶劑對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
由圖1-a可以看出,4種溶劑對混合脂肪酸進行低溫結晶后,樣品中CLA含量都顯著提高(P<0.05);當無水乙醇和石油醚作為溶劑時其純度變化并不顯著(P>0.05),考慮到石油醚有煤油氣味、易燃易爆,且無水乙醇作為溶劑時得率最高為(8.61±0.53) mg/g,并對人體傷害較小、價格低廉、容易獲得,所以選擇相對安全的無水乙醇作為有機溶劑進行單因素試驗的研究。
2.1.2 不同結晶溫度對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
在低溫結晶純化多不飽和脂肪酸過程中,溫度是非常重要的參數之一。由圖1-b可知,隨著溫度從4 ℃下降到-80 ℃,其純度越來越高,這一趨勢與MORALES-MEDINA等[19]的研究相似。當結晶溫度在4 ℃時,CLA得率達到最高為(10.88±0.61) mg/g,這主要是由于在溫度降低的過程中,飽和與單不飽和脂肪酸在乙醇中溶解度也隨之降低,導致其結晶析出,最終使樣品中CLA的含量升高。因此,從CLA的得率和純度都達到最優(yōu)的角度考慮,選取-40 ℃作為最佳處理溫度,此時得率和純度分別為(8.74±0.87)、(15.12±0.58) mg/g。
2.1.3 不同結晶時間對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
油脂的冷凍結晶是一個緩慢的過程,碳鏈越長,結晶速度越慢,為使結晶充分析出,必須要保證足夠的結晶時間。由圖1-c可知,結晶時間在12 h時CLA的純度最高為(17.78±0.78) mg/g,但CLA得率在逐漸降低,可能是隨著結晶時間的延長多不飽和脂肪酸析出導致。當結晶時間為6 h時,CLA的得率顯著高于(P<0.05)結晶時間為9、12和15 h的得率,這可能是因為冷凍時間太短,形成的晶核中的液體還沒有完全移動出來[14]。結晶時間由12 h增加到15 h時,其純度變化并不顯著(P>0.05),綜合純度和得率的最佳情況以及經濟成本來看,選擇結晶時間為12 h為最佳處理時間。
2.1.4 不同料液比對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
當體系中溶劑過少時,溶液黏度較大,結晶會包裹著大量的多不飽和脂肪酸,降低CLA得率,當溶劑過多時,會影響CLA純度,并增加溶劑的回收成本[20]。由圖1-d可以看出,當混合脂肪酸與無水乙醇料液比為1∶9時,CLA得率比較低,但純度最高,為(15.95±0.67) mg/g。隨著溶劑含量的增加,CLA得率提高,但純度卻降低,這一趨勢與李慧美[14]的研究結果基本一致。當料液比為1∶15和1∶18時,其純度和得率變化并不顯著(P>0.05),綜合考慮純度以及經濟效益和環(huán)保問題等因素,可以選擇料液比為1∶15作為后續(xù)工藝優(yōu)化。
a-不同有機溶劑;b-結晶溫度;c-結晶時間;d-混合脂肪酸與無水乙醇料液比圖1 不同單因素條件對低溫結晶灘羊尾脂CLA得率和純度的影響Fig.1 Effects of different single factor conditions on the yield and purity of low temperature crystalline Tan sheep tail fat CLA注:小寫字母表示不同單因素條件下各樣品之間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)。
正交試驗直觀分析中因素極差值越大,則該因素對實驗結果的影響程度就越大,某一水平k值越大,則優(yōu)水平為該水平。由表3可知,各因素對低溫結晶灘羊尾脂中CLA純度的影響次序為C>B>A,各因素的最佳組合水平為A1B2C1,即結晶溫度為-20 ℃,結晶時間為12 h,混合脂肪酸與無水乙醇料液比為1∶12。通過3次實驗驗證,在此條件下所得CLA純度為(18.62±0.51) mg/g,高于正交表中最高值(17.88±1.12) mg/g。
2.3.1 不同包合溫度對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
尿素包合反應是放熱反應,包合溫度的降低有利于反應向正方向進行[21],但溫度過低時,乙醇和包合物凝固,嚴重阻礙包合反應的進行,使得CLA純度下降且逐漸趨于穩(wěn)定。由圖2-a可見,包合溫度由-80 ℃增加到4 ℃時,CLA得率和純度隨溫度的上升而增加,這與吳明一[22]尿素包合純化不飽和脂肪酸中包合溫度優(yōu)化結果一致。在4 ℃時CLA純度最高達到(26.96±0.57) mg/g,此時尿素分子能夠較好地包合單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸,從而使多不飽和脂肪酸留在溶液內。因此選取4 ℃為最佳處理溫度。
2.3.2 不同包合時間對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
實驗結果顯示(圖2-b),當包合時間由6 h延長至30 h時,樣品中CLA的得率也隨之從(3.89±0.81) mg/g下降至(2.24±0.53) mg/g,這可能是隨著包合時間的延長,少量尿素以晶體的形式析出,并攜帶少量的CLA[21]。當包合時間≥12 h,樣品中CLA純度和得率變化并不顯著(P>0.05),達到了動態(tài)平衡。這是因為脂肪酸與尿素的包合反應是飽和和游離達到動態(tài)平衡的過程,反應正好達到平衡的時間為最佳尿素包合時間。所以選取12 h作為最佳包合時間。
表3 低溫結晶正交試驗極差分析表Table 3 Range analysis table of low temperature crystallization orthogonal experiment
2.3.3 低溫結晶CLA與尿素質量比對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸容易與尿素分子形成穩(wěn)定的晶體包合物,而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多,有一定的空間構型,不易被尿素包合[23]。由圖2-c可以看出,隨著尿素添加量的不斷增加,CLA純度逐漸增大,在1∶3時升高為(25.98±0.76) mg/g,之后趨于平緩。這一趨勢與孫瀟輝[24]用尿素包合法純化瓜蔞籽油中多不飽和脂肪酸的研究結果一致。當脂肪酸與尿素質量比為1∶3和1∶4時,其純度差異不顯著(P>0.05)且1∶3時得率較高,綜合考慮經濟成本及得率,選擇1∶3為脂肪酸與尿素的最佳質量比。
2.3.4 尿素與無水乙醇料液比對灘羊尾脂CLA得率和純度的影響
當無水乙醇用量過低時,體系黏度較大,不能有效包合多不飽和脂肪酸,但隨著無水乙醇用量的不斷增加,尿素濃度不斷降低,包合效果變差,使得率下降[25]。由圖2-d可知,當尿素和乙醇的料液比大于1∶5時,CLA得率緩慢下降。這一趨勢與曾俊等[21]的研究結果一致。當其質量比為1∶5時得率達到最大,為(2.85±0.83) mg/g,純度為(25.67±1.17) mg/g。因此為了保證所得CLA產物具有較好的純度及得率,本實驗選取尿素與無水乙醇料液比為1∶5。
a-包合溫度;b-包合時間;c-低溫結晶CLA與尿素質量比;d-尿素與無水乙醇料液比圖2 不同單因素條件對尿素包合灘羊尾脂CLA得率和純度的影響Fig.2 Effect of different single factor conditions on the yield and purity of urea inclusion Tan sheep tail fat CLA
由表4可知,各因素對尿素包合灘羊尾脂中CLA對純度的影響次序為A>C>D>B,最佳組合水平為A1B3C1D2,即包合溫度為25 ℃,包合時間為14 h,脂肪酸與尿素質量比為1∶2,尿素與乙醇質量比為1∶5。通過3次實驗驗證,在此條件下所得CLA純度為(28.23±2.36) mg/g,高于正交表中最高值(26.71±1.58) mg/g。比候建軍等[26]研究羊腰部脂肪中CLA含量高22.35%。
表4 尿素包合正交實驗極差分析表Table 4 Range analysis of urea inclusion orthogonal experiment
2.5.1 灘羊尾脂CLA抗氧化活性測定結果
清除自由基是評價食品、藥品抗氧化能力的一個重要指標[27]。由圖3可以看出,CLA對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力都存在劑量效應關系,但表現出差異。本研究結果顯示,當CLA質量濃度為6 mg/mL時,CLA對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率分別為(35.94±4.07)%、(51.76±5.57)%,這與陳麗敏[27]在研究山核桃油中CLA對DPPH自由基清除率的結果基本一致。KIM等[28]研究表明CLA對ABTS陽離子自由基的清除能力高于DPPH自由基,本研究結果與其一致。這可能是因為ABTS陽離子是兩親性物質,能夠同時溶于水相和有機相,而DPPH自由基只能溶解在有機相中,所以ABTS陽離子自由基對抗氧化劑的反應要比DPPH自由基敏感。而當維生素C質量濃度為40 μg/mL時,對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的抑制率接近100%,繼續(xù)增大濃度抑制率變化不顯著(P>0.05),CLA的自由基清除率要遠低于維生素C。本實驗結果表明,CLA對ABTS陽離子自由基有一定的清除能力,而對DPPH自由基的清除能力較低。
2.5.2 灘羊尾脂CLA降膽固醇活性測定結果
LEE等[29]等使用混合CLA異構體喂養(yǎng)兔子22周,根據組織切片和主動脈膽固醇定量評估,CLA喂養(yǎng)組的總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯顯著降低。KRITCHEVSKY等[30]通過向高膽固醇飲食兔子的日糧中添加0.05%~1% CLA混合物的實驗發(fā)現,CLA可通過有效降低兔子體內總膽固醇和高密度脂蛋白含量改善兔子血漿脂蛋白減輕其動脈粥樣硬化進程。大量動物實驗表明,CLA有降膽固醇活性的功能。本實驗通過模擬膽汁膠束法和體外結合膽酸鹽法初步檢測經提純后的灘羊尾脂CLA的降膽固醇活性。
a-ABTS陽離子自由基清除能力;b-DPPH自由基清除能力圖3 不同質量濃度灘羊尾脂CLA對自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Tan sheep tail fat CLA on the scavenging ability of free radicals
由圖4可知,隨著CLA質量濃度的增加,膽固醇膠束抑制率呈明顯的上升趨勢,當CLA質量濃度從1 mg/mL增加到3 mg/mL時,膽固醇抑制率由(2.86±1.32)%增加到了(34.76±5.67)%,抑制程度顯著(P<0.05);當CLA質量濃度為6 mg/mL時,其抑制率為(60.33±5.88)%,說明灘羊尾脂CLA能有效降低膽固醇質量濃度。由圖5可以看出,隨著CLA質量濃度的增加,與3種膽酸鹽結合率均呈上升趨勢。CLA對甘氨膽酸鈉的結合率最高,膽酸鈉次之,?;悄懰徕c最低,這一趨勢與廖坤梅等[31]研究的高良粗多糖體外結合膽酸鹽能力趨于一致,這可能是因為?;悄懰徕c是結合型膽酸鈉,相對于其他2種膽酸鹽來說不易被吸附[32]。當CLA質量濃度為6 mg/mL時,基本達到了最高的結合率,此時CLA對牛磺膽酸鈉的結合率為(16.11±4.01)%,對甘氨膽酸鹽的結合率為(37.56±3.17)%,對膽酸鹽的結合率為(25.11±4.82)%。說明灘羊尾脂CLA有一定的膽酸鹽結合能力。
a-膽固醇膠束抑制率;b-膽酸鹽結合率圖4 不同質量濃度灘羊尾脂CLA對降膽固醇活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of Tan sheep tail fat (CLA) on cholesterol lowering activity
本研究采用低溫結晶法聯(lián)合尿素包合法提取灘羊尾脂中的CLA,使其純度大大提高,且具有良好的抗氧化活性和降膽固醇活性。結果表明,采用低溫結晶法在有機溶劑為無水乙醇,結晶溫度為-20 ℃,結晶時間為12 h,混合脂肪酸與無水乙醇料液比為1∶12(g∶mL)條件下提取效果最優(yōu),在此條件下,灘羊尾脂CLA純度為(18.62±0.51) mg/g。在此基礎上聯(lián)合尿素包合法得到的最優(yōu)條件為包合溫度25 ℃,包合時間14 h,脂肪酸與尿素質量比1∶2,尿素與乙醇料液比1∶5(g∶mL),此時灘羊尾脂CLA純度為(28.23±2.36) mg/g。在不同濃度下經尿素包合后的CLA表現出良好的抗氧化活性和降膽固醇能力,當CLA質量濃度為6 mg/mL時,對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率分別為(35.94±4.07)%、(51.76±5.57)%,對膽固醇膠束抑制率為(60.33±5.88)%,對?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉的結合率分別為(16.11±4.01)%、(37.56±3.17)%和(25.11±4.82)%。研究結果為今后灘羊尾脂CLA工業(yè)化提取及活性應用方面的研究提供了基本的科學依據,對灘羊尾副產物的深入研究與開發(fā)利用具有重要意義。