儀澤會，趙婧，毛麗萍

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的蘆筍EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及通用性分析

儀澤會，趙婧，毛麗萍

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/蔬菜花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031

【目的】明確蘆筍轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布規(guī)律，開發(fā)高信息量的EST-SSR標(biāo)記并分析通用性，為天門冬屬植物系統(tǒng)進(jìn)化分析、功能基因挖掘及分子標(biāo)記輔助育種提供工具?！痉椒ā恳怨P者課題組前期獲得的15個蘆筍根系RNA-seq數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用MISA軟件檢索SSR位點(diǎn)、Primer3.0軟件批量設(shè)計(jì)引物及TB-tools軟件批量e-PCR與Primer-blast程序逐一e-PCR相結(jié)合的方法剔除非有效引物。通過與基因組序列比對，獲取標(biāo)記所屬基因id、物理位置、潛在功能等信息。隨機(jī)合成引物50對，以9份蘆筍、7份天門冬、5份文竹和3份蓬萊松種質(zhì)為材料，檢測引物有效性、多態(tài)性和通用性。【結(jié)果】共檢索出SSR位點(diǎn)36 590個，分布于30 229條Unigene，發(fā)生頻率為4.78%，平均間距為9.17 kb。SSR位點(diǎn)非均勻分布于10條染色體，7號染色體數(shù)量最多（4 642個），3號染色體密度最高（37.86 SSR/Mb）。SRR位點(diǎn)從單核苷酸至六核苷酸均有分布，以三核苷酸（46.92%）類型最豐富，AG/CT（16.58%）基序最具優(yōu)勢。成功設(shè)計(jì)EST-SSR引物19 695對，經(jīng)e-PCR檢測共剔除非有效引物15 147對，其中，3 085對無擴(kuò)增產(chǎn)物、10 102對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期嚴(yán)重不符、1 289對物理位置未知、402對存在與目的條帶大小相似的其他擴(kuò)增產(chǎn)物、269對擴(kuò)增產(chǎn)物無SSR序列。以位于基因區(qū)域的2 517個EST-SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)，構(gòu)建染色體密度分布圖，總覆蓋長度1 125.51 Mb，平均圖距447.16 kb，潛在功能涉及產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性等多方面。隨機(jī)合成的50對引物均可擴(kuò)增出清晰目標(biāo)條帶，其中36對具有多態(tài)性，平均多態(tài)性信息含量為0.330，在天門冬、文竹和蓬萊松中的通用性分別達(dá)到100.00%、92.00%和88.00%?；贓ST-SSR鑒定結(jié)果的聚類分析，可將24份材料分為蘆筍、天門冬、文竹和蓬萊松4類，與植物學(xué)分類完全一致?！窘Y(jié)論】成功開發(fā)出高信息量的蘆筍EST-SSR標(biāo)記2 517個，有效擴(kuò)增率100%，總覆蓋長度1 125.51 Mb，平均圖距447.16 kb，可用于蘆筍及其近緣物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析。同時，可為其他物種的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)提供借鑒。

轉(zhuǎn)錄組；蘆筍；EST-SSR；染色體密度分布圖；功能注釋

0 引言

【研究意義】蘆筍（L.）是一種重要的蔬菜作物，天門冬科天門冬屬，富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等人體必需營養(yǎng)元素，以及皂苷、蘆丁、黃酮等生物活性成分，具有較高的營養(yǎng)、保健和藥用價值，深受消費(fèi)者喜愛[1-2]。蘆筍是典型的雌雄異株、多年生植物，基于表型選擇的傳統(tǒng)育種手段存在周期長、難度大等缺陷，導(dǎo)致品種更新?lián)Q代速度難以滿足生產(chǎn)需求，尤其是缺少抗病、高品質(zhì)和設(shè)施專用品種[1]。分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）是對基因型進(jìn)行直接選擇，不受生長條件、取材部位和株齡影響，可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的加速聚合，縮短育種周期[3]。目前，由于缺乏高質(zhì)量的分子標(biāo)記，致使蘆筍分子輔助選擇育種進(jìn)展緩慢，遠(yuǎn)落后于大白菜、辣椒等蔬菜作物。EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)可為MAS提供分子工具，對實(shí)現(xiàn)蘆筍育種早期選擇、提高育種效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是由1—6個核苷酸組成的基序，經(jīng)多次重復(fù)形成的DNA片段，廣泛分布于基因組[4]。SSR基序重復(fù)次數(shù)高度變化、側(cè)翼序列相對保守，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物長度多態(tài)性，SSR分子標(biāo)記應(yīng)運(yùn)而生。與RAPD、SRAP等分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[5]。EST-SSR來源于基因內(nèi)部，保守性更高，基序重復(fù)次數(shù)變化即可能對基因功能或表達(dá)產(chǎn)生影響[5]。因此，與g-SSR相比，EST-SSR往往具有更高的種間通用性、標(biāo)記輔助選擇效率和功能標(biāo)記潛在性，利用價值更高[5]。目前，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于牡丹[6]、開心果[7]、巢蕨[8]、象草[9]等眾多植物中，極大促進(jìn)了植物的遺傳多樣性分析[10]、遺傳圖譜構(gòu)建[11]、重要農(nóng)藝性狀定位[12-13]及分子標(biāo)記輔助選擇育種[14-15]等研究。Li等[16]基于蘆筍基因組序列開發(fā)了41 917個SSR標(biāo)記，但引物有效擴(kuò)增率、標(biāo)記物理位置、所屬基因id及潛在的生物學(xué)功能等信息未知，影響使用效率；盛文濤等[17]基于EST序列開發(fā)了424個EST-SSR標(biāo)記，但引物有效擴(kuò)增率僅為84%，類似的情況也存在于牡丹（51.50%）[6]、紫楠（43.62%）[18]蘇丹草（76.7%）[19]苔草（74.61%）[20]和芒草（75.30%）[21]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，蘆筍中可供利用的分子標(biāo)記數(shù)量仍非常有限，尤其是缺乏高質(zhì)量的EST-SSR分子標(biāo)記。大量非有效引物的存在，不僅增加了鑒定成本，而且影響基因型鑒定的準(zhǔn)確性。【擬解決的關(guān)鍵問題】以筆者課題組前期獲得的蘆筍根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，挖掘SSR位點(diǎn)并分析其在轉(zhuǎn)錄組中的分布規(guī)律；以蘆筍基因組序列為模板，采用TB-tools批量e-PCR與Primer-blast逐一e-PCR相結(jié)合的方法剔除非有效擴(kuò)增引物；通過與基因組序列比對，完善EST-SSR標(biāo)記的所屬基因id、物理位置及潛在生物學(xué)功能等信息，以豐富蘆筍EST-SSR分子標(biāo)記數(shù)量，為天門冬屬植物系統(tǒng)進(jìn)化分析、分子標(biāo)記輔助育種及優(yōu)異功能基因挖掘等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021—2022年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽試驗(yàn)示范實(shí)習(xí)實(shí)訓(xùn)基地和蔬菜花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以24份天門冬屬植物為材料，其中，蘆筍9份、天門冬7份、文竹5份、蓬萊松3份（表1）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于對15個蘆筍根系鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組的Illumina高通量測序，共128.42 Gb數(shù)據(jù)，856 152 362個原始讀長。

表1 24份天門冬屬種質(zhì)信息

1.2 測序數(shù)據(jù)的處理、SSR位點(diǎn)搜索及引物設(shè)計(jì)

測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾，剔除帶接頭、N比例大于10%和低質(zhì)量的序列，獲得828 661 100個去雜讀長。隨后，用De Novo拼接和去冗余獲得Unigene。采用MISA（http://pgrc.ipk-gater sleben.de/misa/）軟件檢索SSR位點(diǎn)，檢索條件為1—6核苷酸重復(fù)次數(shù)分別為12、6、5、5、4和4。若兩個SSR間的距離≤50 bp，則認(rèn)定為復(fù)合SSR位點(diǎn)。SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率（%）=SSR位點(diǎn)數(shù)量×100/Unigene數(shù)量；SSR位點(diǎn)平均距離=Unigene總堿基數(shù)量/SSR位點(diǎn)數(shù)量。采用Primer 3.0軟件批量設(shè)計(jì)EST-SSR引物，參數(shù)為：引物長度18—25 bp，擴(kuò)增長度為100—300 bp，退火溫度為50—65 ℃，GC含量維持在45%—65%，無發(fā)卡和引物二聚體等二級結(jié)構(gòu)。每個位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對引物，擇優(yōu)選用。

1.3 引物質(zhì)量的e-PCR檢測、物理圖譜構(gòu)建及功能注釋

以蘆筍基因組為模板，采用TB-tools軟件對引物質(zhì)量進(jìn)行批量e-PCR檢測，檢測條件為：距3'端5 bp范圍內(nèi)無錯配堿基，總錯配堿基數(shù)≤2。據(jù)檢測結(jié)果，擇優(yōu)選取SSR引物，剔除無擴(kuò)增（Ⅰ類）、擴(kuò)增產(chǎn)物長度＜100 bp或＞300 bp（Ⅱ類）和物理位置不確定的引物（Ⅲ類）。初步篩選出的引物，再經(jīng)NCBI的Primer-blast逐一e-PCR質(zhì)量檢測，剔除擴(kuò)增產(chǎn)物存在2個及以上與目的條帶大小相似的引物（Ⅳ類）及無SSR位點(diǎn)的引物（Ⅴ類）。通過與蘆筍基因組序列比對，完善SSR標(biāo)記的物理位置、所屬基因及基因區(qū)域等信息，進(jìn)一步剔除所屬基因不明確的引物（Ⅵ類）。據(jù)標(biāo)記物理位置，采用Phython軟件繪制染色體密度分布圖。據(jù)標(biāo)記所屬基因序列，利用GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋和代謝通路分析。

1.4 蘆筍DNA提取及PCR檢測

從各材料中選擇最具代表性的5株，取幼葉、等量混合后，采用植物DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，采用NanoDrop 1000檢測DNA質(zhì)量和濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取均勻分布于10條染色體的50對SSR引物用于PCR檢測，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為10 μL，包括50 ng·μL-1DNA模板0.2 μL、10 μmol·L-1引物0.5 μL、2×Taq PCR Mix 3 μL、滅菌ddH2O 5.8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分別采用0.2% AgNO3和1.5% NaOH染色和顯色。產(chǎn)物回收方法：從PAGE膠中割取目標(biāo)片段，用100 μL ddH2O洗滌2次后，加入1×PCR Buffer 100 μL并將凝膠碾碎，65 ℃下水浴10 min，離心，以1 μL上清液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若為目標(biāo)條帶，則直接進(jìn)行產(chǎn)物測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Popgen32軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC），采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用Origin 2019和Phython軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及組裝

從15個蘆筍根系轉(zhuǎn)錄組中共測得856 152 362個原始讀長，經(jīng)過濾獲得828 661 100個去雜讀長，Q30達(dá)90.81%，GC含量為48.45%。經(jīng)De Novo組裝和去冗余，共獲得631 883條Unigene，總長度為335 428 792 bp，其中，176 961條Unigene長度≥500 bp，平均長度為530 bp，N50為701 bp，可用于后續(xù)分析。

2.2 SSR位點(diǎn)的分布

共檢索到SSR位點(diǎn)36 590個，分布于30 229條Unigene，發(fā)生頻率為4.78%，平均密度為109.1 SSR/Mb，即每9.17 kb出現(xiàn)一個SSR位點(diǎn)。其中，4 974條Unigene含2個及以上SSR位點(diǎn)，2 233條Unigene以復(fù)合SSR位點(diǎn)形式存在。SSR位點(diǎn)非均勻分布于10條染色體，其中，7號染色體數(shù)量最多（4 642個），3號染色體密度最高（37.86 SSR/Mb）（圖1）。

SSR重復(fù)類型從單核苷酸到六核苷酸，數(shù)量差異明顯（表2）。其中，三核苷酸（46.92%）占比最高，其次為二核苷酸（27.18%）和單核苷酸（19.02%）（表2）。SSR重復(fù)次數(shù)分布范圍為4—65次，其中4—14次重復(fù)占比達(dá)88.23%，主要集中在5次（34.10%）、6次（20.23%）、7次（10.77%）、8次（7.06%）和12次（6.19%）重復(fù)（表2）。單核苷酸至六核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)次數(shù)分別為12、6、5、5、4和4次，分別占各自重復(fù)類型的24.31%、33.09%、52.92%、64.02%、77.73%和85.56%。

共發(fā)現(xiàn)337種SSR基序，單核苷酸至六核苷酸分別為2、4、10、29、91和201種。A/T、AG/CT、AGC/GCT、AAAT/ATTT分別為單核苷酸至四核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)基序，分別占各自重復(fù)類型的86.62%、61.01%、28.22%和19.86%；AAAAT/ATTTT和AAAAG/CTTTT是五核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基序，占比分別為14.06%和13.54%；六核苷酸重復(fù)中，基序AAAAAG/CTTTTT和AACCCT/ AGGGTT分布具有一定優(yōu)勢，占比分別為7.38%和6.31%（圖2）。SSR長度分布范圍為12—190 bp，以12—25 bp為主，占總數(shù)的87.69%。其中，長度15 bp占比最高（24.03%），其次為18 bp（12.20%）和12 bp（11.92%）（圖3）。

圖1 蘆筍轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)在染色體中的分布特征

表2 SSR位點(diǎn)在蘆筍轉(zhuǎn)錄組中的分布特征

2.3 SSR標(biāo)記的開發(fā)、e-PCR質(zhì)量檢測及圖譜構(gòu)建

36 590個SSR位點(diǎn)中，共有19 695個位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)出EST-SSR引物。經(jīng)TB-tools軟件批量e-PCR質(zhì)量檢測，共剔除SSR引物14 476對，其中，Ⅰ類3 085對、Ⅱ類10 102對及Ⅲ類1 289對。采用NCBI中的Primer-blast對篩選出的5 219對SSR引物逐一e-PCR質(zhì)量檢測，共剔除SSR引物671對，其中，Ⅳ類402對、Ⅴ類269對。隨機(jī)選擇Ⅰ—Ⅴ類引物各10對進(jìn)行PCR驗(yàn)證（附表1，https://pan.baidu.com/s/1wgSxI9ru830awx1FSeyMTg? pwd=8888）。結(jié)果表明，Ⅰ類引物中，均無擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅱ類引物中，10對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期嚴(yán)重不符，經(jīng)測序，6對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含內(nèi)含子，4對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為非目標(biāo)條帶；Ⅲ類引物中，10對均可擴(kuò)增出預(yù)期條帶，產(chǎn)物序列經(jīng)與蘆筍基因組比對，均無法獲得具體物理位置；Ⅳ類引物中，10對引物均存在2個或以上的擴(kuò)增條帶，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)存在與目標(biāo)序列大小相似的非目標(biāo)序列，對基因型鑒定造成嚴(yán)重干擾；Ⅴ類引物中，10對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期相似，但序列均不含SSR位點(diǎn)。進(jìn)一步對4 548個有效擴(kuò)增的EST-SSR序列進(jìn)行基因區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)2 031個位點(diǎn)位于基因間區(qū)（Ⅵ類），2 517個位點(diǎn)位于基因區(qū)域，共涉及2 208個基因。以2 517個SSR標(biāo)記的物理位置為基礎(chǔ)，構(gòu)建染色體密度分布圖，整體呈現(xiàn)兩端密集、中間稀疏的特點(diǎn)（圖4），總覆蓋長度1 125.51 Mb，平均密度為2.24個/Mb，平均圖距447.16 kb。其中，7號染色體SSR標(biāo)記數(shù)量最多（340個），3號染色體密度最高（2.70個/Mb）。SSR標(biāo)記的引物序列、產(chǎn)物大小、物理位置、所屬基因、基因區(qū)域、潛在功能及可能涉及的農(nóng)藝性狀等信息詳見附表2（https://pan.baidu.com/s/1aVnuo3uI13QeXN9HbLSr3g? pwd=8888）。

圖2 蘆筍轉(zhuǎn)錄組中的SSR基序及分布

圖3 蘆筍轉(zhuǎn)錄組中的SSR基序長度分布

2.4 SSR標(biāo)記所屬基因的功能注釋

將包含2 517個EST-SSR標(biāo)記的2 208個基因與GO數(shù)據(jù)庫比對，共有1 902個基因被注釋，分別有1 459、1 501和1 676個基因被注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分與分子功能，共涵蓋5 143個子集。三大GO功能分類中，占比最高的分別為代謝過程、細(xì)胞膜和蛋白結(jié)合，分別為21.26%、46.19%和48.56%。SSR位于編碼區(qū)的基因中，最豐富的GO條目為蛋白結(jié)合（12.56%），其次為細(xì)胞過程（11.53%）和細(xì)胞器（10.99%）；SSR位于3'-UTR的基因中，蛋白結(jié)合（11.79%）和細(xì)胞器（11.79%）條目最豐富，其次為細(xì)胞過程（11.23%）；SSR位于5'-UTR的基因中，細(xì)胞器（10.95%）和細(xì)胞過程（10.95%）條目最豐富，其次為蛋白結(jié)合（9.94%）；SSR位于內(nèi)含子的基因中，細(xì)胞過程（12.16%）條目占比最高，其次為細(xì)胞器（11.45%）和代謝過程（9.24%）（圖5）。

圖4 2517個EST-SSR標(biāo)記在染色體中的分布

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，2 208個基因中有471個基因被注釋到222條代謝通路中，歸為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和生物系統(tǒng)5個類別，分別包含43、54、110、214和50個基因，優(yōu)勢通路分別為運(yùn)輸與代謝、信號傳導(dǎo)、翻譯、碳水化合物代謝和發(fā)育，占比分別為54.95%、98.78%、54.35%、16.76%和39.51%。SSR位于編碼區(qū)的基因中，最豐富的通路為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（14.16%），其次為翻譯（12.33）和碳水化合物代謝（7.76%）；SSR位于3'-UTR的基因中，翻譯（12.20%）最為豐富，其次為次級代謝產(chǎn)物合成（11.23%）；SSR位于5'-UTR的基因中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（11.57%）最為豐富，其次為碳水化合物代謝（8.26%）和翻譯（7.44%）；SSR位于內(nèi)含子的基因中，翻譯（14.64%）通路占比最高，其次為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（8.19%）和氨基酸代謝（7.69%）（圖6）。

2.5 50對SSR標(biāo)記的多態(tài)性檢測

隨機(jī)合成的50對EST-SSR引物均可擴(kuò)增出清晰的目標(biāo)條帶（圖7），有效擴(kuò)增率為100%（表3）。其中，36對引物存在多態(tài)性擴(kuò)增，比例為72.00%（圖7）。50對SSR引物共擴(kuò)增出條帶100種，平均每對引物具有2個等位基因；多態(tài)性信息含量（PIC）分布于0—0.691，均值為0.330（表3）。位于基因不同區(qū)域的SSR多態(tài)性存在明顯差異。SSR位于CDS、3'-UTR、5'-UTR和Intron的引物中，多態(tài)性引物比例分別為64.29%、100.00%、85.71%和76.92%；平均每對引物分別可擴(kuò)增1.89、2.5、2.14和2.15種條帶，平均PIC值分別為0.253、0.544、0.374和0.319；14對非多態(tài)性引物中，SSR位于CDS的引物占據(jù)10對，比例達(dá)71.43%。

2.6 EST-SSR標(biāo)記的通用性分析

50對隨機(jī)EST-SSR引物中，分別有50對、46對和44對在天門冬、文竹和蓬萊松中成功擴(kuò)增出清晰目標(biāo)條帶（圖7），通用性分別達(dá)100.00%、92.00%和88.00%。其中，具有多態(tài)性的引物分別有25、10和11對，多態(tài)性比例分別為50.00%、21.74%和25.00%。說明本研究開發(fā)的蘆筍EST-SSR標(biāo)記在近緣物種天門冬、文竹、蓬萊松中均具有較高的通用性。聚類分析表明，24份天門冬屬材料被分為4類，分類結(jié)果與植物學(xué)分類完全一致（圖8），表明本研究開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記可用于天門冬屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

圖5 EST-SSR標(biāo)記所屬基因的GO功能注釋

圖6 EST-SSR標(biāo)記所屬基因的KEGG分析

圖7 隨機(jī)EST-SSR引物在24份天門冬屬種質(zhì)中的擴(kuò)增（部分）

表3 50對隨機(jī)合成的蘆筍EST-SSR引物信息

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

圖8 24份天門冬屬材料基于EST-SSR鑒定數(shù)據(jù)的聚類分析

3 討論

3.1 蘆筍轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)及分布

微衛(wèi)星序列是基因組的重要組成部分，常因發(fā)生滑動鏈錯配和非正常重組交換而導(dǎo)致基序重復(fù)次數(shù)變化，是物種進(jìn)化、生物多樣性形成及部分遺傳疾病發(fā)生的主要原因之一[4,22-24]。前人研究表明，SSR分布因物種、染色體和染色體區(qū)段不同而存在較大差異[4,25-26]。本研究中，從631 883條Unigene中共檢索出位點(diǎn)36 590個，出現(xiàn)頻率為4.78%，低于牡丹（5.21%）[6]、巢蕨（11.71%）[8]和象草（9.41%）[9]，高于濕地松（4.24%）[27]和擬輪枝鐮孢菌（1.09%）[28]，可能由物種轉(zhuǎn)錄組大小、測序質(zhì)量和SSR位點(diǎn)檢索參數(shù)設(shè)置等多個方面差異共同造成。從重復(fù)類型來看，蘆筍轉(zhuǎn)錄組三核苷酸（46.92%）占比最高，其次為二核苷酸（27.18%）和單核苷酸（19.02%），而四、五、六核苷酸類型僅占SSR總量的6.88%，這與開心果[7]、四棱豆[10]和甘蔗[29]等結(jié)果一致。自身長度過長是導(dǎo)致高級基序發(fā)生頻率過低的主要原因；轉(zhuǎn)錄組序列包含編碼區(qū)，三核苷酸重復(fù)次數(shù)變異不會引起移碼突變，具有較好的容受性，這是三核苷酸重復(fù)占比最高的主要原因。單核苷酸重復(fù)中，基序A/T（86.62%）最為常見，與花生[25]結(jié)果一致；AG/CT（61.01%）是二核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢基序，與開心果[7]和花生[25]等一致，而與牡丹（5.21%）[6]等存在一定出入；三核苷酸重復(fù)類型中，AGC/GCT（28.22%）、AGG/CCT（12.29%）和CCG/CGG（11.49%）是最常見基序，與象草[9]情況類似，而甘蔗[29]則以ACA/TGT、CCG/GGC和CGG/GCC為優(yōu)勢基序，說明SSR優(yōu)勢基序因物種而異，具有一定的偏向性。

3.2 蘆筍EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)、圖譜構(gòu)建及功能注釋

基于RNA序列開發(fā)的EST-SSR分子標(biāo)記中往往存在大量的非有效擴(kuò)增引物，不僅給鑒定造成一定浪費(fèi)，而且影響基因型鑒定的準(zhǔn)確性[6,18-21]。本研究中，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功設(shè)計(jì)出EST-SSR引物19 695對，采用TB-tools批量e-PCR與Primer-blast逐一e-PCR相結(jié)合的方法剔除非有效擴(kuò)增引物14 476對，具體包括無擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期嚴(yán)重不符，物理位置未知、存在其他與目的條帶大小相似的擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增產(chǎn)物無SSR位點(diǎn)等5類。非有效引物的產(chǎn)生原因主要與轉(zhuǎn)錄組組裝錯誤、引物位于剪接位點(diǎn)、擴(kuò)增產(chǎn)物含有大的內(nèi)含子及引物在基因組中存在非唯一結(jié)合位點(diǎn)等有關(guān)[6]。隨機(jī)選擇的50對EST-SSR引物均可擴(kuò)增出清晰目標(biāo)條帶，有效擴(kuò)增率達(dá)100%，遠(yuǎn)高于牡丹（51.50%）[6]、紫楠（43.62%）[18]蘇丹草（76.7%）[19]苔草（74.61%）[20]、芒草（75.30%）[21]等物種；同時，隨機(jī)選擇的非有效引物的PCR驗(yàn)證結(jié)果與ePCR完全一致。說明采用本方法剔除非有效擴(kuò)增引物高效可行，可為其他物種的EST-SSR分子標(biāo)記開發(fā)提供一定借鑒。

轉(zhuǎn)錄組SSR變異與基因功能密切相關(guān)[23-24,30]。CDS區(qū)SSR變異影響蛋白質(zhì)翻譯，直接影響基因功能；5'-UTR為轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控區(qū)，SSR變異間接影響基因活性；3'-UTR區(qū)SSR變異容易引起轉(zhuǎn)錄滑移，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄延伸或提前終止，間接影響基因功能；Intron區(qū)SSR變異可影響mRNA的剪接和外輸，從而影響基因活性和功能[24]。本研究開發(fā)的2 517個EST-SSR標(biāo)記中，SSR序列位于CDS、5'-UTR、3'-UTR和Intron的分別有1 003、328、169和1 017個。GO分類發(fā)現(xiàn)2 170個SSR標(biāo)記所屬的1 902個基因被成功注釋，主要涉及細(xì)胞過程和代謝過程等生物過程，細(xì)胞器及細(xì)胞膜等細(xì)胞組分，結(jié)合及催化活性等分子功能。KEGG注釋發(fā)現(xiàn)包含于471個基因的539個SSR標(biāo)記，存在大量與植物優(yōu)良農(nóng)藝性狀形成密切相關(guān)的基因，如海藻糖磷酸合酶（trehalose phosphate synthases，）[31]、焦磷酸鹽﹕果糖-6-磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶（pyrophosphate: fructose-6- phosphate 1 phosphotransferase，）[32]等高產(chǎn)相關(guān)基因；-呋喃果糖苷酶（-fructofuranosi- dase，）[33]、蔗糖磷酸合酶（sucrose-phosphate synthase，）[34]等品質(zhì)相關(guān)基因；L-抗壞血酸過氧化物酶6（L-ascorbate peroxidase 6，）[35]、多胺氧化酶（polyamine oxidases，）[36]等抗逆相關(guān)基因，是開發(fā)功能標(biāo)記的優(yōu)良資源。

3.3 蘆筍EST-SSR標(biāo)記的通用性

SSR標(biāo)記通常在近緣物種中具有較高的通用性，轉(zhuǎn)移近緣物種的SSR標(biāo)記已成為遺傳信息缺乏物種的一種便捷、高效的分子標(biāo)記開發(fā)方法[6-7,28]。本研究新開發(fā)的蘆筍EST-SSR標(biāo)記在同屬天門冬、文竹和蓬萊松中的通用性分別達(dá)到100.00%、92.00%和88.00%，高于基因組SSR標(biāo)記[16]，類似結(jié)果也在牡丹[6]、開心果[7]和擬輪枝鐮孢菌[28]被發(fā)現(xiàn)。源自基因區(qū)域，保守性高于非編碼區(qū)，是EST-SSR分子標(biāo)記通用性顯著高于基因組SSR標(biāo)記的重要原因[5]。同樣，本研究開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記可用于蘆筍及近緣物種的系統(tǒng)發(fā)育、物種進(jìn)化及親緣關(guān)系等研究。

4 結(jié)論

以蘆筍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定出36 590個SSR位點(diǎn)，非均勻分布于10條染色體，以三核苷酸（46.92%）、二核苷酸（27.18%）和單核苷酸（19.02%）為主要重復(fù)類型，以AG/CT（16.58%）、A/T（16.47%）和AGC/GCT（13.24%）為主要重復(fù)基序。開發(fā)出高信息量的EST-SSR標(biāo)記2 517個，總覆蓋長度1 125.51 Mb，平均密度為2.24個/Mb，有效擴(kuò)增率達(dá)100%，平均多態(tài)性信息含量為0.330。EST-SSR標(biāo)記在天門冬、文竹和蓬萊松中的通用性分別達(dá)到100.00%、92.00%和88.00%，潛在功能涉及產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性形成等多個方面，是開發(fā)功能標(biāo)記的優(yōu)良資源。

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Development and Transferability of EST-SSR Markers Based on Transcriptome Data from

Yi ZeHui, Zhao Jing, Mao LiPing

College of Agriculture, Shanxi Agricultural University/Shanxi Provincial Key Laboratory of Innovation and Utilization of Vegetable and Flower Germplasm Resources, Taiyuan 030031

【Objective】The aim of this study was to clarify the distribution law of SSR loci across the transcriptome of, to develop highly informativeEST-SSR markers and to analyze their transferability, so as to provide the tools for phylogenetic analysis, functional gene mining and molecular marker-assisted breeding of asparagus plants.【Method】Based on the RNA-seq data of 15 asparagus roots obtained from the previous stageby our research group, MISA software was used to retrieve SSR loci,and Primer 3.0 software was employed to design primers in batches. Then, the ineffective primers were eliminated by performing batch e-PCR with TB-tools software and one-to-one e-PCR with the Primer-blast programme.The information of EST-SSR markers (such as gene id, physical location, and potential function) was obtained by comparison with the genome of.The DNA of 9varieties, 7s varieties, 5varieties, and 3varieties were used as templates, and 50 pairs of randomly synthesized primers were used as primers to detect the effectiveness, polymorphism and transferability of the primers developed.【Result】A total of 36 590 simple sequence repeats (SSRs) loci distributed in 30 229 unigenes with a frequency of 4.78% and an average distance of 9.17 kb were identified based on data from 15 root transcriptomes of.The SSRs were unevenly distributed in the 10 chromosomes, with the highest number in chromosome 7 (4 642) and the highest density in chromosome 3 (37.86 SSRs/Mb).The SRRs were distributed from di- to hexa-, with tri- (46.92%) and AG/CT (16.58%) as the most abundant repeat type and predominant repeat motif, respectively. A total of 19 695 pairs of EST-SSR primers weresuccessfullydesigned, and 15 147 pairs ineffective primers were eliminated by e-PCR.Among them, 3 085 pairs ineffective primers didn’t produce any amplification products, 10 102 pairs produced severely inconsistent amplification productsin terms of fragment size, 1 289 pairshad unknown physical positions in the genome, 402 pairs gave other amplification products of similar size to the target fragments, and 269 pairs generated amplification products without SSRs.Based on 2517 EST-SSR markers located in the gene region developed in this study, the chromosome density distribution map was constructed, with a total coverage length of 1125.51 Mb and an average distance of 447.16 kb.The potential functions of these markers were involved in many aspects, such as yield, quality, stress resistance, and so on.All 50 pairs of randomly synthesized primers could amplify target bands clearly, of which 36 pairs were polymorphic, and the average polymorphic information content was 0.330. These markers could be used in three other species of: the transferability to,, andwere 100%, 92%, and 88%, respectively.Cluster analysis based on the EST-SSR alleles grouped the 24 accessions into four clusters that corresponded to the species of,,, and.【Conclusion】In this study, 2517 highly informative EST-SSR markers of asparaguswere successfully developed, and the effective amplification rate was 100%. The total coverage length of the physical map was 1125.51 Mb, and the average distance was 447.16 kb, which could be used for phylogenetic analysis of asparagus and related species. Moreover, it provided a reference for the development of EST-SSR markers in other species.

transcriptome; asparagus; EST-SSR; chromosome density distribution map; functional annotation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.011

2023-04-10；

2023-08-04

山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2022L104）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2020YQ07）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院“雙一流”學(xué)科建設(shè)科研補(bǔ)助項(xiàng)目

通信作者儀澤會，E-mail：yizehui2008bj@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）