王亞嬋,李陽陽,劉松*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)可以催化酯化、轉(zhuǎn)酯、水解、酸解等反應(yīng)[1-3]。在眾多脂肪酶中,南極假絲酵母脂肪酶B(Candidaantarcticlipase B,CALB)具有高對(duì)映選擇性及廣泛的底物范圍[4],在生物柴油的生產(chǎn)、對(duì)映體的拆分、甘油單酯的生產(chǎn)[5-8]等領(lǐng)域均有應(yīng)用。由于酶的反應(yīng)速率會(huì)隨著溫度的升高呈指數(shù)增加[9],且在工業(yè)中通常要求酶在嚴(yán)苛的條件下仍具有較好的穩(wěn)定性,所以酶在應(yīng)用時(shí)需要考慮其熱穩(wěn)定性。K?SE等[10]采用Novozym 435(商業(yè)化的固定化CALB)催化棉籽油和醇類生成甲酯,當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí),甲酯產(chǎn)量會(huì)降低4.2%。KIM等[11]等采用商業(yè)化的CALB在60 ℃下催化甘油和碳酸二甲酯轉(zhuǎn)化為碳酸甘油酯的效率降低7.3%。提高CALB的熱穩(wěn)定性成為其應(yīng)用于工業(yè)化需要解決的問題。

為了提高酶的穩(wěn)定性,理性設(shè)計(jì)、半理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化等[12]策略常被使用。半理性設(shè)計(jì)中的共識(shí)設(shè)計(jì)操作較簡單,在不需要準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的條件下就能進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的改造[13]。其基于以下原則:在進(jìn)化過程中,隨機(jī)突變很難提高蛋白的穩(wěn)定性,而同源蛋白中出現(xiàn)頻率較高的氨基酸(即保守氨基酸)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)要高于非保守氨基酸[14-15]。通過同源序列比對(duì)尋找保守氨基酸,這些氨基酸組成的序列稱為共識(shí)序列。將非保守氨基酸突變?yōu)楣沧R(shí)序列中的保守氨基酸,從而提高酶的穩(wěn)定性。STEVENS等[16]通過共識(shí)設(shè)計(jì)獲得一條共識(shí)快速DNA聚合酶III內(nèi)含子序列(Cfa),其剪切速率隨著溫度的增加而增加,且始終高于野生型的來源于NostocpunctiformePCC73102的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Npu(30 ℃下是Npu的2.5倍),80 ℃時(shí)雖然Cfa的剪切產(chǎn)物產(chǎn)量降低,但Npu在該溫度下已無活性。PAATERO等[17]對(duì)小鼠富含亮氨酸的跨膜蛋白LRRTM2進(jìn)行保守突變獲得cLRRTM2,其Tm值相比于野生型LRRTM提高了32 ℃。

為滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要,提高CALB的熱穩(wěn)定性,本研究將南極假絲酵母來源的脂肪酶B(GenBank:Z30645.1)進(jìn)行多序列比對(duì),選擇對(duì)CALB熱穩(wěn)定性有潛在影響的點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,并進(jìn)行有序疊加,篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體。通過Discovery Studio 2022進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬和作用力分析,從結(jié)構(gòu)上解釋最優(yōu)突變體熱穩(wěn)定性提高的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pET22b、菌株E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存,質(zhì)粒pET22b-calb由上海生工合成構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、柱回收試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)、一步克隆試劑盒、DpnI、氨芐霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司;Prime STAR Max Premix DNA聚合酶、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒,大連TaKaRa公司;蛋白marker、蛋白電泳Loading buffer、Bis-Tris預(yù)制凝膠,Invitrogen公司;Ni-NTA親和層析預(yù)裝柱,美國通用電氣公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物;對(duì)硝基苯酚丁酸酯,上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司;其他常規(guī)試劑及藥品為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,蛋白胨10,NaCl 5,pH值7.0。

TB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物24,蛋白胨12,甘油5,KH2PO42.31,K2HPO4·3H20 16.4。

25 mmol/L對(duì)硝基苯酚丁酸酯(p-nitrophenol butyrate,pNPB):0.523 g pNPB中加入250 μL的Triton X-100,加100 mL超純水定容后超聲5 min使其均一。

50 mmol/L Tris-HCl緩沖液:3.028 g Tris加超純水定容至500 mL,濃HCl調(diào)pH值至8.0。

2.5 mmol/L對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)母液的配制:0.034 8 g pNP溶于100 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中。

A液:Tris 50 mmol/L,NaCl 200 mmol/L,濃HCl調(diào)pH值至7.5～8.0。

B液:Tris 50 mmol/L,NaCl 200 mmol/L,咪唑500 mmol/L,濃HCl調(diào)pH值至7.5～8.0。

C液:Tris 50 mmol/L,濃HCl調(diào)pH值至7.5～8.0。

固體培養(yǎng)基中添加1.5%～2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pET22b-calb為模板,采用表1中的引物對(duì)進(jìn)行反向PCR。PCR體系為:模板1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,ddH2O 22 μL,Prime STAR Max Premix DNA聚合酶25 μL。PCR條件:98 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min 30 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃繼續(xù)延伸10 min,4 ℃保溫。將PCR后的產(chǎn)物加入DpnI消化模板,消化后進(jìn)行柱回收。將回收后的片段轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)中,挑取長出的轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng),提質(zhì)粒送測序。將測序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)得到重組菌。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 CALB及突變體的表達(dá)

將帶有正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接入加有終質(zhì)量濃度為100 μg/mL氨芐青霉素的液體LB中過夜培養(yǎng),將種子按3%的接種量接種至裝有30 mL TB的發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.8～1.0后,添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG 20 ℃誘導(dǎo),24 h后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.3 CALB及突變體的純化、脫鹽

將發(fā)酵液在10 000 r/min,4 ℃下離心10 min獲得發(fā)酵上清液,采用0.22 μm的水系濾膜過濾后進(jìn)行鎳柱親和層析獲得目的蛋白。上樣完成后先用A液平衡,再用不同濃度的B液洗脫。洗脫后的純蛋白通過Sephadex G-25脫鹽柱采用C液進(jìn)行脫鹽。

1.2.4 CALB及突變體性質(zhì)測定

殘余酶活的測定:將純化后的野生型和突變體(質(zhì)量濃度均為0.15 mg/mL)置于50 ℃的金屬浴中處理5 min,冰上冷卻后測定酶活力,以未處理的酶活力為100%,計(jì)算殘余酶活力。

半衰期的測定:將野生型和突變體的純蛋白(質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL)分裝后置于50 ℃水浴中,測定不同時(shí)間下的酶活力,以未處理前的酶活力為100%,ln(殘余酶活力)為縱坐標(biāo),t為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,計(jì)算kd,得到t1/2。

Tm值的測定:采用Nano-DSC測定CALB及突變體的Tm。先將樣品脫氣,上樣后等熱流信號(hào)和壓力信號(hào)穩(wěn)定后開始運(yùn)行,以1 ℃/min的速率將溫度從30 ℃上升至80 ℃對(duì)樣品進(jìn)行掃描。利用軟件Nano Analysis對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合,得出Tm。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定 配制0、5、10、15、20、25、30、35 mmol/L的pNPB,測定不同底物濃度下CALB及突變體的酶活。利用Origin 2021進(jìn)行非線性擬合,計(jì)算Km和kcat。

1.2.5 SDS-PAGE分析和蛋白濃度測定

將發(fā)酵液10 000 r/min,4 ℃離心后獲得發(fā)酵上清液,菌體采用C液重懸后進(jìn)行超聲破碎,將破碎后的樣品4 ℃離心,上清即為胞內(nèi)可溶部分,沉淀采用C液重懸后獲得胞內(nèi)不溶部分。將重組菌BL21/pET22b和BL21/pET22b-calb的發(fā)酵上清液、胞內(nèi)可溶和不溶部分進(jìn)行SDS-PAGE。V(蛋白樣品)∶V(4×SDS上樣緩沖液)=3∶1,98 ℃煮沸10 min,上樣20 μL恒壓120 V進(jìn)行SDS-PAGE。蛋白濃度采用碧云天Bradford蛋白濃度測定試劑盒。

1.2.6 CALB酶活力測定[18]

pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.17、0.2、0.225、0.25 mmol/L的pNP,測定OD405值。以pNP的濃度為橫坐標(biāo),OD405值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲。

CALB酶活力測定:將900 μL的Tris-HCl 緩沖液和50 μL適當(dāng)稀釋的酶液在45 ℃下預(yù)熱5 min后,加入50 μL 25 mmol/L pNPB反應(yīng)5 min,最后加入預(yù)冷的乙醇終止反應(yīng),測定OD405值,每分鐘催化生成1 μmol pNP所需的酶量為1 U。

1.2.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬和機(jī)制分析

利用在線軟件I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)對(duì)CALB和突變體進(jìn)行蛋白質(zhì)建模。采用軟件Discovery Studio 2022進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,力場選擇CHARMm,將CALB和突變體放于一個(gè)立體水盒子中,并添加Na+和Cl-中和體系中的電荷以使能量最小化。隨后在平衡200 ps后在330 K下進(jìn)行50 ns的模擬。CALB及突變體的分子結(jié)構(gòu)和作用力分析借助軟件Discovery Studio 2022和Pymol 2.5.4完成。底物pNPB的構(gòu)象從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得,通過Discovery Studio 2022轉(zhuǎn)為PDB格式后和CALB及突變體進(jìn)行對(duì)接,選擇能量最低的構(gòu)象進(jìn)行分析。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行檢索,獲得同源序列。采用軟件Jalview 2.11.2.0進(jìn)行同源性比對(duì)后得到共識(shí)序列,分別計(jì)算共識(shí)序列和CALB中每個(gè)氨基酸在所有比對(duì)序列中出現(xiàn)頻率百分比,兩個(gè)百分比的比值即為相對(duì)頻率,通過相對(duì)頻率確定突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CALB在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

大腸桿菌遺傳背景清晰,操作成熟,周期短,生長環(huán)境簡單[19],故本研究選擇其作為宿主。將calb連接至pET22b中pelB信號(hào)肽的下游,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-calb(圖1-a)。在該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)后得到重組菌BL21/pET22b-calb。將重組菌發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液上清液、胞內(nèi)可溶部分和不溶部分的酶活,并進(jìn)行SDS-PAGE分析。與pET22b相比,重組菌BL21/pET22b-calb的發(fā)酵上清液和胞內(nèi)可溶部分中CALB酶活分別為2.68 U/mL和1.05 U/mL(圖1-b),且均有明顯條帶(理論分子質(zhì)量為33 kDa)(圖1-c)。胞內(nèi)不溶部分未檢測到CALB酶活為且無對(duì)應(yīng)蛋白條帶。這些結(jié)果表明,CALB在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),但并未全部分泌至胞外。

將重組菌BL21/pET22b-calb的發(fā)酵上清液進(jìn)行鎳柱親和層析。分別采用10%,15%,20%,40%,60%,100% B液進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫樣品并進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖1-d所示,10% B液洗脫出雜蛋白,40% B液洗脫出目標(biāo)蛋白,以上結(jié)果表明,鎳柱親和層析可以獲得單一的目標(biāo)蛋白。

2.2 共識(shí)序列分析

共識(shí)序列改造是使用同源序列之間的信息獲得共識(shí)序列,將改造序列中保守性低的氨基酸突變?yōu)楣沧R(shí)序列中的保守氨基酸,以此提高酶的穩(wěn)定性[20]。將由317個(gè)氨基酸編碼的CALB序列輸入至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行比對(duì),并獲得100條序列。選擇一致性在30%～60%[21]的48條序列作為同源序列,采用軟件Jalview 2.11.2.0對(duì)這些序列進(jìn)行同源比對(duì)后獲得共識(shí)序列(圖2),計(jì)算相對(duì)頻率和相對(duì)頻率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,分別為 0.64和0.38。一般認(rèn)為,當(dāng)相對(duì)頻率低于平均值-1.5×標(biāo)準(zhǔn)差時(shí),該位置氨基酸的保守性較低,需要突變?yōu)楣沧R(shí)序列中對(duì)應(yīng)的氨基酸[13]。CALB大多數(shù)位置的相對(duì)頻率>0.26(相對(duì)頻率的均值和標(biāo)準(zhǔn)差的差值),但有14個(gè)點(diǎn)(圖2)的相對(duì)頻率<0.07(平均值-1.5×標(biāo)準(zhǔn)差)。為了評(píng)估這些點(diǎn)對(duì)CALB穩(wěn)定性的影響,將其全部突變?yōu)楣沧R(shí)序列中的氨基酸。

a-用于CALB表達(dá)的質(zhì)粒pET22b-calb;b-誘導(dǎo)24 h后BL21/pET22b和BL21/pET22b-calb的發(fā)酵液上清液、胞內(nèi)可溶和不溶部分酶活力; c-誘導(dǎo)24 h后BL21/pET22b和BL21/pET22b-calb的發(fā)酵液上清液、胞內(nèi)可溶和不溶部分SDS-PAGE分析(M-Marker;1-BL21/pET22b 發(fā)酵上清;2-BL21/pET22b 胞內(nèi)可溶;3-BL21/pET22b 胞內(nèi)不溶);d-不同濃度B液洗脫后蛋白的SDS-PAGE驗(yàn)證(M-Marker; 4-10% B液洗脫;5-15%B液洗脫;6-20% B液洗脫;7-40% B液洗脫;8-60% B液洗脫)圖1 重組CALB的表達(dá)情況分析和SDS-PAGE分析Fig.1 Expression analysis and SDS-PAGE analysis of recombinant CALB

2.3 共識(shí)序列改造單點(diǎn)突變對(duì)CALB熱穩(wěn)定性及催化活性的影響

將共識(shí)設(shè)計(jì)得到的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后獲得正確突變體,突變體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)24 h后結(jié)束發(fā)酵,測定發(fā)酵上清液中CALB的酶活。其中,V30Q,T80A,T280V基本未正常表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。將剩余的突變體進(jìn)行蛋白純化(圖3-a),測定純化后CALB和突變體的比酶活及在50 ℃保溫5 min后的殘余酶活力。有研究表明,共識(shí)序列改造只有部分會(huì)提高酶的穩(wěn)定性,而其他的會(huì)破壞穩(wěn)定性或不會(huì)產(chǎn)生任何影響[22]。和CALB相比,I87V、G114A、A148G、T159A和A284 N殘余酶活力分別提高了10%,10.1%,2.6%,10.5%和13.4%,A25G,L99V,G207A殘余酶活力無明顯變化,M83I,V110A,A214S分別下降11.8%,21.4%,17.1%。T159A比酶活增加13.7%,G114A,G207A無明顯變化,其他突變體的比酶活均有不同程度的下降(圖3)。

2.4 共識(shí)序列改造組合突變對(duì)CALB熱穩(wěn)定性及催化活性的影響

為了獲得更優(yōu)突變體,將單點(diǎn)突變中有正向效果的點(diǎn)進(jìn)行組合突變。以殘余酶活力最高的A284 N為基礎(chǔ),分別將I87V、G114A、A148G、T159A進(jìn)行疊加,得到突變體A284 N/I87V、A284 N/G114A、A284 N/A148G、A284 N/T159A,測定上述突變體的比酶活和殘余酶活力。相比于A284 N,A284 N/G114A和A284 N/I87V殘余酶活力提高了16.1%和14.5%,A284 N/A148G和A284 N/T159A下降了44.8%和47.7%。和CALB相比,僅A284 N/A148G的比酶活提高了22.5%,其他突變體的比酶活均有不同程度的降低(圖4)。最后將I87V、G114A、A284 N進(jìn)行組合,得到A284 N/I87V/G114A,該突變體的殘余酶活力并未高于A284 N/G114A(圖4)。經(jīng)組合突變,得到最優(yōu)突變體A284 N/G114A(CALBm)。PARK等[4]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和RosettaDesign算法獲得的突變體A251E雖然熱穩(wěn)定性提高了2.5倍,但比酶活卻下降了50%(CALBm下降了36%)。

圖2 CALB和共識(shí)序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment result of CALB and consensus sequence 注:序列右側(cè)數(shù)字:氨基酸編號(hào);●:突變氨基酸;-:此位置氨基酸出現(xiàn)空缺;+:此位置氨基酸無保守性;% cal res(CALB residues): CALB每個(gè)氨基酸出現(xiàn)頻率占比對(duì)序列百分比;% con res(consensus sequence residues):共識(shí)序列中每個(gè)氨基酸出現(xiàn)頻率占比對(duì)序列百分比; % Rel.Freq.(Relative Frequency):% cal res與% con res的比值。

為進(jìn)一步了解突變體的熱穩(wěn)定性變化,測定了野生型和突變體的熔解溫度及50 ℃下的半衰期,結(jié)果如表2所示。和CALB相比,CALBm在50 ℃下的t1/2為14.5 min,提高了74.7%。Tm為57.9 ℃,提高了1.3 ℃。KIM等[23]通過B-因子和RosettaDesign獲得突變體R249L,其Tm值(56.8 ℃)低于CALBm的Tm值(57.9 ℃)。LE等[24]通過二硫鍵的引入獲得的突變體A162C-K308CTm值(55.9 ℃)同樣也低于CALBm。溫露文等[25]通過PoPMuSiC和FoldX預(yù)測獲得突變體A146G-L278M和A146G-L278M-A151P,其在50 ℃下的半衰期分別是野生型的1.35倍和1.5倍,提升幅度低于CALBm(1.7倍)。同時(shí)測定了CALB和CALBm對(duì)不同濃度pNPB的催化效率,和CALB相比,CALBm的Km增加了26%,kcat/Km下降了23%。XIE等[26]通過選取活性位點(diǎn)附近高B-factor值的點(diǎn)進(jìn)行突變后獲得D223G/L278M,其Km增加了35%,對(duì)底物對(duì)硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenol caprylate,pNPC)的親和力降低,kcat/Km無明顯變化。KIM等[23]通過B-因子和RosettaDesign獲得突變體R249L,其Km增加了7%,Vmax/Km下降了8%。和其他突變體比較,CALBm催化效率下降較多,可能是由于底物種類和濃度不同造成。

2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬和底物對(duì)接

研究表明,蛋白結(jié)構(gòu)剛性的增加是酶穩(wěn)定的主要因素之一,通常表現(xiàn)為突變蛋白主鏈較低的RMSD和RMSF值[27]。將CALB和CALBm在330 K下進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。和CALB相比,CALBm的平均RMSD值(3.54)和最終RMSD值(4.7)均低于CALB(均值4.61,最終值6.35)(圖5-a)同時(shí),CALBm在區(qū)域I(100～150)和區(qū)域II(250～300)的RMSF值均低于CALB(圖5-b),說明G114A和A284 N的突變可能提高蛋白的局部剛性,從而影響整體的穩(wěn)定性。

a-CALB及突變體純化后SDS-PAGE驗(yàn)證; b-CALB及突變體純化后的殘余酶活和比酶活圖3 CALB和突變體的SDS-PAGE分析及殘余酶活和比酶活Fig.3 SDS-PAGE analysis and residual enzyme activity and specific enzyme activity of CALB and mutants

圖4 組合突變體的殘余酶活和比酶活Fig.4 Residual enzyme activity and specific enzyme activity of combined mutants

表2 CALB和CALBm性質(zhì)比較Table 2 Properties comparison of CALB and CALBm

a-RMSD分析;b-RMSF分析;c-突變位點(diǎn)的相互作用力分析圖5 CALB和CALBm的RMSD和RMSF分析及突變位點(diǎn)的相互作用力變化Fig.5 RMSD and RMSF analysis of CALB and CALBm and interaction changes in mutation sites注:綠色:CALB的局部結(jié)構(gòu);白色:CALBm的局部結(jié)構(gòu);黃色虛線:氫鍵;紫色虛線:疏水相互作用。

進(jìn)一步對(duì)突變前后氨基酸與周圍氨基酸之間的相互作用進(jìn)行分析(圖5-c),G114突變后,在原來氫鍵(G114 vs F118,G114 vs V110)的基礎(chǔ)上,新增加了3個(gè)疏水相互作用(G114 vs M83,G114 vs V84,A114 vs I121)。A284突變后,雖然少了1個(gè)疏水相互作用(A284 vs F71),但新形成了2個(gè)氫鍵(A284 vs G41,A284 vs A281)。突變后新形成的鍵在一定程度上增加了CALB的剛性,促使熱穩(wěn)定性的提升。

將CALB和CALBm與底物pNPB分別進(jìn)行對(duì)接后,分析底物和氨基酸殘基間的相互作用力,pNPB和CALB之間的作用力由突變前的2個(gè)氫鍵和4個(gè)疏水相互作用變?yōu)?個(gè)氫鍵和3個(gè)疏水相互作用(圖6),底物和酶分子之間作用力的減少可能影響了底物和酶的結(jié)合,導(dǎo)致催化效率下降。

a-CALB和pNPB相互作用力;b-CALBm和pNPB相互作用力圖6 CALB和CALBm與pNPB分子對(duì)接Fig.6 Molecular docking of CALB and CALBm with pNPB注:綠色:CALB的局部結(jié)構(gòu);白色:CALBm的局部結(jié)構(gòu); 綠色和淺藍(lán)色虛線:氫鍵;紫色虛線:疏水相互作用。

3 結(jié)論

本研究通過多序列比對(duì),得到對(duì)CALB熱穩(wěn)定性有潛在影響的點(diǎn)進(jìn)行突變,獲得熱穩(wěn)定性提升的突變體CALBm。和CALB相比,CALBm在50 ℃下的殘余酶活提升了25.9%,50 ℃下的半衰期(t1/2=14.5 min)增加了6.2 min,Tm值提高了1.3 ℃。但比酶活下降了36.3%,Km增加了26%,對(duì)底物的親和力降低,kcat/Km也存在一定程度的下降。動(dòng)力學(xué)分析和局部相互作用分析表明,CALBm熱穩(wěn)定性提升的原因可能是由于突變后新增加的氫鍵和疏水相互作用使蛋白局部剛性增強(qiáng),從而影響整體的穩(wěn)定性。