吳桐,程中一,周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase;EC4.2.1.84)[1-2]是一種金屬酶,可以在溫和的反應(yīng)條件下催化腈類物質(zhì)生成對(duì)應(yīng)的酰胺[3]。雖然腈水合酶已經(jīng)成功應(yīng)用于煙酰胺和丙烯酰胺的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[4-5],但是其完整的催化機(jī)制仍然不為人知,學(xué)者們已經(jīng)為此進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)和理論研究[6]。

常規(guī)的腈水合酶有異源的α和β兩個(gè)亞基[7-8],其可以結(jié)合成異源二聚體、四聚體、或者更高的聚合形式[9]。存在于腈水合酶基因簇下游的調(diào)控蛋白基因幾乎存在于已知的所有腈水合酶,它對(duì)腈水合酶的金屬攝取和翻譯后修飾是必不可少的[10-12](唯一例外的是來(lái)自于M.brevicollis的CtNHase,至今沒(méi)有關(guān)于它的調(diào)控蛋白的報(bào)道[13])。根據(jù)活性中心金屬離子的不同可以將腈水合酶分為鐵型腈水合酶(Fe-NHase)和鈷型腈水合酶(Co-NHase)。所有已知腈水合酶的金屬結(jié)合位點(diǎn)都存在于α亞基上[14],它們都含有一段共同的金屬結(jié)合基序[CXLC(SO2H)SC(SOH)],這段序列包含了2個(gè)氧化的半胱氨酸[7, 15]。質(zhì)譜已經(jīng)證明2個(gè)氧化的半胱氨酸和金屬離子組成了一個(gè)獨(dú)特的配位結(jié)構(gòu),被稱為“爪形”結(jié)構(gòu)[16-17]。

硫氰酸水解酶(SCNase)是一種主要來(lái)自于硫桿菌屬的含鈷酶,能夠催化焦化廢水中的主要成分-硫氰酸鹽降解(SCN-+2H2O→COS+NH3+OH-),它由α,β,γ 3個(gè)亞基組成[18]。γ亞基與腈水合酶的α亞基有很高的序列相似度,α亞基和β亞基分別與腈水合酶β亞基的N端和C端相似。硫氰酸水解酶與腈水合酶同屬一個(gè)超家族,雖然SCNase在結(jié)構(gòu)上與Co-NHase有很高的相似性,包括一個(gè)獨(dú)特的低自旋三價(jià)Co催化中心和2個(gè)氧化的半胱氨酸配體,但是它們只作用于各自的底物[19]。研究表明它們的底物結(jié)合口袋有差異,這可能是其活性不互通的原因[20]。SCNase可以降解硫氰酸鹽,這種物質(zhì)通常在采礦、紡織的工業(yè)廢水中大量存在,不僅對(duì)環(huán)境造成污染,對(duì)人類也有嚴(yán)重的毒害作用。因此對(duì)硫氰酸鹽的研究可能幫助解決工業(yè)廢水的排污問(wèn)題。

通過(guò)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)里搜尋,我們發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)源于Roseomonasstagni的新基因型的SCNase,其3個(gè)亞基的Genbank編號(hào)分別為SAMN02745775_103231、SAMN02745775_103232和SAMN02745775_103230。這3個(gè)亞基中SAMN02745775_103231所編碼的亞基與腈水合酶α亞基有較高的相似度,其余2個(gè)亞基分別與常規(guī)腈水合酶β亞基的N端和C端同源。本研究表達(dá)、純化并且對(duì)這個(gè)特殊的腈類降解酶(Rose.sSCNase)進(jìn)行了表征。有趣的是,Rose.sSCNase不僅能催化腈類底物,對(duì)硫氰酸鉀也有催化活性,這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)存在活性互通的腈類降解酶。Rose.sSCNase可能對(duì)含氰基底物降解研究有巨大的幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

由金唯智生物技術(shù)有限公司合成玫瑰單胞菌Rose.sSCNase基因,克隆到pET-Duet質(zhì)粒上。Rose.sNHase在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達(dá)。吡啶和酰胺購(gòu)自TCI(上海)發(fā)展有限公司。所有其他化學(xué)品都是通過(guò)商業(yè)途徑獲得的。

100 mmol/L KPB緩沖液:磷酸氫二鉀13.95 g、磷酸二氫鉀10.92 g,用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH為7.4,定容至1 L。蛋白純化用Binding buffer:10 mmol/L KPB緩沖液。Washing buffer:在上述Binding buffer中加入終濃度為500 mmol/L的氯化鈉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息分析

利用NCBI-blast工具,將含有CTLCSC基序的酶進(jìn)行初篩。調(diào)查研究背景,利用DNAMAN對(duì)酶活性中心的氨基酸序列進(jìn)行復(fù)篩。最終選擇來(lái)源于玫瑰單胞菌Roseomonasstagni的腈水合酶(Rose.sSCNase)進(jìn)行研究。并利用AlphaFold對(duì)所選酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

將Rose.sSCNase進(jìn)行密碼子優(yōu)化,將優(yōu)化好的序列送至金唯智公司進(jìn)行基因合成。各亞基前添加T7啟動(dòng)子和優(yōu)化過(guò)的RBS序列(AAGGAGATATAGAT)使其共表達(dá)。選擇pET-Duet-1為連接載體,基因插入位置為NdeⅠ和EcoRⅠ2個(gè)酶切位點(diǎn)。將連接成功的質(zhì)粒pETDuet-1-Rose.sSCNase轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板上。37 ℃倒放靜置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接于含有100 μg/mL氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中。37 ℃,200 r/min培養(yǎng)8 h左右。將試管種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有100 μg/mL氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基搖瓶中。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)[21],添加不同終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)和0.05、0.1、0.2、0.3 g/L Co2+的誘導(dǎo)劑,25 ℃,200 r/min誘導(dǎo)16 h。離心收菌并用10 mmol/L KPB重懸、破碎細(xì)胞、獲取上清液并通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 酶的分離純化及濃度檢測(cè)

因標(biāo)簽純化該酶效果較差,故采用傳統(tǒng)硫酸銨沉淀、陰離子層析交換、凝膠柱過(guò)濾的方法分布進(jìn)行純化。具體步驟為將細(xì)胞破碎獲取上清液定容至30 mL。參照硫酸銨飽和度計(jì)算表(0 ℃),逐步緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為20%、40%、60%及80%的硫酸銨粉末,邊緩慢加入邊攪拌直至硫酸銨充分溶解。過(guò)程中要嚴(yán)格監(jiān)測(cè)pH值和溫度變化,防止蛋白到達(dá)等電點(diǎn)或高溫變性沉淀。過(guò)程中可利用氨水和磷酸二氫鉀緩沖對(duì)調(diào)節(jié)pH值。每加完一個(gè)濃度梯度后繼續(xù)攪拌30 min,然后用離心機(jī)以12 000 r/min離心 20 min,重懸沉淀并收集上清液用于下一個(gè)梯度的硫酸銨沉淀。如此往復(fù),直到硫酸銨溶液的飽和度為80%。每次收集的沉淀用適量10 mmol/L KPB緩沖液重懸,用于SDS-PAGE分析,由此確定目的蛋白所在的沉降區(qū)間,為下一次操作簡(jiǎn)化步驟。獲得的含有目的蛋白的沉淀用10 mmol/L KPB緩沖液重懸至10 mL,并在4 ℃層析柜中透析12 h,期間每4 h更換一次透析液來(lái)去除高濃度的鹽離子。

Rose.sSCNase的理論等電點(diǎn)在5左右,所以選取DEAE陰離子交換柱,進(jìn)一步純化透析好的蛋白[22]。首先用Binding-Buffer平衡,然后上樣,再用Washing-Buffer進(jìn)行線性洗脫(0～500 mmol/L NaCl),將不同UV吸收峰的蛋白進(jìn)行收集,SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白的洗脫范圍[23]。

凝膠過(guò)濾層析對(duì)以上獲得的蛋白樣品中含有分子質(zhì)量差異較大雜蛋白的樣品進(jìn)行分離。本研究中使用的凝膠柱為Superdex G200。首先用10 mmol/LKPB緩沖液以0.5 mL/min的流速平衡柱子,通過(guò)Loop環(huán)注入少量樣品(300～500 μL),切換流動(dòng)線路使樣品進(jìn)入凝膠柱中進(jìn)行分離。最后根據(jù)吸收值再進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。得到的蛋白用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后稀釋至質(zhì)量濃度1 mg/mL備用。

1.2.4 酶活力檢測(cè)

本研究中腈水合的活性通過(guò)催化腈類生成相應(yīng)的酰胺量來(lái)計(jì)算[24]。反應(yīng)體系為490 μL煙腈(200 mmol/L)及 10 μL酶溶液,在不同溫度的金屬浴中反應(yīng)10 min,然后加入500 μL純乙腈終止反應(yīng)。反應(yīng)液使用0.22 μm的有機(jī)微孔過(guò)濾膜過(guò)濾,用HPLC檢測(cè)樣品。HPLC使用的色譜柱為C18反相色譜柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm,流動(dòng)相為體積比為1∶2的乙腈與水的混合溶液。根據(jù)不同濃度煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)吸收值作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并依此計(jì)算樣品中的煙酰胺濃度。催化煙腈的酶活力單位定義為:在相應(yīng)條件下每分鐘催化煙腈生成1 μmol煙酰胺所需要的酶量。催化丙烯腈的酶活力單位定義為:在相應(yīng)條件下每分鐘催化丙烯腈生成1 μmol丙烯酰胺所需要的酶量。

水解硫氰酸鹽的活性通過(guò)催化硫氰酸鉀生成的銨鹽的量來(lái)計(jì)算,銨鹽檢測(cè)使用銨鹽檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)。反應(yīng)體系為450 μL硫氰酸鉀(50 mmol/L)及50 μL酶溶液,在不同溫度的金屬浴中反應(yīng)10 min,然后100 ℃加熱20 min終止反應(yīng)。硫氰酸水解酶的酶活力單位定義為:在相應(yīng)條件下每分鐘催化硫氰酸鉀生成1 μmol銨鹽所需要的酶量。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

最適溫度:分別測(cè)定該酶在20、30、40、50、60、70 ℃下的酶活力。

最適pH:配制含有終濃度為200 mmol/L煙腈、丙烯腈和終濃度為50 mmol/L硫氰酸鉀的不同pH梯度(pH=4、5、6、7、8、9)的10 mmol/L磷酸鉀緩沖液,測(cè)定該酶在各pH底物緩沖溶液下的酶活力,分析其隨pH的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rose.s NHase基因的異源表達(dá)及其分離純化

圖1為用于表達(dá)Rose.sSCNase的質(zhì)粒示意圖。pETDuet-1作為載體,RBS是核糖體結(jié)合位點(diǎn),質(zhì)粒上帶有氨芐青霉素抗性基因。

圖1 表達(dá)含有βN、βC、α亞基的Rose.s SCNase的質(zhì)粒Fig.1 Expression plasmid of Rose.s SCNase containing βN, βC and α subunits

優(yōu)化劑濃度初步的確定參照文獻(xiàn)[25-26]的要求。Co2+對(duì)腈水合酶翻譯后修飾和發(fā)揮活性具有重要作用,過(guò)高濃度的Co2+會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)從而影響蛋白的表達(dá)。IPTG也對(duì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)有影響。因此對(duì)Co2+和IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示,從SDS-PAGE圖中確定最佳誘導(dǎo)條件為Co2+0.1 g/L、IPTG 0.6 mmol/L。

圖2 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of optimized induced expression conditions

因Strep親和層析純化效果不佳,因此在純化策略上選擇硫酸銨沉淀-陰離子交換-凝膠柱分步的方法。分級(jí)硫酸銨沉淀的結(jié)果如圖3-a所示,目的蛋白在飽和度20%～40%析出最多,通過(guò)硫酸銨沉淀,基本去除了雜蛋白。該酶的理論等電點(diǎn)為5.2,因此采用DEAE陰離子柱交換進(jìn)行進(jìn)一步純化,最后經(jīng)過(guò)凝膠柱分離,得到了純度>95%的蛋白,成功實(shí)現(xiàn)了其純化(圖3-b)。

a-Rose.s SCNase分級(jí)硫銨沉淀樣品的SDS-PAGE分析; b-Rose.s SCNase純化的SDS-PAGE分析圖3 Rose.s SCNase純化過(guò)程的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification process of Rose.s SCNase

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的分析

不同的反應(yīng)溫度對(duì)Rose.sSCNase酶活的影響如圖4-a所示,該酶對(duì)腈類和硫氰酸鉀底物的最適溫度均為40 ℃。催化腈類底物的最適pH為7.0,降解硫氰酸鉀的最適pH為6.0(圖4-b)。這表明Rose.sSCNase是中性的。

a-不同底物的最適溫度;b-不同底物的最適pH圖4 Rose.s SCNase的酶學(xué)性質(zhì)Fig.4 Enzymatic properties of Rose.s SCNase

與其他腈類降解酶相比,Rose.sSCNase最為獨(dú)特的是它同時(shí)擁有硫氰酸水解酶和腈水合酶2種酶的活性。該酶在最適pH和溫度下對(duì)煙腈的比酶活為(17.8±1.3) U/mg,對(duì)丙烯腈的比酶活為(30.6±1.9) U/mg,對(duì)硫氰酸鉀的比酶活為(13.5±0.9) U/mg。具體見表1。

表1 Rose.s Nhase最適條件下的活性Table 1 activity of Rose.s Nhase under optimum conditions

2.3 序列比對(duì)

將Rose.sSCNase的氨基酸序列與Th-Scnase、Pt-NHase的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如圖5所示。Rose.sSCNase與Th-Scnase和Pt-NHase α亞基的相似度為65.05%,β亞基的相似度為36.32%。且均含有鈷離子結(jié)合位點(diǎn)CTLCSC。

a-α亞基序列對(duì)比;b-β亞基序列比對(duì)圖5 Rose.s SCNase與Th-SCNase和ptNhase的序列比對(duì)Fig.5 Enzymatic properties of Rose.s SCNase注:紅色表示在該位置有相同的氨基酸。

2.4 結(jié)構(gòu)分析

圖6為使用AlphaFold預(yù)測(cè)得到的Rose.sSCNase的結(jié)構(gòu)。用Verify 3D服務(wù)器對(duì)獲得的模型進(jìn)行評(píng)估,最高得分為99.16%,表明所得的三維結(jié)構(gòu)比較可靠。用所獲得的結(jié)構(gòu)進(jìn)行下一步結(jié)構(gòu)比對(duì)。

根據(jù)之前的報(bào)道,腈水合酶和硫氰酸水解酶雖屬于同一家族但活性并不互通。2014年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)是其底物結(jié)合口袋不同導(dǎo)致了不同的底物選擇性[20]。作者將硫氰酸水解酶底物結(jié)合口袋頂部2個(gè)精氨酸分別突變成了苯丙氨酸Phe和色氨酸Trp,這2個(gè)突變體喪失了降解硫氰酸鹽的活性,同時(shí)卻產(chǎn)生了腈水合酶的活性?；谶@一研究,我們將Rose.sSCNase與嗜熱假諾卡氏菌P.thermophilaJCM3095腈水合酶(Pt-NHase)和ThiobacillusthioparusTHI115來(lái)源的硫氰酸水解酶(Th-SCnase)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),二者的RMSD值分別為0.96和0.88,這表明這株新的腈類降解酶與腈水合酶和硫氰酸水解酶均有較高的結(jié)構(gòu)相似度。結(jié)構(gòu)對(duì)比上更偏向硫氰酸水解酶,所以本研究中命名其為Rose.sSCNase。

比對(duì)結(jié)果顯示三者的底物結(jié)合口袋非常相似。不同之處在于活性金屬上方頂部空間的氨基酸(圖7)。Rose.sSCNase和Th-SCnase在此位置是精氨酸Arg,精氨酸側(cè)鏈向口袋延伸,可使底物結(jié)合口袋頂部空間呈正電,更有利于結(jié)合硫氰酸鹽底物。而Pt-NHase對(duì)應(yīng)的位置是色氨酸Trp,這個(gè)疏水基團(tuán)可能更有利于其捕獲腈類底物。且色氨酸向口袋頂部延伸,增高了頂部空間,更有利于腈類底物進(jìn)入活性中心。

a-Rose.s SCNase與Pt-NHase結(jié)合口袋對(duì)比圖; b-Rose.s SCNase與Th-SCnase結(jié)合口袋對(duì)比圖圖7 Rose.s SCNase底物結(jié)合口袋比對(duì)圖Fig.7 Comparison of substrate binding pocket of Rose.s NHase注:綠色為Rose.s SCNase,青色為Pt-NHase,紫色為Th-SCNase, 黃色代表關(guān)鍵位置上精氨酸Arg,橙色代表關(guān)鍵位置上的色氨酸Trp, 紫色球代表活性中心的Co。

3 結(jié)論

本文成功優(yōu)化了Rose.sSCNase的異源表達(dá),并通過(guò)硫酸銨沉淀、陰離子交換和凝膠柱過(guò)濾的方法實(shí)現(xiàn)了其純化。與傳統(tǒng)的腈水合酶不同的是Rose.sSCNase對(duì)腈類底物和硫氰酸鉀均具有催化活性。Rose.sSCNase在最適條件下對(duì)煙腈的比酶活為(17.8±1.3) U/mg,對(duì)丙烯腈的比酶活為(30.6±1.9) U/mg,對(duì)硫氰酸鉀的比酶活為(13.5±0.9) U/mg。比對(duì)Rose.sSCNase、Pt-NHase和Th-SCnase的底物結(jié)合口袋的氨基酸,發(fā)現(xiàn)活性金屬頂部的氨基酸有差異,這可能控制了酶的選擇性。