吳敏,張健,瑪依努爾·扎衣提,翟榮臻,張政,魏佳,吳斌*,吳忠紅*

1(新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830052) 2(新疆農業(yè)科學院農產品貯藏加工研究所,新疆農產品加工與保鮮重點實驗室,新疆 烏魯木齊,830091)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上重要的經濟作物之一,也是我國重要的經濟水果。紅地球葡萄因其味道甜美、汁液豐富而深受消費者喜愛,具有巨大的經濟和營養(yǎng)價值。除此之外,葡萄和葡萄產品還具有廣泛的健康益處,現代醫(yī)學研究表明,其富含的酚類和其他生物活性物質,具有很高的抗氧化潛力,可以預防人類的各種慢性疾病[1]以及癌癥[2],還可以作為皮膚美容劑促進皮膚細胞更生[3]。然而,葡萄采后容易出現果實軟化、腐爛和果梗褐變等問題,這嚴重影響了葡萄的商品性。

近年來,學者們就葡萄采后保鮮技術開展了創(chuàng)新性研究,例如:γ-氨基丁酸、水楊酸和殼聚糖涂膜等被研發(fā)[4-6]。然而,二氧化硫(sulfur dioxide, SO2)在延長鮮食葡萄商業(yè)化貯運保鮮的過程中仍被大規(guī)模使用[7]。至今為止,還沒有一種技術方法可以替代SO2的使用。一方面可能是由于SO2的抑菌作用維持了果蔬采后品質,例如有效改善荔枝、紅毛丹果實外觀[8],減少藍莓的腐爛程度[9],維持櫻桃貯藏期間的果實品質[10]等。另一方面,SO2可通過維持葡萄果實硬度和細胞壁代謝,保持葡萄的貯藏品質[11],也可通過激活苯丙烷代謝途徑和增強抗病蛋白的表達,保持葡萄果實的營養(yǎng)和風味[12]。此外,從轉錄水平進一步發(fā)現了與葡萄果實軟化和膜脂過氧化相關的靶基因[13]。上述結果表明,SO2對葡萄采后品質的影響可能與其代謝調節(jié)作用有關。

研究發(fā)現,代謝產物作為生物體在內外因素作用下基因轉錄和蛋白表達的最終結果,是生物體表型的基礎物質[14]。與此同時,代謝產物又可以影響或調節(jié)基因的表達和活性。因此,代謝組物質信息更加接近生物體表型,可以幫助人們更好地了解生物體中各種復雜的相互作用及其本質。研究者可以提取相關的生物代謝標志物或標志物簇,通過分析尋找受影響的相關代謝途徑,確立代謝網絡的調控機制[15]。近年來,代謝組學分析技術在果蔬研究中相繼開展,已廣泛應用于植物科學領域高通量研究。目前,利用代謝組學技術不僅探究了紫外線輻射下甜櫻桃類黃酮和花青素生物合成的分子機制[16],而且分析了黃酮類化合物在獼猴桃不同組織中積累的分子機制[17],還獲得了黃酮類和脂質化合物與辣椒變色的關系[18]。此外,采用代謝組學技術還揭示了灌溉技術對赤霞珠果實漿果花青素生物合成和代謝的影響機制[19]。因此,為了更好地了解SO2調節(jié)葡萄貯藏期間果實中代謝物的變化,本研究基于親水相互作用液相色譜-超高效液相色譜與四極桿飛行時間質譜聯用技術(hydrophilic interaction liquid chromatography ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, HILIC UHPLC-Q-TOF MS)的非靶向代謝組學分析方法,探究了葡萄采后品質保鮮過程中的動態(tài)圖譜變化特性。研究結果有助于進一步闡明SO2對葡萄采后貯藏保鮮過程果實品質的調控作用,并為豐富SO2在貯藏保鮮領域的作用機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅地球葡萄(可溶性固形物含量≥18%)于2021年9月采收自新疆烏魯木齊市—八鋼。挑選成熟度一致、大小均一、無機械損傷、無病害的葡萄為實驗樣品。采收后立即用冷鏈車運至新疆烏魯木齊市格瑞德保鮮科技有限公司冷庫,在(0±0.5) ℃預冷24 h。

乙酸銨,Sigma公司;乙腈,Merck公司;氨水、甲醇、硫代巴比妥酸、三氯乙酸,烏魯木齊國耀化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

DDS-11A電導率儀,上海大普儀器有限公司;GY-4硬度計,艾德堡儀器有限公司;UV-2600紫外分光光度計,日本島津有限公司;Triple TOF 5600+質譜儀,美國AB SCIEX公司;Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀,美國Agilent公司;Himac CR-20B2大型臺式冷凍離心機、5430R低溫高速離心機,德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

紅地球葡萄預冷后隨機分為2組,每份約重2.0 kg,放入框內,處理組放入SO2保鮮紙(對照組未放置SO2保鮮紙),框內上下襯有吸水紙,放入PE保鮮袋,扎緊袋口后貯藏64 d。貯藏過程中,每隔8 d取樣。

1.3.2 腐爛率的測定

腐爛率的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.3 硬度的測定

采用GY-4型果實硬度計,隨機取9顆葡萄,在果實赤道部位進行測定,探頭直徑為3 mm,刺入深度為10 mm,單位N。

1.3.4 相對電導率和丙二醛的測定

參考游玉明等[20]的方法進行測定,稱取的1.0 g葡萄果實置于燒杯中,加入50 mL蒸餾水,靜置2 h后,測定浸泡液的電導率。再將葡萄果實煮沸15 min,待液體冷卻后再次測定電導率,重復測定3次,相對電導率的計算如公式(2)所示:

(2)

采用硫代巴比妥酸比色法[20]測定丙二醛。測定上清液在600、532、450 nm處的吸光度值。

1.3.5 葡萄果實預處理

腐爛率是衡量果實品質的重要指標,因此,本研究選取葡萄果實貯藏0、24、48 d進行代謝組學分析。將樣品用液氮研磨后加入400 μL預冷甲醇/乙腈/水溶液(4∶4∶2,體積比),渦旋混合,-20 ℃靜置60 min,14 000×g4 ℃離心20 min,取上清液真空干燥,質譜分析時加入100 μL乙腈水溶液(乙腈與水,體積比1∶1)復溶,渦旋,14 000×g4 ℃離心15 min,取2 μL上清液進樣分析,重復3次[21]。

1.3.6 色譜-質譜分析

色譜條件:樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱進行分離,柱溫25 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量2 μL;流動相組成A:水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水,B:乙腈;梯度洗脫程序如下:0～1 min,95% B;1～14 min,B從95%線性變化至65%;14～16 min,B從65%線性變化至40%;16～18 min,B維持在40%;18～18.1 min,B從40%線性變化至95%;18.1～23 min,B維持在95%;整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。樣品經UHPLC分離后用Triple TOF 6600質譜儀(AB SCIEX)進行質譜分析。

Q-TOF質譜條件:電噴霧電離(electron spray ionization, ESI)用于檢測正離子和負離子。ESI源的工作參數如下:離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)和簾式氣體(CUR)分別設置為60、60和30;源溫度:600 ℃,離子噴射電壓(IS)±5 500 V(正、負離子模式);TOF MS掃描m/z范圍:60～1 000 Da,產品離子掃描m/z范圍:25～1 000 Da,TOF MS掃描累積時間0.20 s/光譜,產品離子掃描累積時間0.05 s/光譜。通過進一步的去簇電壓和碰撞能優(yōu)化,完成了單個質譜多反應監(jiān)測轉換的去簇電壓和碰撞能。根據在此期間洗脫的代謝物,對每個時期的一組特定質譜多反應監(jiān)測轉換進行監(jiān)測。

1.4 數據處理

應用軟件SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,Sweden)對數據進行模式識別。通過KEGG數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)對差異代謝物進行注釋和分類。使用Excel 2019軟件進行數據整理,SPSS Statistics 26軟件進行顯著性分析,Sigma Plot 14.0(Systat software Inc, San Jose, CA, USA)軟件作圖。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SO2處理對紅地球葡萄貯藏品質的影響

腐爛率是衡量果實品質的重要指標,由圖1-A可知,果實腐爛率隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。貯藏初期,葡萄果實未出現腐爛,貯藏24 d時,對照組出現腐爛;貯藏48 d時,對照組腐爛率為25.68%,處理組出現腐爛;貯藏56 d時,對照組腐爛率為38.02%,已喪失商品性,而SO2處理能明顯抑制果實腐爛。在整個貯藏期間,果實硬度(圖1-B)呈下降趨勢。貯藏48、56、64 d,處理組的硬度分別是對照組的1.26、1.24和1.37倍,差異極顯著(P<0.01)。

果實電導率(圖1-C)隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢,貯藏32 d后,與對照組相比SO2處理組顯著抑制了電導率的增加。貯藏40、48、56、64 d時,對照組果實電導率比處理組分別高1.26、1.24、1.26和1.37倍,差異極顯著(P<0.01)。在整個貯藏期間,丙二醛含量也呈上升趨勢(圖1-D),貯藏32 d后,SO2處理組的丙二醛含量與對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。貯藏48、56、64 d,對照組丙二醛含量分別是處理組的1.51、1.61和1.67倍。結果表明,SO2處理維持葡萄果實的品質,延長葡萄貯藏期與‘陽光玫瑰’和醉金香葡萄對SO2處理的響應一致[11-12]。

A-果實腐爛率;B-硬度;C-電導率;D-丙二醛圖1 SO2處理對果實腐爛率、硬度、電導率和丙二醛的影響Fig.1 Effect of SO2 treatment on fruit decay rate, hardness, electrical conductivity and malondialdehyde

2.2 代謝組學數據質量評估

非靶向代謝組學服務應用于鑒定葡萄采后貯藏階段的不同初級代謝產物(氨基酸等)和次級代謝產物(類黃酮等)。本實驗采用HILIC UHPLC-Q-TOF MS技術對葡萄樣本進行全譜分析。對葡萄果實的質控樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖,進行譜圖重疊比較(圖2)。結果表明,總離子流圖譜重疊性較高,可以保證果實代謝組數據的可靠性和重復性。

2.3 正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)

由OPLS-DA模型得分圖(圖3)可知,各組內樣本均位于同一側,各組間樣本均分別位于兩側,表明貯藏不同時期/處理組的果實樣本在小分子代謝物水平上發(fā)生了變化,具有顯著代謝差異。由本實驗的正、負離子模型評價參數(表1)可知,貯藏24 d,SO2處理組/對照組,正離子模式R2X=0.831,R2Y=1,Q2=1,負離子模式R2X=0.817,R2Y=1,Q2=1;貯藏48 d,SO2處理組/對照組,正離子模式R2X=0.85,R2Y=1,Q2=0.999,負離子模式R2X=0.838,R2Y=1,Q2=1,結果表明,OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠。

A-正離子模式;B-負離子模式圖2 質控樣品正負離子模式全離子色譜法重疊圖譜Fig.2 Total ion chromatography overlapping map of positive and negative ion mode of quality control sample

2.4 單變量統(tǒng)計分析

根據OPLS-DA模型計算得到變量權重值(variable important in projection, VIP),本實驗以VIP>1和P<0.05為篩選標準,確定顯著差異代謝物。為了直觀地顯示樣本之間代謝物變化的顯著性,對差異代謝物進行單變量統(tǒng)計分析。由圖4可知,貯藏24 d相比于原始樣品(圖4-B)更多下調代謝物的表達,SO2處理(圖4-A)更多上調了代謝物的表達,貯藏48 d,差異代謝物在顯著性和的豐度上,較貯藏24 d,差異均較小。結果表明,在整個貯藏期間,對照組更多下調代謝物的表達,與之相比,處理組更多上調代謝物的表達。

2.5 差異代謝物KEGG分析

富集分析(圖5)表明,貯藏24 d(圖5-B),對照組差異代謝物主要富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、2-氧羰基酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、C5支化二元酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、甘油酯代謝、玉米素生物合成和輔助因子的生物合成等途徑。貯藏48 d(圖5-D),對照組主要在抗壞血酸和

圖3 組間樣品OPLS-DA正、負離子得分圖Fig.3 Positive and negative ion scores of OPLS-DA samples between groups注:A(A′)、B(B′)、C(C′)、D(D′)分別代表葡萄果實SO2貯藏24 d/CK貯藏24 d、CK貯藏24 d/0 d;、SO2貯藏48 d/CK貯藏48 d、 CK貯藏48 d/CK貯藏24 d的正(負)離子得分圖。

表1 組間樣品OPLS-DA模型評價參數Table 1 Evaluation parameters of OPLS-DA model for inter group samples

醛酸代謝、類黃酮生物合成、ABC膜轉運蛋白途徑發(fā)生了顯著的變化。貯藏24 d(圖5-A),SO2處理組調控多個代謝途徑發(fā)生了顯著的變化,主要富集在氮代謝、精氨酸生物合成、維生素B6代謝、谷胱甘肽代謝、磷酸肌醇代謝、輔助因子的生物合成、氨酰tRNA生物合成、抗壞血酸和醛酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。貯藏48 d(圖5-C),SO2處理主要在類黃酮生物合成、C5支化二元酸代謝、賴氨酸生物合成、半乳糖代謝、賴氨酸降解、果糖和甘露糖代謝、異黃酮生物合成、氨基酸的生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成等途徑發(fā)生了顯著的變化。貯藏24 d,對照組葡萄果實差異代謝物,主要與氨基酸代謝及合成、碳水化合物代謝和膜脂代謝有關;貯藏48 d,主要與碳水化合物代謝、類黃酮生物合成和ABC膜轉運蛋白有關。結果表明,貯藏24 d,SO2處理顯著調控了氮代謝、氨基酸代謝、谷胱甘肽代謝和碳水化合物代謝等主要途徑的富集作用;貯藏48 d,SO2處理顯著調控了類黃酮生物合成、氨基酸代謝和碳水化合物代謝等主要途徑的富集作用。進一步探究差異代謝物KEGG富集分析和顯著差異代謝物,能夠更直觀地看到與類黃酮、氨基酸和脂質代謝等相關的代謝物的差異表達(表2、表3)。

A-SO2貯藏24 d/CK貯藏24 d;B-CK貯藏24 d/0 d;C-SO2貯藏48 d/CK貯藏48 d;D-CK貯藏48 d/CK貯藏24 d圖4 單變量統(tǒng)計分析Fig.4 Univariate statistical analysis注:圖中紅色表示下調代謝物;藍色表示上調代謝物;灰色表示組間沒有顯著差異。

A-SO2貯藏24 d /CK貯藏24 d;B-CK貯藏24 d/0 d;C-SO2貯藏48 d/CK貯藏48 d;D-CK貯藏48 d/CK貯藏24 d圖5 差異代謝物KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of differential metabolites

表2 對照組中主要差異代謝物Table 2 Main differential metabolites in the control group

表3 處理組與對照組中主要差異代謝物Table 3 Main differential metabolites in treatment and control group

3 討論

代謝組學結果表明,隨著貯藏時間延長,錦葵色素-3-O-β-D-半乳糖苷、棕矢車菊素、桑椹苷C、芍藥苷-3-O-β-D-葡萄糖苷等類黃酮類物質表達下調。貯藏前期,SO2處理抑制了異黃酮O-糖苷和3-羥基黃酮的表達,在紅地球葡萄貯藏試驗中,也觀察到貯藏前期,類黃酮物質被抑制的現象[12]。貯藏48 d,SO2處理顯著誘導了類黃酮-7-O-糖苷、柚皮素、表兒茶素、根皮素和3′-羥基芫花素等類黃酮物質合成。研究發(fā)現,葡萄果實中類黃酮物質具有很強的抗菌和抗氧化效果,可以直接或間接地清除自由基,減緩細胞的退化,與果蔬衰老密切相關[22]。同時,類黃酮含量的變化代表著果實對外界刺激的應答能力[23],而SO2處理誘導類黃酮物質合成,限制了病原微生物的進一步擴散。在整個貯藏期中,SO2處理促進了類黃酮類物質的生成,提高果實抗菌和抗氧化活性,有利于維持果實貯藏品質,與前人研究一致[11-12]。

氨基酸作為一種滲透調節(jié)物質,在維持代謝物和細胞離子平衡等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現,氨基酸與氧化脂質反應,可以產生具有抗氧化作用的次級產物[24],此外,谷氨酰胺作為氮供體是核苷酸生物合成所必需的,還作為碳源支持能量代謝[23]。本實驗中,SO2處理調控氨基酸代謝途徑,調控絲氨酸膽酸、谷氨酰胺和L-谷氨酰胺等物質,有利于維持果實貯藏品質,與前人研究一致[25]。

長鏈脂肪酸是果皮蠟質的主要成分,研究發(fā)現,果皮蠟質可以調控表皮細胞滲透性,抑制果實的軟化、失水、腐爛、活性氧積累和膜脂過氧化,抵御病菌入侵,增強防御相關基因表達[26-28]。可能是果皮蠟質通過增強果實表面疏水性,減少了病原菌的附著和入侵,而葡萄對灰霉菌的抗性與葡萄果皮蠟質含量存在高度相關性[29-30]。本實驗中,SO2處理顯著誘導了十七烷酸和糊精酸等長鏈脂肪酸,有利于促進果皮蠟質積累,進一步提高葡萄采后貯藏品質。

4 結論

本實驗基于HILIC UHPLC-Q-TOF MS技術,分析了SO2處理影響葡萄貯藏過程中的差異代謝物;通過KEGG代謝途徑探究了SO2處理對紅地球葡萄貯藏過程中的調控機制。研究結果表明,隨著貯藏時間的延長,葡萄果實品質不斷下降,而SO2處理通過維持果實硬度、推遲可溶固形物含量的下降、抑制腐爛率和丙二醛含量的上升、延緩細胞膜損傷,進而保持了果實貯藏品質。在整個貯藏過程中,SO2處理主要調控類黃酮、氨基酸和脂質代謝等途徑,可能是通過提高十七烷酸和糊精酸等長鏈脂肪酸含量,促進了果皮蠟質積累;同時,提高類黃酮-7-O-糖苷、柚皮素、根皮素、3'-羥基芫花素、谷氨酰胺和L-谷氨酰胺等代謝物含量的增加,誘導了內源抗氧化物積累,維持了細胞離子平衡。綜上所述,SO2處理通過調控這些差異代謝物,抑制葡萄果實細胞滲透性,有效清除自由基的積累,維持了細胞穩(wěn)態(tài),抑制了果實腐爛,對減緩果實品質劣變有積極作用。研究結果為進一步揭示SO2延緩貯藏過程中紅地球葡萄劣變的作用機理提供了新的思路。