程琳,龔勁松,Michael HALL,蘇暢,徐國(guó)強(qiáng),許正宏1,,史勁松1,*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 4(Seragon Biosciences, Inc., California Irvine, 92618)

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的前體[1],NAD+是生物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)輔酶,參與調(diào)節(jié)能量代謝、細(xì)胞凋亡和增殖[2-4]等諸多通路。補(bǔ)充NAD+可預(yù)防心血管疾病、修復(fù)腎臟損傷和保護(hù)視神經(jīng)等,但NAD+因分子質(zhì)量大難以直接進(jìn)入細(xì)胞,而補(bǔ)充其前體NMN更能有效提高人體NAD+水平[5]。已有研究表明,補(bǔ)充NMN對(duì)機(jī)體的心腦組織損傷、代謝性疾病、衰老及其相關(guān)老化退行性疾病等均有較好的預(yù)防、治療和修復(fù)作用[6-8],并有望應(yīng)用于治療肥胖相關(guān)的肝病、帕金森和阿爾茨海默癥,改善組織功能[3,9-10]。

目前合成NMN的方法主要有化學(xué)合成法、化學(xué)-生物酶法和微生物發(fā)酵法,化學(xué)法合成路線復(fù)雜、試劑昂貴、總收率相對(duì)較低[11];化學(xué)-生物酶法一方面需要高活性生物酶,同時(shí)采用的底物仍需要復(fù)雜的化學(xué)工藝支持,產(chǎn)品的綠色性、安全性有待提升,因此,近年來微生物發(fā)酵法生產(chǎn)NMN逐步受到重視[12]。NMN代謝合成途徑主要有3條,a)NAD+補(bǔ)救途徑,以5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribose 1-pyrophosphate,PRPP)和煙酰胺(nicotinamide,NAM)為底物通過煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt,EC 2.4.2.12)催化生成NMN[13-14];b)NAD+替代補(bǔ)救途徑,以煙酸核糖激酶(NPK EC 2.7.1.173)催化煙酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)和ATP生成NMN[15]。上述兩個(gè)途徑主要存在于哺乳動(dòng)物生物體中;c)通過Preiss-Handler途徑,以磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NaPRT,EC 2.4.2.11)催化PRPP合成煙酸單核苷酸(niacin mononucleotide,NaMN),而來源于土拉弗朗西斯菌中的NMN合成酶則可以將NaMN轉(zhuǎn)化為NMN[16]。

由于替代補(bǔ)救途徑中的NR中間代謝物價(jià)格較為昂貴[5],是規(guī)?；苽銷MN的一大障礙,因此目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)NMN大多采用NAD+補(bǔ)救途徑,通過異源篩選高效的NAMPT在細(xì)菌體內(nèi)構(gòu)建NAD+補(bǔ)救途徑[17]。2018年首次報(bào)道了以大腸桿菌為宿主表達(dá)來源于杜克雷嗜血桿菌的NAMPT用于合成NMN,胞外質(zhì)量濃度為15.4 mg/L[18],此后的研究者通過對(duì)PRPP生物合成途徑酶進(jìn)行過表達(dá)來增加PRPP的供應(yīng),或者通過增加底物NAM進(jìn)胞、產(chǎn)物出胞的能力以提升NMN的積累[19],并通過染色體整合表達(dá)技術(shù),顯著提高NAD+的產(chǎn)量和合成穩(wěn)定性[20]。

本研究以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)宿主,通過異源表達(dá)Nampt構(gòu)建NMN的合成途徑,在增強(qiáng)表達(dá)合成前體PRPP的途徑酶的同時(shí),敲除NMN代謝降解相關(guān)基因pncC、ushA以弱化NMN的降解,并敲除NAD+衍生物調(diào)控基因nadR,探討采用多種代謝策略提高NMN的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

用于質(zhì)粒構(gòu)建的克隆宿主為大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109,表達(dá)宿主為E.coliBL21(DE3),用于大腸桿菌體系的表達(dá)質(zhì)粒為pCDFDuet。實(shí)驗(yàn)所用及構(gòu)建的菌株、質(zhì)粒如表1所示,引物序列參見表2,引物合成由天霖生物有限公司完成。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA聚合酶及Marker,TaKaRa公司;同源重組酶、DNA 純化及質(zhì)粒提取試劑盒,諾維贊公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10,自然pH。

種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉5,NaCl 0.50,KCl 0.19,MgCl20.95,葡萄糖3.60,pH 7.0;微量元素2 mL/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉5,NaCl 0.50,KCl 0.19,MgCl20.95,葡萄糖3.60,pH 7.0;微量元素2 mL/L。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in the study

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖400,胰蛋白胨100,酵母粉80,MgSO414;微量元素14 mL/L。

微量元素溶液(g/L):FeCl3·6H2O 6,ZnSO4·7H2O 0.58,CaCl20.20,CuCl2·2H2O 0.20,MnSO4·H2O 0.30,EDTA 0.50。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pCDFDuet-Nampt質(zhì)粒構(gòu)建為例,以大腸桿菌基因組為模板,擴(kuò)增獲得基因片段(引物如表1所示),選用誘導(dǎo)型質(zhì)粒pCDFDuet,用限制性核酸內(nèi)切酶ndeI、kpnI雙酶切后,將其與目的基因進(jìn)行同源重組連接,然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞,在含有鏈霉素的LB平板上篩選陽性克隆,得重組質(zhì)粒。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除大腸桿菌基因

使用CRISPR/Cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)敲除pncC、nadR、ushA基因,以敲除pncC為例,將含有Cas9編碼基因的pCas9質(zhì)粒化轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中,然后制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。

通過網(wǎng)站CHOPCHOP設(shè)計(jì)得到sgRNA序列,采用引物pncC-sgRNA-F和pncC-sgRNA-R將打靶質(zhì)粒pTarget進(jìn)行PCR反向擴(kuò)增,引入20 bp的sgRNA序列,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒,獲得基因敲除打靶質(zhì)粒pTarget-pncC。

選取目標(biāo)基因上下游各500 bp,采用引物分別擴(kuò)增基因上游同源臂、基因下游同源臂,然后利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得1 000 bp的上下游同源臂,構(gòu)建獲得修復(fù)模板。

將敲除質(zhì)粒和修復(fù)模板電轉(zhuǎn)入感受態(tài)中,驗(yàn)證敲除正確后,誘導(dǎo)pCas9質(zhì)粒定位pTarget質(zhì)粒上的sgRNA,從而消除pTarget質(zhì)粒;借助pCas9質(zhì)粒是溫敏型質(zhì)粒的特性,在42 ℃培養(yǎng)12～15 h,消除pCas9質(zhì)粒,得到BL21(DE3)ΔpncC。

1.4 基因表達(dá)的鑒定

挑取單克隆于10 mL的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h。再將上述菌液按1%接種量轉(zhuǎn)接30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí),添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,于25 ℃下誘導(dǎo)8～12 h,取樣,離心,菌體經(jīng)超聲破碎,取上清液,采用SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白。

1.5 重組菌株的發(fā)酵研究

種子培養(yǎng):從活化平板上挑取單菌落接種至10 mL LB液體培養(yǎng)基中,添加終質(zhì)量濃度100 μg/mL鏈霉素,37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)10～12 h。

搖瓶發(fā)酵:種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí),添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,于25 ℃下誘導(dǎo)8～12 h,測(cè)定NMN積累量。

5 L罐發(fā)酵:將種子培養(yǎng)液按照10%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接于5 L發(fā)酵罐,初始培養(yǎng)溫度37 ℃,pH值控制在7.0±0.2,通氣量設(shè)置為0.18 m3/h,轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)溶氧量自動(dòng)調(diào)節(jié),溶氧量維持在10%～30%,裝液量3 L,菌體培養(yǎng)至OD600值為8～10時(shí),加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),表達(dá)培養(yǎng)溫度為25 ℃,定期取樣測(cè)定生物量和NMN產(chǎn)量。

1.6 檢測(cè)方法

NMN檢測(cè)方法:取發(fā)酵液1 mL,離心取上清液即為發(fā)酵上清液;菌體經(jīng)磷酸鈉緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌后超聲破碎,離心后取上清液即為胞內(nèi)上清液。樣品測(cè)定前通過孔徑0.22 μm的濾膜過濾,然后用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜柱為Diamonsil 5 μL C18 250 mm×4.6 mm;流動(dòng)相A:100%甲醇,流動(dòng)相B:5 mmol/L四丁基氫氧化的5%甲醇水溶液。流速為0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫30 ℃。洗脫方案:0～20 min,100% A;20～25 min,40% A、60% B;25～35 min,20% A、80% B;35～40 min,100% A。

發(fā)酵液中葡萄糖含量測(cè)定:利用西爾曼生物生物傳感器進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建NMN合成途徑

大多數(shù)細(xì)菌通過NAD+替代補(bǔ)救途徑即煙酸核苷激酶從NR和ATP生成,而在哺乳動(dòng)物生物體中,可以通過NAD+補(bǔ)救途徑即通過Nampt以PRPP 和NAM為底物生成NMN,因NR較為昂貴,目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)NMN大多采用NAD+補(bǔ)救途徑,通過篩選異源Nampt生產(chǎn)NMN[21]。本研究以大腸桿菌為表達(dá)體系,以松噬幾丁質(zhì)菌來源的Nampt基因片段構(gòu)建NMN合成途徑(圖1-a),首先,通過PCR擴(kuò)增獲得Nampt基因片段,將目的片段和雙酶切載體進(jìn)行同源重組、連接轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子。Nampt基因片段長(zhǎng)度約為1 400 bp,菌落PCR驗(yàn)證,其目的條帶大小與預(yù)期一致,提取質(zhì)粒送樣測(cè)序,確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主,獲得了重組菌B1。將B1菌株發(fā)酵10 h后,收集菌體進(jìn)行超聲破碎,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖1-b)。

Nampt基因表達(dá)的目的蛋白理論分子質(zhì)量為52.7 kDa,其SDS-PAGE目的條帶與理論值基本一致。將重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,生成的NMN產(chǎn)量為12.1 mg/L,而對(duì)照組未測(cè)出NMN。

a-pcDFDuet-Nampt重組質(zhì)粒圖譜;b-重組蛋白Nampt的 SDS-PAGE電泳分析圖( M-蛋白Marker;1-空白對(duì)照, 含空載質(zhì)粒的BL21(DE3);2-發(fā)酵上清液;3-破壁上清液)圖1 重組蛋白Nampt的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.1 Construction and validation of the recombinant protein Nampt

2.2 增強(qiáng)PRPP途徑

合成NMN所需的前體之一是PRPP,PRPP的生物合成途徑與細(xì)胞生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)碳通量[22],因此提高NMN產(chǎn)量的重要策略之一就是增強(qiáng)PRPP的供應(yīng)。根據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò),PRPP是細(xì)胞重要代謝中間體,涉及嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸、色氨酸、組氨酸等多種代謝產(chǎn)物合成。PRPP主要通過磷酸戊糖途徑生成,因此可將相關(guān)基因進(jìn)行過表達(dá)來增強(qiáng)PRPP的供應(yīng),本研究構(gòu)建了質(zhì)粒pcDFDuet-zwf-pgl-gnd-rpiA-rpiB-prs-Nampt,表示為pcDFDuet-zwf→Nampt,如圖2-a所示,將該質(zhì)粒導(dǎo)入獲得重組菌B2。通過SDS-PAGE對(duì)6-磷酸葡萄糖脫氫酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶(pgl)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(gnd)、戊糖磷酸異構(gòu)酶(rpiA、rpiB)、PRPP合酶(prs)的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析,結(jié)果如圖2-b所示。zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、prs基因表達(dá)的目的蛋白理論分子質(zhì)量分別為55.7、36.3、51.5、22.9、16.1、33.9 kDa,這6個(gè)蛋白的SDS-PAGE條帶與理論相符,大小一致,說明均已成功表達(dá)。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證,其NMN產(chǎn)量為31.7 mg/L,是未強(qiáng)化的工程菌產(chǎn)量2.6倍,但是搖瓶OD600最大值為2.7,低于空白對(duì)照(OD600=3.1),推測(cè)單質(zhì)粒共表達(dá)多個(gè)酶對(duì)宿主的負(fù)擔(dān)較大,影響了生長(zhǎng)。

a-pcDFDuet-zwf→Nampt重組質(zhì)粒示意圖譜; b-重組蛋白SDS-PAGE電泳圖 (M-蛋白質(zhì)Marker;1-空白對(duì)照;2-破壁上清液)圖2 重組質(zhì)粒pcDFDuet-zwf→Nampt的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.2 Construction and validation of the recombinant plasmid pcDFDuet-zwf→Nampt

2.3 NMN下游代謝途徑的基因敲除

弱化目的產(chǎn)物的降解是一種有效提高產(chǎn)量的代謝改造方式。大腸桿菌中NMN的下游代謝主要是進(jìn)行NR、NAD的合成(圖3),如需在大腸桿菌有效積累NMN,必須對(duì)其代謝途徑進(jìn)行阻斷。為此,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)精準(zhǔn)敲除了NMN代謝過程中關(guān)鍵基因pncC、ushA和NAD衍生物調(diào)控基因nadR,獲得有利于積累NMN的基因工程菌。

圖3 大腸桿菌利用葡萄糖和煙酰胺合成NMN的代謝途徑Fig.3 Synthesis of NMN by E.coli using glucose and niacinamide注:紅色箭頭表示利用質(zhì)粒進(jìn)行過表達(dá),pncC、ushA、nadR為 本研究敲除基因。

2.3.1 NMN氨基水解酶的失活

大腸桿菌中的NMN氨基水解酶(PncC)可將煙酰胺單核苷酸脫氨為煙酸單核苷酸,本文在加強(qiáng)途徑酶表達(dá)的基礎(chǔ)上敲除NMN氨基水解酶,按照1.3節(jié)中的方法對(duì)該基因進(jìn)行敲除。構(gòu)建修復(fù)模板(圖4-a)和打靶質(zhì)粒(圖4-b),驗(yàn)證結(jié)果如圖4-c所示。NMN氨基水解酶基因大小為498 bp,若敲除成功,則條帶大小應(yīng)約為1 200 bp,將條帶大小正確的擴(kuò)增片段進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示與同源臂序列一致,表明pncC基因敲除成功。將該工程菌B3進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,以HPLC檢測(cè)產(chǎn)量如圖5所示,發(fā)酵結(jié)果表明該基因敲除后未對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成影響,而產(chǎn)量提升至44.3 mg/L。

2.3.2 5-核苷酸酶的失活

如圖3大腸桿菌中代謝網(wǎng)絡(luò)所示,5-核苷酸酶(UshA)可催化NMN變成煙酰胺核糖苷NR。為進(jìn)一步提高NMN的產(chǎn)量,在敲除NMN氨基水解酶的基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除5-核苷酸酶。5-核苷酸酶基因大小為1 653 bp,敲除后約為1 200 bp,驗(yàn)證結(jié)果如圖4-d所示,將該改造菌B4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖6所示,表明敲除5-核苷酸酶未對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成影響,NMN產(chǎn)量則提升至51.6 mg/L。

a-修復(fù)模板擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1、2為擴(kuò)增條帶);b-pTargetF質(zhì)粒 擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1、2為擴(kuò)增條帶);c-pncC基因敲除驗(yàn)證(泳道1為 對(duì)照菌株,泳道2為pncC基因敲除的菌株);d-pncC、ushA基因敲除 驗(yàn)證(泳道1、3為對(duì)照菌株,泳道2、4分別為pncC、ushA基因敲除的 菌株);e-pncC、ushA、nadR基因敲除驗(yàn)證(泳道1、3、5為對(duì)照菌株, 泳道2、4、6分別為pncC、ushA、nadR基因敲除的菌株)圖4 基因敲除菌株的電泳驗(yàn)證圖Fig.4 Verification electropherogram of gene knockout strains注:M-DNA marker。

2.3.3 NAD衍生物合成調(diào)控酶的失活

大腸桿菌中存在一種調(diào)控酶(NadR),具有調(diào)控NAD衍生物合成的能力,這是一種負(fù)反饋調(diào)控,當(dāng)NAD衍生物累積一定量時(shí)會(huì)抑制NMN合成關(guān)鍵酶Nampt的表達(dá),不利于NMN的積累。NadR調(diào)控酶基因大小為1 233 bp,未敲除成功的條帶大小約為2 400 bp,成功敲除的約為1 200 bp(圖4-e)。將該改造菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果表明,敲除未對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成明顯影響,NMN能夠得到有效積累,產(chǎn)量提升至60 mg/L,為初始表達(dá)產(chǎn)量的4.95倍。

a-標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測(cè)圖譜;b-發(fā)酵破碎上清液的HPLC檢測(cè)圖譜圖5 NMN的標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵液HPLC檢測(cè)圖譜Fig.5 HPLC detection results of NMN standards and fermentation broth

a-最大OD600測(cè)定值;b-發(fā)酵結(jié)束NMN終產(chǎn)量圖6 重組菌株的搖瓶發(fā)酵參數(shù)Fig.6 Shaker fermentation parameters of recombinant strains注:B0-空白對(duì)照菌株;B1-BL21(DE3)pCDFDuet-Nampt;B2-BL21(DE3) pCDFDuet-zwf→Nampt;B3-B2ΔpncC;B4-B3ΔushA;B5-B4ΔnadR。

2.4 小罐發(fā)酵工藝研究

為了進(jìn)一步探究工程菌的發(fā)酵合成潛力,在5 L小罐上進(jìn)行發(fā)酵工藝研究?？疾炝藘煞N發(fā)酵策略對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響(圖7)。第一種如圖7-a所示,當(dāng)葡萄糖消耗完,開始流加葡萄糖和煙酰胺,葡萄糖作為菌體生長(zhǎng)的碳源的同時(shí)也是合成NMN的前體物質(zhì),發(fā)酵過程中控制流加速度使葡萄糖和煙酰胺維持在較低濃度,最高NMN產(chǎn)量為290.7 mg/L;第二種如圖7-b所示,當(dāng)葡萄糖消耗完后,開始補(bǔ)料培養(yǎng)基和煙酰胺,同樣控制流加速度使葡萄糖和煙酰胺維持在較低濃度,避免高濃度導(dǎo)致的高滲透壓對(duì)菌體生長(zhǎng)帶來不利影響,在36 h時(shí)產(chǎn)量最高達(dá)到390.1 mg/L,是搖瓶水平的6.5倍,OD600值最高為16.4。相比而言,第二種補(bǔ)料策略較好,可能是培養(yǎng)基的成分更豐富,能充分滿足菌體生長(zhǎng)的需要,進(jìn)而影響NMN的合成。

a-流加葡萄糖、煙酰胺的發(fā)酵過程參數(shù);b-補(bǔ)料培養(yǎng)基、 葡萄糖、煙酰胺的發(fā)酵過程參數(shù)圖7 重組菌在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)NMN的過程曲線Fig.7 Process curve of NMN production by the recombinant strain in 5 L fermenter

3 結(jié)論

本研究以大腸桿菌BL21(DE3)作為表達(dá)宿主,通過引入外源松噬幾丁質(zhì)菌的Nampt基因,在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了NMN的生物合成。通過強(qiáng)化表達(dá)大腸桿菌自身的zwf、pgl、gnd、ripA、ripB、prs基因,增強(qiáng)了PRPP途徑的合成能力。為了使大腸桿菌有效積累產(chǎn)物NMN,敲除了NMN的代謝基因pncC、ushA以及調(diào)控因子nadR。進(jìn)而通過重組菌株的發(fā)酵工藝的初步研究,使菌株的搖瓶最高產(chǎn)量為60 mg/L,5 L發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到390.1 mg/L。后期研究將基于該工程菌株,重點(diǎn)開展關(guān)鍵合成基因的性能提升、前體物質(zhì)的進(jìn)胞、產(chǎn)物出胞以及基于細(xì)胞能量水平的優(yōu)化工作,進(jìn)一步探索高產(chǎn)NMN的工程菌株構(gòu)建策略。