李婧芳,韓夢圓,李銘心,張濛,田康明

(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津,300457)

細(xì)胞個(gè)體維持相對懸浮狀態(tài)有利于營養(yǎng)物質(zhì)、底物和產(chǎn)物的傳遞。細(xì)胞個(gè)體實(shí)現(xiàn)相對懸浮的物質(zhì)基礎(chǔ)是細(xì)胞外膜及其主要結(jié)構(gòu)組成成分。大腸桿菌細(xì)胞外膜是由磷脂、脂多糖及外膜蛋白共同構(gòu)成的高度不對稱的脂質(zhì)雙分子層。外膜蛋白(outer membrane proteins,Omps)包括參與營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奈⒖椎鞍住⒕S持細(xì)胞完整性的脂蛋白以及與細(xì)菌生長相關(guān)的微量蛋白。其中OmpC、OmpF和PhoE是大腸桿菌最重要的外膜孔蛋白,與脂多糖合成密切相關(guān),并受脂多糖合成的影響[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),包括O-抗原、核心多糖和脂質(zhì)A[2-3],起到維持細(xì)胞膜完整性的作用[4]。其中脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)域是一種獨(dú)特的氨基葡萄糖基磷脂,作為LPS的疏水錨,是脂多糖中的生物活性中心。脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)在各種細(xì)菌中相對保守,但它的結(jié)構(gòu)會(huì)隨著環(huán)境的變化而改變[5-6],結(jié)構(gòu)的變化引起細(xì)胞外表面發(fā)生改變。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明,脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)的改造包括去除或修飾脂質(zhì)A磷酸鹽脂?；淸7],可以通過破壞相關(guān)合成酶的結(jié)構(gòu)基因和引入生物合成基因來進(jìn)行人工修飾[8],實(shí)現(xiàn)對脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)的定向改造進(jìn)而改變大腸桿菌外膜的特性。有研究者提出敲除部分脂多糖合成相關(guān)基因,同時(shí)定點(diǎn)突變脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因以降低其底物特異性,可減少脂多糖的含量[9-11]。該研究結(jié)果為探索脂多糖減量合成對細(xì)胞外膜功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞自凝集作為細(xì)胞外膜功能改變后的主要群體表現(xiàn)形式之一,是指同種細(xì)菌或不同種細(xì)菌之間在自凝集素的介導(dǎo)或自然條件下,相互識(shí)別而聚集形成一種絮凝狀態(tài)[12-13]。在宏觀上表現(xiàn)為靜態(tài)菌懸液中菌體的沉降,在培養(yǎng)容器底端形成菌體沉淀。自凝集素包括作為細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[14]和胞外多糖[15]以及非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì),如鈣離子、鎂離子[14]等。自凝集現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制有兩類,一類是由表面靜電效應(yīng)引起的菌體聚集,包括菌體在水溶液中的疏水表面特性或表面帶電的細(xì)菌細(xì)胞在帶相反電荷的凝集素存在下發(fā)生的聚集;另一類是由菌體表面蛋白之間相互作用介導(dǎo)的聚集,這些蛋白均含有β-螺旋結(jié)構(gòu),使親水的氨基酸殘基暴露在外側(cè),增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的相互作用。例如細(xì)胞外膜蛋白種類或數(shù)量改變后介導(dǎo)細(xì)菌附著在無機(jī)材料表面,可以形成一層生物膜[16-17]。在工業(yè)生產(chǎn)中,菌體細(xì)胞自凝集對于實(shí)現(xiàn)菌體細(xì)胞的可控沉降具有顯著的指導(dǎo)意義,并作為發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后菌體去除的一種方法,提高發(fā)酵后期菌體的分離效率,進(jìn)而降低工業(yè)產(chǎn)品的精制成本[18-19]。

在大多數(shù)情況下,細(xì)菌的自凝集是由表面蛋白質(zhì)間的相互作用所介導(dǎo)的[14]。細(xì)胞外膜中的表面蛋白通常附著于脂多糖的空間間隙中。改變脂多糖的合成水平,有可能影響細(xì)胞外膜相關(guān)表面蛋白的表達(dá)水平、種類和數(shù)量,對細(xì)菌的自凝集產(chǎn)生一定的影響?；诖?本研究以大腸桿菌為研究對象,利用Red重組系統(tǒng)對部分脂多糖合成相關(guān)基因進(jìn)行刪除,選育脂多糖減量合成菌株,進(jìn)一步探究脂多糖合成量的減少對大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長性能、外膜功能特性和自凝集特性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株見表1。

1.2 引物序列

本研究所用引物見表2,均合成自上海生工有限公司。

表2 本研究所用到的引物Table 2 Sequence of oligonucleotide primers for the construction of recombinant strains

1.3 試劑與培養(yǎng)基

酵母提取物、蛋白胨,Oxoid公司;苯酚,Solarbio公司;常規(guī)化學(xué)品非注明均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基[21](g/L):酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10,固體培養(yǎng)基需另外補(bǔ)加18 g/L的瓊脂粉;

微量元素母液(g/L):FeCl3·6H2O 2.4,CoCl2·6H2O 0.3,CuCl2·2H2O 0.15,ZnCl20.3,Na2MO4·2H2O 0.3,H3BO30.075,MnCl2·4H2O 0.495,115 ℃滅菌20 min備用。

M9培養(yǎng)基[21](g/L):NaCl 0.5、NH4Cl 1、KH2PO43、Na2HPO4·12H2O 15.1,接種前加入1 g/L的MgSO4(1 mol/L)和微量元素,按需添加葡萄糖。

1.4 儀器與設(shè)備

5 L離位磁力攪拌發(fā)酵罐,上海保興公司;UV-1200紫外分光光度計(jì),上海美普達(dá)公司;SBA-40X生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 重組菌株構(gòu)建

重組菌株構(gòu)建按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分子操作方法[22]進(jìn)行?；騽h除的順序如下:msbA、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA和lpxM;按照實(shí)驗(yàn)理論設(shè)計(jì),各突變盒條帶對應(yīng)大小分別為5.2、2.0、2.0、2.1、2.0、2.0、1.8 kb;基因刪除前對應(yīng)野生型條帶大小分別為2.0、2.1、1.6、1.3、1.6、1.5、1.0 kb;完成基因刪除后,對應(yīng)突變型條帶大小分別為4.2、1.4、1.0、1.0、1.2、1.1、0.8 kb。

1.5.2 細(xì)胞干重及脂多糖含量測定

在單位OD600下對菌體干重和脂多糖含量進(jìn)行測定。其中菌體細(xì)胞干重采用烘干法,脂多糖提取方法參照改良后的熱酚水解法[23]進(jìn)行。

1.5.3 細(xì)胞外膜滲透性及表面疏水性測定

細(xì)胞外膜滲透性及表面疏水性測定參照HELANDER等[24]和DEL等[25]的方法。

外膜滲透性測定:依照初始OD600=0.02轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min恒溫培養(yǎng),用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將收集到的菌體洗滌、打散混勻后,得到OD600值為0.5的菌懸液。在石英比色皿中加入1 920 μL菌懸液和80 μL濃度為10 μmol/L的N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)溶液,吹吸混勻,設(shè)置參數(shù):激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長428 nm,縫寬5 mm,讀取各樣本穩(wěn)定后的數(shù)值。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣本。

表面疏水性測定:從固體平板挑取單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)過夜培養(yǎng),取菌液控制初始OD600=0.2,轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600=2.0。6 000×g離心10 min,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)將收集的菌體洗滌沉淀2次并重懸,得到菌懸液OD600=1.0。取5 mL菌懸液置于試管中,并加入2 mL的二甲苯溶液,充分振蕩混勻120 s,常溫下垂直靜置30 min,取下相液體測定600 nm處吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。根據(jù)二甲苯添加前后的菌液吸光度差異,計(jì)算細(xì)胞疏水性,如公式(1)所示:

(1)

式中:A1為添加二甲苯前OD600值,A2為添加二甲苯后下層液體OD600值。

1.5.4 細(xì)菌自凝集特性測定

菌體細(xì)胞自凝集率測定參照ROUX等[26]的方法。按照初始OD600=0.02,將菌液轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中,37 ℃, 200 r/min培養(yǎng)12 h。2 656×g離心10 min收集菌體,用磷酸鹽緩沖液洗菌體兩次,并重懸菌體控制OD600=2.5。取5 mL重懸液于玻璃試管中,在4 ℃靜置48 h,測定液面下1 cm處的菌液濃度,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A3為自凝集前OD600值,A4為自凝集后上層菌液OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂多糖減量合成菌株的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保藏菌株E.coliLG101為出發(fā)菌株,按照1.5.1節(jié)方法,對脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MsbA的148位堿基C定點(diǎn)突變?yōu)門,在此基礎(chǔ)上完成脂多糖合成及結(jié)構(gòu)修飾的相關(guān)基因的疊加刪除,并完成重組菌株的構(gòu)建,依次命名為LGL4A01～LGL4A06。

在篩選得到已完成脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因msbA的定點(diǎn)表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上,根據(jù)圖1所示的電泳結(jié)果可知,突變型和野生型條帶大小與1.5.1節(jié)中理論條帶大小一致,可以得出已成功刪除1.5.1節(jié)中全部的脂多糖合成關(guān)鍵基因并構(gòu)建重組菌株,命名為LGL4A06,用于后續(xù)研究。

2.2 菌體及脂多糖合成量評(píng)價(jià)

由2.1節(jié)結(jié)果可知,菌株LGL4A06關(guān)于脂多糖合成及結(jié)構(gòu)修飾的基因型已發(fā)生變化。進(jìn)一步在搖瓶培養(yǎng)條件下,測定出發(fā)菌株和重組菌株LGL4A06菌株脂多糖含量和菌體細(xì)胞干重(圖2)。結(jié)果顯示,與出發(fā)菌株LG101相比,菌株LGL4A06的脂多糖含量和細(xì)胞干重均有所下降,單位OD600菌體干重下降了32.46%(12 018.72 μg / 8 116.78 μg),脂多糖含量下降了39.34%(1 389.73 μg/842.97 μg),根據(jù)脂多糖的減少量可以得出影響脂多糖合成的關(guān)鍵基因是lpxM,且隨著部分脂多糖合成關(guān)鍵基因疊加刪除,單位OD600菌體干重和脂多糖含量整體呈遞減的趨勢,進(jìn)一步證實(shí)上述重組菌的選育過程實(shí)現(xiàn)了脂多糖的減量合成。

1～7-lldD、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA,lpxM野生型對照;8～14-lldD、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA,lpxM突變型大小;M-1 kb gene ladder圖1 出發(fā)菌株和重組菌分子鑒定電泳圖譜Fig.1 Identification of mutant strains through colony PCR

a-單位OD600菌體干重;b-單位OD600脂多糖含量圖2 細(xì)胞單位OD600對應(yīng)菌體干重及脂多糖含量Fig.2 Dry cell weight and lipopolysaccharide content of strains

2.3 細(xì)胞外膜滲透性及表面疏水性評(píng)價(jià)

有研究表明,脂多糖及外膜蛋白OmpF和OmpC影響細(xì)胞外膜滲透性[27],截短脂多糖結(jié)構(gòu)或外膜蛋白缺失均可引起外膜滲透性變化;以此為依據(jù),本研究評(píng)價(jià)脂多糖的減量合成對細(xì)胞外膜滲透性和表面疏水性的影響,進(jìn)而通過二者前后的變化評(píng)價(jià)脂多糖的減量合成對細(xì)胞外膜功能的影響。

與出發(fā)菌株LG101相比,脂多糖減量合成菌株LGL4A06的外膜滲透性如圖3結(jié)果顯示,提高了55.05%(721.93/465.60)。菌株LGL4A06的細(xì)胞表面疏水性相較于菌株LG101提高了5.81倍(34.34%/5.04%)。

a-外膜滲透性測定;b-細(xì)胞表面疏水性測定圖3 細(xì)胞外膜相關(guān)功能特性測定Fig.3 Determination of relevant function of the outer membrane

2.4 脂多糖減量合成對細(xì)胞自凝集效率的影響

2.4.1 菌體自凝集特性測定

在研究中發(fā)現(xiàn),菌體改造后自凝速率相對于出發(fā)菌株有著明顯的變化,按1.5.4節(jié)方法測定二者自凝集性能差異性,結(jié)果如圖4所示,出發(fā)菌株LGL101和突變菌株LGL4A06在靜置72 h后,菌體自凝集率均達(dá)到80.00%以上,但是突變菌株耗時(shí)更短;改造后的菌株LGL4A06在靜置12 h時(shí),菌體自凝集率為83.20%,此時(shí),出發(fā)菌株自凝集率僅為6.00%;細(xì)胞表面疏水性增強(qiáng)可提高細(xì)胞間的相互作用力[12],由2.2節(jié)結(jié)果顯示脂多糖減量合成導(dǎo)致菌株LGL4A06疏水性較出發(fā)菌株提高了5.81倍,因此進(jìn)一步提高了菌株自凝集率。

在本研究中發(fā)現(xiàn),菌體改造后自凝速率相對于出發(fā)菌株有著明顯的變化,按1.5.4節(jié)方法測定二者自凝集差異性。結(jié)果如圖5所示,出發(fā)菌株LGL101自凝集率均低于突變菌株LGL4A06,LG101自凝集率約為5.00%,LGL4A06自凝集率在80.00%以上;同一菌株自凝集率不受環(huán)境因素的影響,這一結(jié)果與王洲等[17,23]的研究結(jié)果一致。

圖5 不同溫度對LGL4A06菌株和出發(fā)菌株菌體 細(xì)胞自凝集性能的影響Fig.5 The auto-aggregation ratio of LG101 and LGL4A06 at different temperature

2.4.2 鈣離子、鎂離子對菌體自凝集特性的影響

如圖6所示,添加鈣離子、鎂離子對出發(fā)菌株LG101自凝集特性無影響,但可有效提高突變菌株LGL4A06自凝集速率。重組菌株LGL4A06添加10 mmol/L鈣離子后靜置4 h,自凝集率即達(dá)到95.00%,添加10 mmol/L鎂離子的重組菌株自凝集率為83.00%,未額外添加金屬離子的突變菌株自凝集率為22.00%,出發(fā)菌株自凝集率僅為(6.50±0.50)%;添加鈣離子、鎂離子的突變菌株在靜置5 h后,自凝集率均達(dá)到最大(鈣離子:97.00%;鎂離子:88.00%)。出現(xiàn)這一結(jié)果的可能原因是脂多糖減量合成導(dǎo)致鑲嵌于外膜的蛋白質(zhì)含量減少,增加了糖脂磷酸基團(tuán)與二價(jià)陽離子的結(jié)合,形成靜電吸引,加速菌體沉降[14]。

a-鈣鎂離子對菌株自凝集性能影響折線圖; b-鈣鎂離子添加后各菌株靜置4 h狀態(tài)圖圖6 鈣鎂離子對菌株LGL4A06和出發(fā)菌株LG101菌體 細(xì)胞自凝集性能的影響Fig.6 Effect of divalent cation on auto aggregation of LG101 and LGL4A06

3 結(jié)論與討論

脂多糖結(jié)構(gòu)變化可影響菌體自凝集特性,具體表現(xiàn)為脂多糖結(jié)構(gòu)簡化提高菌株自凝集率,12 h內(nèi)脂多糖減量合成菌株自凝集率較出發(fā)菌株提高了13.9倍;菌株的自凝集速率不受環(huán)境溫度的影響;外加鈣離子、鎂離子可顯著提高菌株自凝集率,可將自凝集進(jìn)程縮短至5 h。同時(shí),簡化脂多糖結(jié)構(gòu)可降低脂多糖含量,在發(fā)酵生產(chǎn)過程中,能夠?qū)⒂糜谛纬杉?xì)胞結(jié)構(gòu)的碳源更多地流向產(chǎn)物形成,進(jìn)一步提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率,降低生產(chǎn)成本。自凝集在工業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值主要是發(fā)酵后期菌體與產(chǎn)物的分離,提高菌體自凝集效率可簡化產(chǎn)品精制步驟,有效降低生產(chǎn)成本。