陳劍,張曉梅*,史勁松,許正宏

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(宜興市食品與生物技術(shù)研究院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)

L-絲氨酸在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景,是化學(xué)和材料領(lǐng)域最有吸引力的30個骨架化合物之一[1-2];然而L-絲氨酸卻是世界氨基酸行業(yè)中工業(yè)化生產(chǎn)難度較大的氨基酸,與L-精氨酸、L-組氨酸、L-色氨酸并稱為四大瓶頸氨基酸,市場價格居高不下(25～30萬元人民幣/t)。目前,酶法轉(zhuǎn)化法、化學(xué)合成法、蛋白水解法是L-絲氨酸主要的3種生產(chǎn)方法。其中酶法轉(zhuǎn)化法采用最為普遍,但因為前體昂貴(甘氨酸,2～3萬元人民幣/t)使其生產(chǎn)成本較高?；瘜W(xué)合成法受限于產(chǎn)物分離困難和污染嚴(yán)重等問題[3]。蛋白水解法過程復(fù)雜且需要大量的酸堿液進(jìn)行洗脫,洗脫液的處理需耗費大量的人力物力[4]。所以利用廉價的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸成為當(dāng)前研究熱點[1-4]。

利用廉價的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的菌株有谷氨酸棒桿菌及大腸桿菌,谷氨酸棒桿菌是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)認(rèn)可的生產(chǎn)食品及藥品安全的菌株,所以利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸具有重要的研究意義。PETERS-WENDISCH等[5-6]在CorynebacteriumglutamicumATCC13032中敲除了3-磷酸甘油酸脫氫酶(3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH)碳端的197個氨基酸,有效地解除了L-絲氨酸的反饋抑制;然后加強(qiáng)表達(dá)L-絲氨酸合成途徑3個關(guān)鍵基因serA、serB和serC,同時弱化L-絲氨酸降解成甘氨酸途徑關(guān)鍵基因glyA的表達(dá),得到一株可以積累16 mmol/LL-絲氨酸的基因工程菌株。STOLZ等[7]研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)催化的L-絲氨酸流向甘氨酸的途徑對菌株積累L-絲氨酸有重要作用,他們通過敲除調(diào)控葉酸合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因pabAB和pabC,降低了SHMT活性,得到的重組菌株L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到36 g/L。

本研究團(tuán)隊以利用蔗糖的野生型谷氨酸棒桿菌SYPS-062為出發(fā)菌株,對該菌株進(jìn)行多輪隨機(jī)誘變得到菌株SYPS-062-33a[8]。在此基礎(chǔ)上,利用基因工程手段提高L-絲氨酸產(chǎn)量,策略包括敲除及弱化L-絲氨酸反饋抑制和降解途徑等,最終獲得高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌A[9]。但當(dāng)以葡萄糖為碳源時,谷氨酸棒桿菌A的L-絲氨酸產(chǎn)量與蔗糖為碳源時存在顯著差異;探索谷氨酸棒桿菌A在不同碳源中生產(chǎn)L-絲氨酸的能力,挖掘提高L-絲氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素,可為加快L-絲氨酸工業(yè)化過程奠定基礎(chǔ)。利用代謝組學(xué)可以定量分析菌株代謝產(chǎn)物的變化,揭示合成產(chǎn)物過程的關(guān)鍵代謝物的差異,為進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提供新思路。曹鵬等[10]利用比較代謝組學(xué)的分析方法揭示不同培養(yǎng)基條件下合成阿維菌素的關(guān)鍵代謝物,再通過理性優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,提高了阿維菌素產(chǎn)量。

本文采用GC-MS技術(shù),利用比較代謝組學(xué)的方法分析谷氨酸棒桿菌A在葡萄糖和蔗糖為碳源時胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的差異;探究菌株在不同碳源培養(yǎng)條件下碳代謝途徑[糖酵解途徑(embden-meyerhof-parnas pathway,EMP pathway),三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)]和氨基酸生物合成途徑中相關(guān)代謝物的變化情況,挖掘L-絲氨酸合成的限制因素;在此基礎(chǔ)上,提出理性添加關(guān)鍵代謝物發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的策略,從而提高菌株生產(chǎn)L-絲氨酸的能力。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌A為實驗室前期構(gòu)建并保藏[9]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,瓊脂粉20(固體)。

種子培養(yǎng)基(g/L)[9]:葡萄糖20,MgSO4·7H2O 0.5,(NH4)2SO410,腦心浸液37,K2HPO40.2,NaH2PO40.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[9]:蔗糖(葡萄糖)100,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO43,(NH4)2SO430,MnSO4·H2O 0.02,FeSO4·7H2O 0.02,生物素5×10-5,鹽酸硫胺素4.5×10-4,原兒茶酸0.03,CaCO360,葡萄糖分消后加入。

1.2.2 發(fā)酵方法

從保菌管中取少許菌液,于種子平板上劃三區(qū),再于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d,挑取單菌落在種子平板進(jìn)行二次活化,活化后的菌落全部接種至種子液體培養(yǎng)基中,于30 ℃,120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)12～14 h,至對數(shù)生長期(生物量OD562=20～25),將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,使發(fā)酵培養(yǎng)基的初始OD562值為1,進(jìn)行發(fā)酵,每隔12 h取樣,發(fā)酵周期為120 h。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測定:

取適量的發(fā)酵液,用1 mol/L的鹽酸稀釋至適當(dāng)倍數(shù),采用紫外分光光度計于562 nm處測定OD562值作為生物量。

1.3.2 糖濃度測定

發(fā)酵液中蔗糖濃度利用HPLC進(jìn)行測定[11]。采用Hypersil APS-2 (5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,示差折光檢測器,流動相為75%的乙腈,柱溫35 ℃,檢測器溫度40 ℃,流速1 mL/min。發(fā)酵液中葡萄糖濃度利用SBA-40型葡萄糖測定儀測定[9]。

1.3.3 氨基酸濃度測定

利用HPLC測定氨基酸濃度,HPLC程序參考文獻(xiàn)[12]。

1.4 樣品處理及GC-MS檢測

GC-MS樣品預(yù)處理及檢測方法參考文獻(xiàn)[13-15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

GC-MS所得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MSD ChemStation軟件,再利用R的XCMS程序得到質(zhì)核比、保留時間峰面積等參數(shù)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)權(quán)重變換,再將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P(v13.0)軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計分析[主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)][16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸棒桿菌A以蔗糖和葡萄糖為碳源時發(fā)酵表型的差異

將谷氨酸棒桿菌A分別接種于以蔗糖和葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)120 h,每12 h取樣,測定菌株發(fā)酵過程中的生物量、殘?zhí)菨舛群椭饕被岬臐舛?發(fā)酵結(jié)果如圖1及表1所示。

圖1 谷氨酸棒桿菌A利用蔗糖和葡萄糖發(fā)酵過程 生長和殘?zhí)菨舛惹€Fig.1 Growth and sugar consumption of C.glutamicum A on sucrose or glucose

由圖1可知,谷氨酸棒桿菌A以葡萄糖為碳源發(fā)酵時,在12～48 h期間表現(xiàn)出較快的生長速率,但48 h后菌株在蔗糖培養(yǎng)基中生長速率更高。當(dāng)以葡萄糖為碳源發(fā)酵時生物量OD562值達(dá)到44.27,相比于蔗糖培養(yǎng)時的OD562值(50.30)下降12.0%。從圖1還可以看出,菌株利用蔗糖的速率明顯高于葡萄糖。此外,由表1可知,在蔗糖培養(yǎng)基中,菌株A發(fā)酵120 h,L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到20.01 g/L;而以葡萄糖為碳源時,菌株A在發(fā)酵120 hL-絲氨酸產(chǎn)量為16.06 g/L,較蔗糖下降19.9%,副產(chǎn)物L(fēng)-脯氨酸和L-丙氨酸變化不大,而L-纈氨酸在葡萄糖為碳源時提高62.7%。谷氨酸棒桿菌可以利用蔗糖和葡萄糖等作為碳源,KIEFER等[18]發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌21526利用葡萄糖為碳源時生物量較高。NIE等[19]構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌SO30利用葡萄糖為碳源時生物量和L-鳥氨酸產(chǎn)量均較高。而我們以自然界篩選的谷氨酸棒桿菌SYPS-062為出發(fā)菌株,通過誘變及代謝工程改造后獲得的谷氨酸棒桿菌A則以蔗糖為碳源時生物量和L-絲氨酸產(chǎn)量較高。為探討谷氨酸棒桿菌A以蔗糖和葡萄糖為碳源時代謝過程中的差異,采用代謝組學(xué)方法進(jìn)行下一步研究。

表1 菌株利用葡萄糖和蔗糖時胞外主要氨基酸積累情況 單位:g/L

2.2 基于GC-MS的谷氨酸棒桿菌A在不同碳源發(fā)酵過程代謝輪廓比較

采用GC-MS對谷氨酸棒桿菌A在以蔗糖和葡萄糖為碳源時的代謝圖譜進(jìn)行分析,共檢測到171種胞內(nèi)代謝物,對其中的81種物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析。由圖2-a可知,這些代謝物包括了糖類、氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸、磷酸化合物、多元醇、核苷酸類。圖2-b為2種培養(yǎng)條件下代謝物隨時間變化的熱圖,它直接顯示了每一個代謝物的變化情況。由圖2-b可知,在谷氨酸棒桿菌A在不同碳源發(fā)酵過程中細(xì)胞代謝圖譜具有顯著的差異。在蔗糖培養(yǎng)條件下,EMP途徑中6-磷酸果糖、6-磷酸蔗糖等關(guān)鍵物質(zhì)含量較高,而TCA循環(huán)的相關(guān)物質(zhì)含量則較低,說明菌株在蔗糖培養(yǎng)條件下可能有更多的碳流向L-絲氨酸。

2.3 谷氨酸棒桿菌A在不同碳源發(fā)酵過程中代謝組差異分析

曹鵬等[10]和許娟等[20]分別利用代謝組學(xué)結(jié)合多元統(tǒng)計方法分析了阿維鏈霉菌和谷氨酸棒桿菌13032在不同培養(yǎng)條件下胞內(nèi)代謝物的差異,并進(jìn)一步通過發(fā)酵實驗驗證了改變胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。本文將谷氨酸棒桿菌A在以蔗糖和葡萄糖為碳源時的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,獲得PCA得分圖(圖3)。

a-GC-MS檢測到的胞內(nèi)代謝物分類;b-谷氨酸棒桿菌A以 蔗糖和葡萄糖為碳源時的熱圖圖2 谷氨酸棒桿菌A在以蔗糖和葡萄糖為碳源時的代謝圖譜Fig.2 Metabolic map of C.glutamicum A with sucrose and glucose as carbon sources

如圖3-a所示,圖中R2X是模型的可解釋度,通常情況下,R2高于0.5較好,且兩者差值不應(yīng)過大,R2最大值為1。以蔗糖和葡萄糖為碳源時的樣本處于不同的聚類區(qū)域,每個樣品的平行樣本分布集中,說明相同實驗組內(nèi)樣品重復(fù)性優(yōu)異。不同組間樣本點離散現(xiàn)象十分明顯,說明在不同碳源的培養(yǎng)條件下胞內(nèi)物質(zhì)存在顯著差異。同時,所有樣本點基本都處于95%置信區(qū)間內(nèi),說明該PCA模型可信度較高[21]。

圖3-b是不同培養(yǎng)基條件下胞內(nèi)代謝物的PCA載荷圖,從圖3-b可以看出,分析了81種代謝物,其中19種代謝物變化較大,其余物質(zhì)變化較小。

圖3-c為樣品的PLS-DA,圖中R2X是模型X變量(自變量)的可解釋度,R2Y為模型Y變量(因變量)的可解釋率,Q2是模型的可預(yù)測度,通常情況下,R2與Q2高于0.5較好,且兩者差值不應(yīng)過大,R2和Q2最大值為1。從圖3-c可以說明不同碳源培養(yǎng)時胞內(nèi)代謝物的差異可能是導(dǎo)致L-絲氨酸產(chǎn)量發(fā)生變化的主要原因。

PLS-DA的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)圖如圖4所示,一般認(rèn)為,VIP≥1則關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。VIP值越大則表明相關(guān)性越強(qiáng),對L-絲氨酸合成的貢獻(xiàn)越大[22]。圖4中15種物質(zhì)與L-絲氨酸合成最為相關(guān),按相關(guān)程度從高到低排序,它們分別為葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油酸、丙酮酸、6-磷酸果糖、丙氨酸、琥珀酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及蛋氨酸。

a-不同培養(yǎng)條件下L-絲氨酸合成PCA得分圖;b-不同培養(yǎng)條件下PCA結(jié)果;c-不同培養(yǎng)條件下PLS-DA結(jié)果圖3 谷氨酸棒桿菌A在以蔗糖和葡萄糖為碳源時的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of metabolomics data of C.glutamicum A with sucrose and glucose as carbon sources

1-葡萄糖;2-6-磷酸葡萄糖;3-3-磷酸甘油酸;4-丙酮酸; 5-6-磷酸果糖;6-丙氨酸;7-琥珀酸;8-富馬酸;9-檸檬酸;10-蘋 果酸;11-苯丙氨酸;12-色氨酸;13-脯氨酸;14-甘氨酸;15-蛋氨酸圖4 胞內(nèi)代謝物第一主成分VIP圖Fig.4 Correlation size analysis of intracellular metabolites for L-serine synthesis by PLS-DA

2.4 結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)分析不同碳源下谷氨酸棒桿菌代謝特征

為闡明關(guān)鍵代謝物與關(guān)鍵代謝途徑之間相互作用的關(guān)系,結(jié)合PLS-DA結(jié)果,計算并分析了谷氨酸棒桿菌A在不同碳源培養(yǎng)下胞內(nèi)代謝物含量的相對比值,分析包含了EMP、TCA及氨基酸代謝等生物合成途徑。

2.4.1 與EMP途徑相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化

谷氨酸棒桿菌A采用蔗糖和葡萄糖發(fā)酵時與EMP途徑相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化如圖5-a所示。谷氨酸棒桿菌A在蔗糖培養(yǎng)條件下6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate,G-6-P)和6-磷酸果糖(fructose 6-phosphate,F-6-P)的含量是葡萄糖培養(yǎng)時的9.51、8.75倍,說明蔗糖培養(yǎng)條件下EMP途徑相關(guān)酶活性可能更高,這與ZHANG等[23]強(qiáng)化EMP途徑可提高谷氨酸棒桿菌生物合成L-絲氨酸的研究結(jié)果相一致。從圖5-a還可以看出,在蔗糖培養(yǎng)條件下,合成L-絲氨酸的前體物質(zhì)3-磷酸甘油含量很低,說明3-磷酸甘油被充分用于L-絲氨酸合成。SAWADA等[24]通過敲除谷氨酸棒桿菌13032的基因pyK減少了磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid,PEP)流向丙酮酸,使更多的碳流量流向L-谷氨酸的合成,提高了L-谷氨酸的產(chǎn)量。本文中以葡萄糖為碳源時,胞內(nèi)丙酮酸含量是蔗糖培養(yǎng)條件下的1.84倍,說明葡萄糖培養(yǎng)條件下更多的碳流向了丙酮酸合成途徑。

2.4.2 與TCA循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化

喬郅鈉等[25]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)對谷氨酸合成十分關(guān)鍵,并通過加強(qiáng)該酶的表達(dá)使EMP途徑更多的碳流流向TCA循環(huán),從而提高了谷氨酸棒桿菌G01的谷氨酸產(chǎn)量。MAN等[26]通過代謝工程改造EMP途徑將碳流量更多地引入到TCA循環(huán),使得谷氨酸棒桿菌SYPA5-5生長和L-精氨酸的產(chǎn)量均得到提高。谷氨酸棒桿菌A在蔗糖和葡萄糖發(fā)酵條件下與TCA循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化如圖5-b所示,菌株在葡萄糖培養(yǎng)條件下,TCA循環(huán)中富馬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、蘋果酸和檸檬酸這5種關(guān)鍵代謝物濃度比在蔗糖培養(yǎng)條件下分別提高了5.02、1.98、1.22、3.76、2.71倍;說明有更多的碳流進(jìn)入TCA循環(huán),從而使流向合成絲氨酸途徑的碳流量發(fā)生了下降。這與谷氨酸棒桿菌A在蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵時具有更高的產(chǎn)量相符,由此后續(xù)實驗考慮添加富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸,提高L-絲氨酸產(chǎn)量。

2.4.3 與氨基酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化

蔗糖和葡萄糖發(fā)酵條件下與氨基酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵代謝物變化如圖5-c所示。當(dāng)以葡萄糖為碳源時,蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸和色氨酸分別提高了2.97、2.23、1.66、1.52、1.21倍,甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和高半胱氨酸則下降。其中脯氨酸的提高可能由于菌株在葡萄糖培養(yǎng)下,TCA循環(huán)中間代謝物濃度的提高從而合成了更多的α-酮戊二酸,前體的增加也就導(dǎo)致了更多脯氨酸的生成。從圖5還可以看出,在蔗糖培養(yǎng)條件下,副產(chǎn)物丙氨酸的濃度有所下降,可能由于胞內(nèi)更多的碳流量流向了絲氨酸的合成途徑。

a-糖酵解途徑(PYR-丙酮酸;F6P-果糖-6-磷酸;G6P-葡萄糖-6-磷酸;3GP-3-磷酸甘油);b-三羧酸循環(huán); c-氨基酸代謝途徑(Met-蛋氨酸;Phe-苯丙氨酸;Ala-丙氨酸;Pro-脯氨酸;Try-色氨酸;Gly-甘氨酸;Thr-蘇氨酸;Cys-半胱氨酸;Hom-高半胱氨酸)圖5 以蔗糖和葡萄糖為碳源時菌株A的代謝物變化Fig.5 Levels of intracellular metabolites of key pathways during sucrose and glucose fermentation

2.5 理性強(qiáng)化TCA循環(huán)提高L-絲氨酸產(chǎn)量

通過以上分析,我們在蔗糖培養(yǎng)基中分別添加TCA循環(huán)差異代謝物(富馬酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸),考察強(qiáng)化TCA循環(huán)對L-絲氨酸產(chǎn)量的影響。設(shè)置添加質(zhì)量濃度為0.5、1、1.5、2、2.5 g/L,發(fā)酵結(jié)果如圖6所示,從圖6-a和圖6-b可以看出,添加適量的α-酮戊二酸和蘋果酸雖然促進(jìn)了菌株的生長,但L-絲氨酸產(chǎn)量變化不大。由圖6-c可以看出,外源添加檸檬酸會同時抑制菌株的生長與產(chǎn)酸水平。從圖6-d和圖6-e可以看出,添加富馬酸

a-添加α-酮戊二酸;b-添加蘋果酸;c-添加檸檬酸;d-添加富馬酸;e-添加琥珀酸圖6 外源添加三羧酸循環(huán)關(guān)鍵代謝物對菌株發(fā)酵影響Fig.6 Effect of exogenous addition of key metabolites of tricarboxylic acid cycle on fermentation of strain

會抑制菌株的生長,其中添加2.5 g/L的富馬酸對菌株生長抑制最明顯,生物量下降了33.9%。添加富馬酸雖然抑制菌株生長,但有利于菌株產(chǎn)L-絲氨酸。其中添加2 g/L的富馬酸時L-絲氨酸產(chǎn)量提高最為顯著,提高29.8%。同時發(fā)現(xiàn)添加2.5 g/L的琥珀酸對菌株生長抑制最明顯,菌株生物量下降了32%。添加琥珀酸雖然抑制了菌株生長,但有利于產(chǎn)酸,其中添加2 g/L的琥珀酸L-絲氨酸產(chǎn)量提高最為顯著,提高了24.6%。吳潔琴[27]通過強(qiáng)化TCA循環(huán),提高了重組菌株L-精氨酸的產(chǎn)量。許娟等[20]利用代謝組學(xué)挖掘分析影響谷氨酸棒桿菌13032L-瓜氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵代謝物,再通過外源添加的手段使得L-瓜氨酸產(chǎn)量提高了12.8%。這些研究表明TCA循環(huán)對菌株生長及產(chǎn)物生產(chǎn)影響較大,通過分析影響目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵代謝物,進(jìn)一步通過外源添加關(guān)鍵代謝物等策略可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

通過對谷氨酸棒桿菌A在蔗糖和葡萄糖培養(yǎng)條件下進(jìn)行比較代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌A在蔗糖培養(yǎng)條件下TCA循環(huán)及氨基酸代謝的整體水平高于葡萄糖,這種差異可能是菌株在蔗糖培養(yǎng)基中L-絲氨酸產(chǎn)量更高的原因。通過多元統(tǒng)計分析,推測是胞內(nèi)6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油酸、葡萄糖、6-磷酸果糖、丙酮酸、丙氨酸、琥珀酸、高半胱氨酸、檸檬酸、蘋果酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸含量的差異,導(dǎo)致了L-絲氨酸產(chǎn)量的差異。其中富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸對TCA循環(huán)代謝途徑的影響較大,通過增加這些物質(zhì),可能會改善菌株的發(fā)酵性能。本文通過比較代謝組學(xué)分析對L-絲氨酸合成具有促進(jìn)效應(yīng)的關(guān)鍵代謝物,再通過提高關(guān)鍵代謝物的濃度進(jìn)而使代謝途徑向有利于產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行,在此基礎(chǔ)上提出了蔗糖培養(yǎng)基的改進(jìn)策略。結(jié)果表明,當(dāng)外源添加2 g/L的富馬酸時,L-絲氨酸產(chǎn)量提高了29.8%。表明基于比較代謝組學(xué)分析理性優(yōu)化培養(yǎng)基的方法可以提高L-絲氨酸的產(chǎn)量。