朱秀清,王源,朱穎*,安月欣,黃雨洋,孫冰玉,夏曉雨,2

1(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱,150028) 2(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所,黑龍江 哈爾濱,150086)

漢麻蛋白作為新興植物蛋白資源之一,漢麻蛋白和多肽的功能特性及生物活性逐漸成為研究熱點(diǎn),目前關(guān)于漢麻蛋白肽抗氧化活性、降血壓活性、降血糖活性、抑菌性、抗神經(jīng)炎活性等方面已有相關(guān)研究[9-11]報(bào)道。YIN等[12]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解漢麻分離蛋白(hemp protein isolate,HPI)后,水解物的溶解度顯著提高,持水性和持油性顯著降低。TANG等[13]研究不同蛋白酶處理不同時(shí)間后HPI水解物的DPPH自由基清除能力與Fe2+螯合能力與它們的可溶性肽含量及表面疏水性呈相關(guān)性。TEH等[14]探討甲胎蛋白酶、HT蛋白水解物濃縮液、免疫球蛋白G降解酶、獼猴桃蛋白酶和生姜蛋白酶處理HPI后水解物的抗氧化活性及血管緊張素(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性均有所增加。綜上,針對(duì)漢麻蛋白肽的研究主要集中于生物活性方面,而對(duì)于不同蛋白酶酶解所得漢麻蛋白水解物的結(jié)構(gòu)、功能特性方面的研究較少。

本文中以HPI為原料,研究不同蛋白酶(木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)的酶解程度、酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)(二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、粒徑分布、Zeta電位)、界面性質(zhì)(泡沫性質(zhì)、乳化能力)以及抗氧化活性的變化,為HPI及其水解產(chǎn)物在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽,廣西巴馬;木瓜蛋白酶(800 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(30 000 U/g)、胃蛋白酶(10 000 U/g)、胰蛋白酶(250 000 U/g)、中性蛋白酶(50 000 U/g)、堿性蛋白酶(200 000 U/g),Solarbio科技有限公司;所有分析用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S型分析天平,賽多利斯科學(xué)有限公司;HH-S4型恒溫水浴鍋,鞏義市予華儀器有限公司;PCE-E3000型恒溫振蕩器,蘇州凱特爾儀器設(shè)備有限公司;Marvin 3000型馬爾文激光粒度儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司;TG16-WS型離心機(jī),湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;XHF-DY型高速分散機(jī)、722E型分光光度計(jì),上海圣科儀器設(shè)備有限公司;pH-20型pH計(jì),杭州杰源儀器科技有限公司;Lambda365型紫外光譜儀、Spectrum Two型紅外光譜儀,美國(guó)鉑金埃爾默股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 漢麻分離蛋白的制備

漢麻分離蛋白的制備參考朱秀清等[15]的方法。將脫脂漢麻籽與蒸餾水以1∶20(g∶mL)的比例混合,調(diào)節(jié)pH值為9.0,振蕩浸提3 h后4 000 r/min離心20 min,保留上清液,調(diào)節(jié)上清液pH值至4.7,靜置2 h 后4 000 r/min離心20 min,收集沉淀,溶于水后調(diào)節(jié)pH值至7.0,冷凍干燥后得到HPI,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 漢麻分離蛋白水解物的制備

漢麻分離蛋白水解物(hemp protein hydrolysate,HPH)的制備參照TANG等[13]的方法并稍作修改。配制質(zhì)量濃度為50 g/L的HPI溶液,在90 ℃下水浴15 min,降溫至反應(yīng)溫度,按表1中的條件調(diào)節(jié)pH值、加入蛋白酶反應(yīng)。反應(yīng)完成后,沸水浴滅酶10 min,冷卻后8 000 r/min離心10 min,保留上清液,分別制得木瓜蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-papain,HPH-PA)、風(fēng)味蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-flavor,HPH-F)、胃蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-pepsin,HPH-P)、胰蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-trypsin,HPH-T)、中性蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-neutral,HPH-N)、堿性蛋白酶水解物(hemp protein hydrolysate-alkaline,HPH-A)樣品,保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 六種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymolysis conditions of six kinds of proteases

1.3.3 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定水解度(degree of hydrolysis,DH)[16]。取10 mL HPH與60 mL蒸餾水,混勻后用NaOH溶液滴定至pH值為8.2;向溶液中加入10 mL中性甲醛,用NaOH溶液繼續(xù)滴定,當(dāng)pH值為9.2時(shí)停止,記錄NaOH消耗的體積為V?？瞻讓?shí)驗(yàn)中,記錄NaOH消耗的體積為V0。水解度的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:C為NaOH溶液濃度,mol/L;V為消耗NaOH溶液的體積,mL;V0為空白消耗NaOH溶液體積,mL;M為樣品中總氮質(zhì)量,g。

1.3.4 可溶性肽含量的測(cè)定

采用TCA-雙縮脲法測(cè)定水解物的肽含量[17]。取5 mL HPH與5 mL的0.4 mol/L的TCA溶液混合均勻,以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,吸取上清液1 mL與雙縮脲試劑4 mL混合均勻,靜置10 min,測(cè)定其在540 nm處的吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TCA-可溶性肽含量。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide,SDS-PAGE)凝膠電泳

采用的濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和20%,將樣品與上樣緩沖液以4∶1的比例混合后沸水浴煮沸5 min,每孔上樣量為20 μL。電泳結(jié)束后,用染色液染色30 min,然后用脫色液脫色直至條帶清晰無背景色。

1.3.6 粒徑分布、Zeta電位、PDI值的測(cè)定

參考AI等[18]的方法用馬爾文激光粒度儀對(duì)HPI及6種HPH的粒徑、Zeta電位、PDI(polymer dispersity index)值進(jìn)行測(cè)定。配制樣品質(zhì)量濃度3 mg/mL的溶液,用0.45 μm濾膜過濾除去不溶物,放入反應(yīng)皿內(nèi)對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

取凍干后的樣品適量,用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行4 000～400 cm-1波段掃描,每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 紫外可見光譜分析

取適量樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,測(cè)定溶液在190～400 nm紫外吸收光譜。

1.3.9 溶解度的測(cè)定

稱取10 mg樣品于10 mL水中,于室溫下攪拌30 min,10 000 r/min離心10 min后采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白含量。溶解度的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

1.3.10 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

取15 mL樣品置于量筒中,記錄此時(shí)體積V0,在高速分散器中8 000 r/min處理1 min后立即轉(zhuǎn)移至量筒中,記錄此時(shí)的體積V1及靜置30 min后的體積V2,樣品的起泡性(foaming characteristic,FC)和泡沫穩(wěn)定性(foaming stability,FS)的計(jì)算如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

(4)

1.3.11 乳化活性與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考WANG等[19]的方法并稍作修改進(jìn)行樣品的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定。樣品與大豆油按體積比3∶1加入到離心管中,在高速分散器中10 000 r/min處理2 min,立即在離心管底部吸取20 μL乳狀液,加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中,以0.1%的SDS溶液作為空白樣品,在500 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。樣品乳化活性(emulsifying activity,EAI)的計(jì)算如公式(5)所示:

(5)

式中:T為2.303;N為稀釋倍數(shù),250;C為乳化液未形成前蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度,g/mL;φ為油相體積分?jǐn)?shù);A0為0 min時(shí)吸光值。

將制成的乳狀液靜置30 min后,以上述同樣方法進(jìn)行樣品乳化穩(wěn)定性的測(cè)定。樣品乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ESI)的計(jì)算如公式(6)所示:

(6)

式中:A30為30 min時(shí)吸光值;t為30 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果取平均值,采用SPSS 26進(jìn)行顯著性分析并用Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶水解HPI水解度、可溶性肽含量對(duì)比

由圖1可知,DH及肽含量受蛋白酶類型的影響較大,HPH-A具有最高的DH(24.7±0.46)%,HPH-PA次之,為(24.4±0.34)%;HPH-A的肽含量最高,為(13.43±0.26) mg/mL,HPH-PA的肽含量為(12.96±0.23) mg/mL。由于堿性蛋白酶是一種深度內(nèi)切酶[20],具有廣泛的特異性,而木瓜蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)或多肽中精氨酸、賴氨酸的羧基端,SHEN等[21]的研究指出HPI中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量高,而脫殼后HPI中含有更多的精氨酸、組氨酸,因此,堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶可更有效地將HPI分解為可溶性的小分子肽或氨基酸,具有更高的水解度。

圖1 不同蛋白酶水解HPI水解度、可溶性肽含量比較Fig.1 Hydrolysis degree and soluble peptide content of HPI hydrolyzed by different proteases注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳

為了表征不同蛋白酶處理后的水解物組成,對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。由圖2可以看出分子質(zhì)量約為48 kDa的麻仁球蛋白、35 kDa左右的酸性亞基(acidic subunits,AS)、20 kDa左右的堿性亞基(basic subunits,BS)和10～15 kDa的白蛋白為HPI的主要組成部分[21],水解后發(fā)現(xiàn)4條蛋白帶的強(qiáng)度變?nèi)趸虿糠窒?并出現(xiàn)分子質(zhì)量<17 kDa的小分子組分,其中HPH-PA、HPH-F、HPH-P具有更多的小分子肽。胃蛋白酶的水解效果最好,出現(xiàn)的均為小于17 kDa的小分子肽。TANG等[13]的研究結(jié)果表明在很低的pH環(huán)境下,所有的蛋白質(zhì)可能被解離,球形結(jié)構(gòu)展開。HPH-A的電泳圖上也并未出現(xiàn)麻仁球蛋白的條帶,證明堿性蛋白酶對(duì)麻仁球蛋白具有很好的水解能力。

圖2 HPI及不同蛋白酶水解物的電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of HPI and different protease hydrolysates

2.3 不同蛋白酶水解HPI粒徑、PDI值對(duì)比

圖3-a表明水解對(duì)HPI粒徑分布的影響。水解后HPH粒徑體積分布與HPI相比均有所降低,HPH-A的平均粒徑最小,這是由于堿性蛋白酶可以將HPI水解成更多的短肽或氨基酸,這一結(jié)果與前文HPH-A具有較高的水解度一致。由圖3-b可以看出,所有水解物的PDI值較HPI均呈現(xiàn)減小的趨勢(shì),可以說明蛋白酶水解提高了水解物的分散性[18],其中HPH-P和HPH-A在水中的分散性低于其他水解物,HPH-N的PDI值最大。這是由于中性蛋白酶的水解位點(diǎn)為亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水氨基酸的肽鍵[22],酶水解后會(huì)產(chǎn)生具有相同末端的氨基酸或帶有相同電荷的肽段[23],會(huì)暴露出更多疏水性氨基酸,導(dǎo)致水解物在水中的分散性弱于其他水解物。

2.4 不同蛋白酶水解HPI Zeta電位值對(duì)比

由圖4可知,各水解物的Zeta電位值較HPI有所增加,這是由于水解過程可以暴露出掩埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氨基和羧基,使其數(shù)量增加[16],從而提高水解物的Zeta電位值。HPH-A、HPH-PA較高的Zeta電位絕對(duì)值表明在水解過程中可以產(chǎn)生更多的氨基和羧基,從而增加了HPI的表面電荷;同時(shí),Zeta電位絕對(duì)值升高導(dǎo)致分子內(nèi)和分子間的靜電排斥作用增大,可以促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開,破壞現(xiàn)有的蛋白質(zhì)聚集體或阻止聚集體的進(jìn)一步形成,從而提高樣品在溶液中的穩(wěn)定性。

2.5 不同蛋白酶水解HPI二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比

3 500～3 000 cm-1的特征吸收峰主要與多肽骨架上的氫鍵有關(guān),氫鍵可以維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[5],不同蛋白酶水解產(chǎn)物的峰強(qiáng)度和峰寬較HPI降低,說明蛋白酶水解會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子間的氫鍵,從而改變蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由圖5-a可以看出HPI在2 924 cm-1處的峰與不對(duì)稱CH2伸展有關(guān),這通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的脂肪側(cè)鏈中[24],不同HPI水解物的—CH2譜帶均由2 924 cm-1移動(dòng)到2 932 cm-1,且峰強(qiáng)度明顯減弱。這些結(jié)果表明,蛋白酶水解改變了HPI的脂肪側(cè)鏈,破壞了HPI的疏水區(qū)。

a-不同蛋白酶水解物的粒徑分布;b-不同蛋白酶水解物的PDI值圖3 不同蛋白酶水解HPI粒徑分布及PDI值比較Fig.3 Particle size distribution and PDI value of HPI hydrolyzed by different proteases

圖4 不同蛋白酶水解HPI Zeta電位值比較Fig.4 Zeta potentials of HPI hydrolyzed by different proteases

由圖5-b可以看出,酶水解對(duì)HPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)有影響,不同蛋白酶水解產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同。與HPI相比,HPH的α-螺旋變化不明顯,β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲比例增加,β-折疊比例降低,表明蛋白酶酶解會(huì)使蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)變得無序,分子結(jié)構(gòu)變得更加松散。劉瑾[25]的研究表明,β-折疊比例的降低說明HPH的疏水性降低,溶解性增加,有利于提高水解物在水中的分散性;水解物的β-轉(zhuǎn)角含量升高表明它們具有更加靈活的二級(jí)結(jié)構(gòu)?？傊?酶水解會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散,具有更靈活的二級(jí)結(jié)構(gòu),提高蛋白溶解度。

a-不同蛋白酶水解HPI的傅里葉變換紅外光譜; b-不同蛋白酶水解HPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成圖5 不同蛋白酶水解HPI傅里葉變換紅外光譜及 二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比較Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopy and secondary structure of HPI hydrolyzed by different proteases

2.6 不同蛋白酶水解HPI三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比

由圖6可以看出,所有HPH熒光發(fā)射光譜的λmax出現(xiàn)在272～274 nm,較HPI發(fā)生了紅移,同時(shí),這些水解物的最大熒光強(qiáng)度也有所增加。對(duì)紫外吸收光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)得到的光譜可以用于分析紫外區(qū)域復(fù)雜的蛋白譜圖遷移信息,經(jīng)計(jì)算得到HPI、HPH-PA、HPH-F、HPH-P、HPH-T、HPH-N、HPH-A的r值分別為1.354、2.295、1.915、1.953、1.991、2.151、2.217。所有HPH的r值增大,表明蛋白酶水解打開了HPI的三級(jí)結(jié)構(gòu),暴露了芳香氨基酸及內(nèi)部的親水基團(tuán),導(dǎo)致其紅移[26]。

2.7 不同蛋白酶水解HPI溶解度對(duì)比

HPI在中性條件下溶解性差,蛋白酶水解會(huì)破壞其分子空間結(jié)構(gòu),一些包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的親水性區(qū)域暴露出來,提高漢麻蛋白的溶解性。由圖7可知,HPH-P的溶解度最好,這可能是由于胃蛋白酶水解能進(jìn)一步將原本因疏水而易絮凝沉淀的蛋白分解成更小分子肽段,使其溶解于水中,進(jìn)而提高了水解產(chǎn)物的溶解性。同時(shí),多肽鏈分子質(zhì)量減小、肽段增多,增大了親水性基團(tuán)與水的接觸,從而達(dá)到提高溶解度的目的,這也與研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解后金蘋果螺水解物的溶解度有所提高的趨勢(shì)一致[27]。

圖7 不同蛋白酶水解HPI溶解度比較Fig.7 Solubility of HPI hydrolyzed by different proteases

2.8 不同蛋白酶水解HPI界面性質(zhì)對(duì)比

由圖8-a可知,蛋白酶處理可以提高HPI的起泡性,這可能是由于小分子肽能夠降低溶液黏度與表面張力,更好地增加蛋白質(zhì)表面凈電荷數(shù)目,增加多肽鏈的交聯(lián)和片層的黏度,從而提高了起泡性。其中,HPH-PA、HPH-A的FC較高,這可能是由于水解物表面帶有更多的電荷所導(dǎo)致的,這也與前文Zeta電位的結(jié)論一致。蛋白酶處理后HPI的泡沫穩(wěn)定性有所提升,這也與PUTRA等[27]指出的低分子質(zhì)量肽的數(shù)量越多,水解物的起泡穩(wěn)定性越好一致。

由圖8-b可以看出,蛋白酶處理后HPH的乳化活性及乳化穩(wěn)定性較HPI均有所降低。水解過程中蛋白質(zhì)分子部分展開,更多的親水基團(tuán)暴露出來,使蛋白質(zhì)在油-水界面重排,改善了疏水-親水平衡,從而降低乳液的乳化活性,而中性蛋白酶特定的水解位點(diǎn)使水解物具有更多的疏水基團(tuán),從而具有相對(duì)好的乳化能力。蛋白酶水解使HPI分子肽鏈逐漸縮短,產(chǎn)生的小肽失去了與水和非水相相互作用的能力,難以形成良好的界面膜,不能有效地防止油滴的聚集。有研究表明較高的表面疏水性和較大的多肽顆粒有助于提高蛋白質(zhì)水解物的乳化能力[28],因此水解后小分子肽含量的增加會(huì)導(dǎo)致水解物乳化性變差。

a-不同蛋白酶水解HPI起泡能力比較; b-不同蛋白酶水解HPI乳化能力比較圖8 不同蛋白酶水解HPI界面性質(zhì)比較Fig.8 Interface property of HPI hydrolyzed by different proteases

3 結(jié)論與討論

HPI在6種蛋白酶(木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)作用下進(jìn)行水解,可以顯著改善HPI的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)。不同蛋白酶水解物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大,這種差異可歸因于單個(gè)酶的切割模式,水解物的功能特性更多依賴于蛋白酶的類型而不是水解度。水解會(huì)產(chǎn)生更多的小分子肽,使蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)變得無序,使內(nèi)部的親水基團(tuán)暴露出來,分散性提高。其中HPH-A具有良好的水解度、肽含量,HPH-N的乳化性最好,HPH-PA的泡沫性質(zhì)最好,HPH-P的溶解度最好。漢麻分離蛋白被不同蛋白酶水解后結(jié)構(gòu)及功能特性的變化,為后續(xù)研究漢麻蛋白及其水解物的在食品中的應(yīng)用及其生物活性奠定了理論基礎(chǔ)。