沈玲,趙麗婷,沈昱,陳磊,李軍訓(xùn),顧正華1,,李由然1,, 石貴陽(yáng),丁重陽(yáng)*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué),糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)4(山東泰山生力源集團(tuán)股份有限公司,山東 泰安,271000)

近年來(lái),糖尿病、高血脂和高血壓的患病率迅速上升,而這些疾病與高糖和高脂肪的食品密不可分。因此在食品加工生產(chǎn)過(guò)程中,可以使用功能性糖代替蔗糖作為新型甜味劑[1]。D-甘露糖作為功能性糖中的一種,目前已經(jīng)作為食品輔助劑被直接使用。此外,由于D-甘露糖具有溶解性和抗融化性,可被廣泛的應(yīng)用于商業(yè)冰激凌上[2]。D-甘露糖還可以改善食品質(zhì)地,GHAOUTH等[3]研究證明將D-甘露糖接種在即將腐爛的蘋果中,腐爛病斑直徑變小。D-甘露糖在食品領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大商業(yè)價(jià)值,其地位日益突出。

目前D-甘露糖的制備主要有植物提取、化學(xué)合成以及生物酶法3種途徑[4],其中生物酶法因其反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好和成本低等優(yōu)勢(shì),已成為制備D-甘露糖的研究趨勢(shì)。目前,能夠以D-果糖為底物制備D-甘露糖的酶有4種[5],分別是D-甘露糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.7)、D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.15)、纖維二糖2-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.11)和D-甘露糖2-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.-),它們均屬于N-乙酰-D-葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶(N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase,AGE 超家族異構(gòu)酶)。與其他3種酶相比,D-甘露糖異構(gòu)酶(D-mannose isomerase,D-MIase)的催化效率較高,基本在25%～35%,被認(rèn)為是甘露糖生產(chǎn)中最具潛力的酶。

至今已報(bào)道的D-MIase大多數(shù)來(lái)源于大腸桿菌、假單胞菌和極端嗜熱菌,其最適反應(yīng)溫度在30～60 ℃,跨度較大。在以D-果糖為底物制備D-甘露糖時(shí),EscherichiacoliJM109[6]來(lái)源的D-MIase在37 ℃反應(yīng)8 h獲得48.6 g/LD-甘露糖,Pseudomonassyringae[7]來(lái)源的D-MIase在45 ℃反應(yīng)6 h獲得162 g/LD-甘露糖,而Thermobifidahalotolerans[8]來(lái)源的D-MIase在65 ℃反應(yīng)1 h即可生成179 g/LD-甘露糖。較高的反應(yīng)溫度可以大大提升D-甘露糖的制備效率,縮短反應(yīng)時(shí)間,同時(shí)也可更大程度的避免染菌。因此增強(qiáng)D-MIase的熱穩(wěn)定性將有利于生物酶法制備D-甘露糖的工業(yè)化應(yīng)用。本研究選擇普遍存在的大腸桿菌來(lái)源的D-MIase進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)探究并進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,探究熱穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)的內(nèi)在關(guān)系,為提高D-MIase 熱穩(wěn)定性奠定理論基礎(chǔ),同時(shí)為生物酶法高效制備D-甘露糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Dh5α、大腸桿菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-28a(+)均由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

硫酸卡那霉素,上海麥克林生化科技有限公司;D-果糖、D-甘露糖,上海源葉生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ,大連TaKaRa公司;一步克隆試劑盒,南京諾維贊公司;質(zhì)粒提取試劑盒、Mag-BeadsHis-Tag蛋白純化磁珠,上海生工公司;蛋白質(zhì)marker,翌圣生物科技(上海)股份有限公司;其他主要試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

pH計(jì),梅特勒-托利多儀器公司;Sonic VCX-750型超聲波細(xì)胞破碎儀,南京新辰生物科技有限公司;SCG-030蛋白純化系統(tǒng),蘇州賽譜儀器有限公司;Spark多功能酶標(biāo)儀,南京科麟得科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取、基因克隆與重組菌的構(gòu)建

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢得到大腸桿菌Dh5α的全基因組序列中含有D-MIase的編碼基因序列,采用十六烷基三乙基溴化銨(cetyltriethylammonium bromide,CTAB)法提取的大腸桿菌Dh5α基因組DNA為模板,用引物man-iso-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切并純化,利用單片段一步克隆法獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MI,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3中,通過(guò)菌落PCR、測(cè)序驗(yàn)證得到重組菌E.coliBL21/pET-28a-MI。

1.2.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)、電泳鑒定及純化

挑取重組菌E.coliBL21/pET-28a-MI的單菌落接種于含50 μg/mL卡那青霉素的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6左右,加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),在16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h,冷凍離心收集沉淀,用20 mmol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffer,PB)(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)重懸菌體。采用超聲波破碎法破碎細(xì)胞,冷凍離心后所得上清液即為粗酶液,吸取適量粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析重組酶的表達(dá)情況。用1 mL鎳離子柱對(duì)粗酶液進(jìn)行純化,洗脫方法如下:體積分?jǐn)?shù)40%的A液(20 mmol/L PB、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑,pH 7.4)和體積分?jǐn)?shù)60%的B液(20 mmol/L PB、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑,pH 7.4)洗脫目的蛋白,收集蛋白峰洗脫液,并將洗脫液用超濾管交換濃縮到20 mmol/L PB中保存,用于后期研究。

1.2.3 重組酶的酶活力測(cè)定方法

酶活力單位(U)的定義:1 min催化D-果糖生成1 μmoLD-甘露糖所需的D-MIase的酶量。

酶活力測(cè)定方法:以20 mmol/L、pH 7.4的PB作為緩沖液,取50 μL純酶液,加入50 μL的D-果糖(終濃度10 mmol/L)于30 ℃水浴反應(yīng)10 min后,煮沸2 min終止反應(yīng),分析生成D-甘露糖的濃度。

HPLC檢測(cè)方法:色譜柱為Dionex CarboPac PA10(4 mm×250 mm)與CarboPac保護(hù)柱(4 mm×50 mm),流動(dòng)相是NaOH,流速為1.00 mL/min,工作電極為Gold(Au)。

1.2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適反應(yīng)溫度:純化后的酶液經(jīng)PB(20 mmol/L,pH 7.4)稀釋至適當(dāng)濃度,分別測(cè)定在20～75 ℃的酶活力。以最高酶活力為100%,計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。

最適反應(yīng)pH:分別用HAC-NaAC(pH 4.0～5.5)、Na2HPO4-NaH2PO4(pH 5.5～8.0)和甘氨酸-NaOH(pH 8.0～10.0)緩沖液將pH值調(diào)至4.0～10.0后測(cè)定酶活力。以最高酶活力為100%,計(jì)算各pH值下的相對(duì)酶活力。

金屬離子對(duì)酶活力的影響:向反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子,終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L,測(cè)定酶活力,以未添加金屬離子的酶活力為100%。

動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定:選擇不同濃度的D-果糖為底物(10～1 600 mmol/L),在測(cè)酶活力的條件下測(cè)定重組酶活力。使用 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法對(duì)D-MIase的Km值以及kcat/Km值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 突變體的構(gòu)建

以pET-28a-MI質(zhì)粒為模板,利用PrimerX網(wǎng)站設(shè)計(jì)突變引物(表1),使用Superpfu酶進(jìn)行全質(zhì)粒PCR,然后將PCR產(chǎn)物用DpnⅠ 酶在37 ℃消化1～2 h,取出后置于80 ℃反應(yīng)2 min,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)中,利用菌落PCR、測(cè)序驗(yàn)證獲得正確的突變子。組合突變體的構(gòu)建方法同上。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 耐熱性突變位點(diǎn)的選擇與優(yōu)勢(shì)突變體的篩選

利用AlphaFold構(gòu)建D-MIase的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型,上傳至FireProt網(wǎng)站,在耐熱多點(diǎn)突變體的計(jì)算設(shè)計(jì)板塊進(jìn)行模擬計(jì)算,獲得突變位點(diǎn)。突變株經(jīng)1.2.2節(jié)方法誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎后,按照Mag-BeadsHis-Tag蛋白純化磁珠使用說(shuō)明書進(jìn)行蛋白純化操作獲得純酶,測(cè)定酶活力及Tm值。

1.2.7 穩(wěn)定性參數(shù)測(cè)定

半衰期t1/2:將純酶稀釋至1 mg/mL,按照每管200 μL分裝至1.5 mL EP管中,置于50 ℃水浴鍋中孵育,不同時(shí)間取出,冰敷后測(cè)定純酶活力,以保溫時(shí)間為X軸,比活力為Y軸作圖,即可得到純酶失活曲線,其活力損失一半時(shí)所需的時(shí)間即為半衰期t1/2。

熱熔融溫度(Tm)值:采用差示掃描熒光法測(cè)定Tm,將純酶用20 mmol/L PB(pH 7.4)稀釋至每40 μL含有30 μg蛋白,加入2 μL 100×SYPRO Orange protein gel stain,然后將混合物通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,測(cè)量其在溫度從20 ℃升至90 ℃時(shí)微電流變化,通過(guò)軟件模擬得到其較為準(zhǔn)確的Tm值。

1.2.8 分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用AlphaFold構(gòu)建野生型(wide type,WT)和突變體的三維結(jié)構(gòu),使用AMBER軟件中pdb4amber去除氫鍵,然后用ff14SB力場(chǎng)獲取動(dòng)力學(xué)模擬的參數(shù)。將蛋白質(zhì)放在一個(gè)緩沖距離為12×10-10m的TIP3P水盒子中,并且加入抗衡離子(Na+/Cl-)以中和體系電荷,再利用最陡下降法和共軛梯度法對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。蛋白質(zhì)在10 kcal/(mol·?2)弱約束下,系統(tǒng)從0 K加熱到323 K,體系內(nèi)所有涉及氫原子的化學(xué)鍵用SHAKE算法來(lái)約束,整個(gè)過(guò)程持續(xù)50 ns,使用cpptraj.MPI程序計(jì)算重原子的均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)和氨基酸殘基的均方根漲落(root-mean-square fluctuation,RMSF)。模擬結(jié)果數(shù)據(jù)的可視化及分析采用Discovery Studio 2019 Client和PyMOL軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建、驗(yàn)證與誘導(dǎo)表達(dá)及純化

按照1.2.1節(jié)構(gòu)建重組菌E.coliBL21/pET-28a-MI,菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖1-a所示,PCR產(chǎn)物在1 569 bp左右有明顯條帶,與基因大小相一致,表明重組菌構(gòu)建成功。重組D-MIase的粗酶液和純酶液的SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖1-b所示,重組蛋白在48 kDa左右出現(xiàn)單一的清晰條帶,表明成功純化重組D-MIase。

a-重組菌E.coli BL21/pET-28a-MI菌落PCR鑒定電泳圖 (M-Markers,1、2、3-均為重組菌E.coli BL21/pET-28a-MI); b-重組D-MIase的SDS-PAGE圖(M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Markers, 1-空白對(duì)照,2-D-MIase粗酶液,3-D-MIase純酶液)圖1 菌落PCR驗(yàn)證核酸和重組D-MIase的 SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of colony PCR and SDS-PAGE of recombination D-MIase

2.2 D-MIase的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH及金屬離子對(duì)重組酶的影響

溫度對(duì)D-MIase的影響如圖2-a所示,D-MIase的最適反應(yīng)溫度為30 ℃,且該酶不適合在50 ℃以上反應(yīng),50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力僅有50%。與目前其他來(lái)源的D-MIase酶學(xué)性質(zhì)(表2)相比,本研究中D-MIase的最適反應(yīng)溫度低,耐熱性差。D-MIase在不同緩沖液中的酶活力情況如圖2-b所示。D-MIase的最適反應(yīng)pH值為6.0～7.0,當(dāng)pH>8.0時(shí),相對(duì)酶活力降低迅速,而在酸性條件下仍有較高的相對(duì)酶活力。在相同pH的不同緩沖液中,D-MIase的酶活力也有所不同,當(dāng)pH值為8.0時(shí),D-MIase在PB中顯示出更高的酶活力。如圖2-c所示,金屬離子對(duì)D-MIase幾乎無(wú)促進(jìn)作用,1.0 mmol/L的Fe3+對(duì)其酶活力有少許提高,與其他來(lái)源的D-MIase一致。D-MIase在添加Cu2+和Zn2+時(shí)酶活力損失明顯,推測(cè)是Cu2+和Zn2+這兩種金屬離子破壞了蛋白質(zhì)的二硫鍵,使蛋白質(zhì)變性,從而失活。另外,根據(jù)表2及本研究,雖然大腸桿菌來(lái)源的酶在氨基酸序列上具有較高的同源性,但其酶學(xué)性質(zhì)仍因來(lái)源于不同種而存在差異。

a-溫度對(duì)D-MIase活力的影響;b-pH對(duì)D-MIase活力的影響;c-金屬離子對(duì)D-MIase活力的影響圖2 溫度、pH和金屬離子對(duì)D-MIase活力的影響Fig.2 Effects of temperature, pH, and ion on activity of D-MIase

表2 不同來(lái)源的D-MIase的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 2 Comparison of the enzymatic properties of various D-MIases

2.2.2 重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在不同底物濃度下,測(cè)定重組酶的酶活力,以1/V為縱坐標(biāo)1/[S]為橫坐標(biāo)得到Linewaeaver-Burk雙倒數(shù)圖,通過(guò)計(jì)算得到D-MIase的米氏常數(shù)Km為963.4 mmol/L,反應(yīng)最大速率Vmax為12.66 mmol/(L·min),催化常數(shù)kcat為1.38 s-1,催化效率指數(shù)kcat/Km為1.4×10-3L/(mmol·s)。

2.3 耐熱性突變位點(diǎn)的選擇與優(yōu)勢(shì)突變體的篩選

按照1.2.6節(jié)獲得以下18個(gè)突變位點(diǎn):N5F、S8P、N83F、A106P、G171A、A236W、A262L、N283Y、D296P、T330Y、N411Y、Q379P、A241P、G253A、Q152G、H189G、A116V和C267G。此外,李影等[10]對(duì)Pseudomonasgeniculate來(lái)源的D-MIase進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,根據(jù)序列比對(duì),確定突變位點(diǎn)S122A和I390W。構(gòu)建并測(cè)定50 ℃時(shí)上述20個(gè)突變體的酶活力和Tm值,其中Q152G突變體表達(dá)量低,N5F、I390W和A262L突變體為包涵體,其余突變體與WT在50 ℃時(shí)的相對(duì)酶活力如圖3-a所示,Tm值和ΔTm值見(jiàn)表3。A116V、Q379P、A241P、G253A突變體在50 ℃時(shí)的酶活力均提高了20%以上,其中A241P突變體提高得最為明顯,為WT的2.5倍,其Tm值也提升了1 ℃。Tm值是熱力學(xué)穩(wěn)定性的特征參數(shù)之一,是蛋白質(zhì)從折疊狀態(tài)變成展開狀態(tài)的溫度[17],由表3可知,N283Y、N411Y、A106P、Q379P、A116V、D296P、A241P的Tm值均提升了1 ℃及以上,且N283Y提升到了58.1 ℃。

根據(jù)各突變體在50 ℃的相對(duì)酶活力和Tm值,選擇以下5個(gè)突變體進(jìn)行半衰期測(cè)定:A116V、Q379P、A241P、G253A和N283Y。半衰期擬合曲線如圖3-b所示,WT在50 ℃的半衰期為18.9 min,N283Y突變體的半衰期最長(zhǎng),達(dá)到了87.7 min,為WT的4.6倍,其次是A241P突變體,為43.4 min。由于A241P突變體在50 ℃時(shí)酶活力提高顯著且半衰期也有所提高,因此選擇A241P突變體作為迭代組合突變的模板M1。

a-突變體50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力;b-突變體50 ℃時(shí)半衰期擬合曲線圖圖3 突變體50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力和半衰期擬合曲線圖Fig.3 Relative enzyme activity and fitting curve of half-life value of mutants at 50 ℃

表3 突變體的熱熔融溫度(Tm)和ΔTm值Table 3 The melting temperature (Tm) and ΔTmof mutants

2.4 最優(yōu)突變體的確定及其酶學(xué)性質(zhì)探究

以M1為模板,按照1.2.5節(jié)構(gòu)建突變體A241P/A116V、A241P/G253A、A241P/Q379P、A241P/N283Y,測(cè)定各突變體的Tm值、50 ℃半衰期和50 ℃的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖4和表4所示,M2(A241P/A116V)的半衰期由43.4 min提高到了198.4 min,為A241P的4.5倍,WT的10倍,Tm值提高了0.7 ℃。進(jìn)一步構(gòu)建A241P/A116V/G253A、A241P/A116V/Q379P和A241P/A116V/N283Y,M3(A241P/A116V/G253A)表現(xiàn)出比M2更高的酶活力,且半衰期提高到了281.7 min,Tm值提高了1 ℃。突變體A241P/A116V/G253A/N283Y和A241P/A116V/G253A/Q379P的Tm值和50 ℃相對(duì)酶活力結(jié)果顯示,兩者在50 ℃的相對(duì)酶活力均比M3低,而M4(A241P/A116V/G253A/Q379P)半衰期顯著提升,為628.4 min,Tm值也達(dá)到了59.5 ℃。當(dāng)以M4繼續(xù)構(gòu)建M5(A241P/A116V/G253A/Q379P/N283Y)時(shí),50 ℃的相對(duì)酶活力明顯降低,結(jié)合半衰期繪制迭代突變階梯圖5-e,確定最優(yōu)突變體為M4。對(duì)M4進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)探究,結(jié)果如圖4-f、圖4-g所示,M4的最適反應(yīng)溫度為45 ℃,最適反應(yīng)pH值為6.5。與WT相比,最適反應(yīng)溫度提高了15 ℃,最適反應(yīng)pH無(wú)明顯變化。

a-兩點(diǎn)組合突變體半衰期擬合曲線圖;b-三點(diǎn)組合突變體半衰期擬合曲線圖;c-四點(diǎn)組合突變體和五點(diǎn)組合突變體時(shí)半衰期擬合曲線圖; d-突變體相對(duì)酶活力;e-迭代突變階梯圖;f-溫度對(duì)M4酶活力的影響;g-pH對(duì)M4酶活力的影響圖4 突變體50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力、半衰期擬合曲線圖和溫度、pH對(duì)M4酶活力的影響Fig.4 Relative enzyme activity and half-life fitting curve of mutants at 50 ℃ and effects of temperature, pH on activity of M4

表4 突變體的熱熔融溫度(Tm)和ΔTm值Table 4 The melting temperature (Tm) and ΔTm of mutants

2.5 突變體熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制分析

RMSD值表示分子結(jié)構(gòu)變化的程度,值越小說(shuō)明蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[18],如圖5-a所示,在323 K的條件下M4的RMSD值明顯低于WT,由此說(shuō)明,M4突變體的蛋白質(zhì)構(gòu)象位移較小,酶整體柔性有所降低。為進(jìn)一步分析熱穩(wěn)定性提高機(jī)制,計(jì)算WT和M4的RMSF值,如圖5-a所示。將241位的ALA突變?yōu)镻RO、379位的GLN突變?yōu)镻RO之后,折疊自由能分別降低1.79、2.06 kcal/mol,殘基227～246區(qū)域和殘基377～394區(qū)域的RMSF值明顯降低,表明該區(qū)域引入突變后,增大了局部構(gòu)象的穩(wěn)定性。由圖5-b可知,PRO-241和PRO-379位于loop區(qū)域,HUANG等[19]研究證明在loop區(qū)域引入脯氨酸可以降低蛋白質(zhì)去折疊的骨架熵,增加蛋白質(zhì)的剛性,顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

如圖5-b所示,VAL-116和ALA-253分別位于α4和α8螺旋上。當(dāng)116位的氨基酸由ALA變?yōu)閂AL之后,其與TRP-94的相互作用力發(fā)生了改變,與WT相比,M4中增加了一個(gè)π—α疏水作用力,折疊自由能降低1.24 kcal/mol。253位的氨基酸從GLY變?yōu)锳LA之后,雖然其與周圍氨基酸的作用力中少了一個(gè)氫鍵,但是與α9螺旋上ALA-278和LEU-281分別形成了π—烷基疏水作用力,折疊自由能降低1.67 kcal/mol。因此,M4中116位VAL和253位ALA與周圍氨基酸之間的疏水作用增強(qiáng),使得蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性提高。

a-WT與M4的RMSD值和RMSF值;b-突變位點(diǎn)在D-MIase三維結(jié)構(gòu)中的位置(藍(lán)色標(biāo)出);c-WT中ALA-116與TRP-94的相互作用力; d-M4中VAL-116與TRP-94的相互作用力;e-WT中GLY-253與周圍氨基酸之間的作用力;f-M4中ALA-253與周圍氨基酸之間的作用力圖5 WT與M4的RMSD、RMSF值和突變位點(diǎn)與周圍氨基酸的相互作用力示意圖Fig.5 The RMSD and RMSF value of WT and M4 and interactions between mutations and surrounding amino acids注:黃色虛線為氫鍵,粉色虛線為π—烷基疏水作用力,紫色虛線為π—σ疏水作用力。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)大腸桿菌Dh5α來(lái)源的D-MIase酶進(jìn)行了異源表達(dá),蛋白經(jīng)純化后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究分析,其酶學(xué)性質(zhì)探究結(jié)果顯示,D-MIase的最適溫度為30 ℃,最適pH值為6.0～7.0,當(dāng)以D-果糖為底物時(shí),Km為963.4 mmol/L,反應(yīng)最大速率Vmax為12.66 mmol/(L·min)。通過(guò)FireProt網(wǎng)站和序列比對(duì)的方法對(duì)其進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,經(jīng)過(guò)篩選后獲得5個(gè)優(yōu)勢(shì)突變體,并進(jìn)行迭代突變,最終獲得了熱穩(wěn)定性提高顯著且在50 ℃條件下酶活力提高了60%的M4突變體A241P/A116V/G253A/Q379P,其在50 ℃的半衰期比WT提高了32倍,最適反應(yīng)溫度也提高了15 ℃。

在熱穩(wěn)定性改造過(guò)程中,熱穩(wěn)定性改善的突變體其活性通常會(huì)降低,這是酶設(shè)計(jì)中常見(jiàn)的活性-穩(wěn)定性平衡,如杜建輝等[20]研究獲得的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶突變體,其t1/2(60 ℃)提升2.06倍,比酶活力下降13.2%。因此,如何降低或避免活性-穩(wěn)定性平衡是研究者們迫切希望解決的問(wèn)題。SIDDIQUI[21]對(duì)活性-穩(wěn)定性平衡進(jìn)行研究并得出結(jié)論:活性-穩(wěn)定性平衡是可以克服的,并提出水置換、表面改性等建議。酶活性與穩(wěn)定性的關(guān)系復(fù)雜,但是兩者同時(shí)得到提升對(duì)于酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。本研究獲得的突變體M4其熱穩(wěn)定性提升的同時(shí),酶活力也提高了60%,使得生物酶法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)D-甘露糖的可能性增加。

近年來(lái),隨著生物信息學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,半理性/理性設(shè)計(jì)逐步發(fā)展起來(lái),如FRESCO、FireProt、PROSS等多重計(jì)算策略,為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的改造提供了更多的思路及途徑[22]。同時(shí),分子動(dòng)力學(xué)基于經(jīng)典力學(xué)進(jìn)行計(jì)算模擬,是研究結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、酶與配體相互作用的有利的輔助計(jì)算工具。本研究通過(guò)AMBER進(jìn)行模擬并計(jì)算RMSD值,發(fā)現(xiàn)M4突變體的整體柔性降低,進(jìn)一步計(jì)算RMSF值并分析發(fā)現(xiàn),loop區(qū)域的ALA-241和GLN-379突變?yōu)楦彼岷?該區(qū)域的構(gòu)象穩(wěn)定性提升明顯,而大量研究表明引入脯氨酸可以增加蛋白質(zhì)的剛性[19]。此外,蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的提高或降低受氫鍵、疏水相互作用等眾多因素影響[22],在本研究中,ALA-116和GLY-253在突變后疏水作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性得到大幅度提升。

本研究表征了大腸桿菌Dh5α來(lái)源的D-MIase酶學(xué)性質(zhì),并且經(jīng)過(guò)理性改造獲得了熱穩(wěn)定性大幅度提高的突變體,為生物酶法高效制備D-甘露糖提供了理論依據(jù),也給D-MIase熱穩(wěn)定性改造奠定理論基礎(chǔ)。針對(duì)本研究中各個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性特征,后續(xù)可對(duì)各個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變并利用分子動(dòng)力學(xué)模擬并進(jìn)行機(jī)理分析,進(jìn)一步分析D-MIase結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性和酶活力的相關(guān)性。