馮 嵐，楊小娟，陳 楊，劉宏寶，李 妮

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西 延安 716000；2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西 西安 710038)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率逐年上升，40%的DM患者會(huì)發(fā)展成慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)，DM已經(jīng)成為全球終末期腎病的首要原因[1-2]。目前臨床上判斷CKD進(jìn)展的可靠指標(biāo)包括蛋白尿、血清胱抑素C和估算腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等[3]。全球改善腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)基于eGFR和尿蛋白/肌酐比值(urinary albumin-creatinine ratio，UACR)對(duì)CKD進(jìn)行定義和分期[4]，并得到美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)的認(rèn)可，將符合CKD標(biāo)準(zhǔn)的DM命名為糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)。這為DKD的篩查和檢測(cè)提供了依據(jù)，但是因肌肉質(zhì)量和種族帶來(lái)的估算偏差，其對(duì)DKD進(jìn)展的判斷效果仍有待長(zhǎng)期評(píng)價(jià)[5-6]。

目前DKD的腎臟病理分類(lèi)仍然沿用國(guó)際腎臟病理學(xué)會(huì)的共識(shí)，包括腎小球病變分級(jí)(Ⅰ～Ⅳ級(jí))、間質(zhì)纖維化(interstitial fibrosis，IF)和腎小管萎縮(tubular atrophy，TA)評(píng)分(IFTA，0～3分)、間質(zhì)炎癥評(píng)分(0～2分)、小動(dòng)脈玻璃樣變?cè)u(píng)分(0～2分)和小動(dòng)脈硬化評(píng)分(0～2分)[7]。一直以來(lái)專(zhuān)家們對(duì)于DKD的研究主要集中在腎小球損害，但越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了腎小管間質(zhì)損害在DKD進(jìn)展中的重要性。

Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是經(jīng)典Hippo信號(hào)通路的核心效應(yīng)分子，可被上游機(jī)械信號(hào)(如基質(zhì)硬度增加)激活，促進(jìn)其核移位并激活靶基因，已成為器官纖維化發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵因素，包括腎、肝、肺和心臟組織[8-9]。新近的研究證實(shí)YAP表達(dá)和核移位隨著體外水凝膠硬度的增加而增加，而且DKD大鼠腎臟的YAP表達(dá)顯著高于正常大鼠腎臟[10]。但是迄今為止，尚未見(jiàn)到DKD患者腎臟YAP活化與腎臟纖維化相關(guān)性的報(bào)道。本研究選擇近5年空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診的58例DKD患者，進(jìn)行腎組織YAP染色，評(píng)估其與DKD患者臨床生物標(biāo)記物和病理分類(lèi)的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

回顧空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2017年2月至2022年4月全部行腎活檢的2型DM患者，共有66例患者經(jīng)腎活檢診斷為DKD。其中1例合并IgA腎病、2例合并高血壓腎損害、1例合并原發(fā)性膜性腎病和1例腎小球數(shù)<10個(gè)被排除，剩下的61例患者按KDIGO指南CKD標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，1例CKD 4期和2例CKD 5期的患者因例數(shù)少而被排除。最終58例患者納入本研究，按KDIGO指南CKD的eGFR分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，DKD患者被分為3組：DKD 1期(n=19)、DKD 2期(n=18)和DKD 3期(n=21)。另選擇8例接受腎腫瘤切除術(shù)的患者作為對(duì)照(對(duì)照組)，均無(wú)高血壓、DM、心血管疾病或急慢性腎臟疾病病史。該研究根據(jù)赫爾辛基宣言進(jìn)行，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：K202211-30)，并征得每個(gè)受試者的書(shū)面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料獲取 由唐都醫(yī)院CKD管理中心護(hù)士調(diào)取DKD患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室資料，包括年齡、性別、血壓、DM史、24 h尿蛋白(24 h urine protein，24 hUP)、UACR、eGFR、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素C、血清白蛋白(albumin，ALB)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C，HbA1c)等。eGFR通過(guò)CKD-EPI方程計(jì)算[11]。另由2名主治醫(yī)生對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行核對(duì)并最終確認(rèn)準(zhǔn)確性和合理性。

1.2.2 病理資料獲取 根據(jù)病歷調(diào)取受試病理報(bào)告，使用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)腎標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估。按照國(guó)際腎臟病理學(xué)會(huì)的共識(shí)進(jìn)行腎臟病理分類(lèi)和評(píng)分[7]。包括：①腎小球病變分級(jí)(Ⅰ～Ⅳ級(jí))：Ⅰ級(jí)，基底膜增厚；Ⅱ級(jí)，輕度系膜增生>25%(Ⅱa)和重度系膜增生>25 %(Ⅱb)；Ⅲ級(jí)，結(jié)節(jié)硬化(至少一個(gè)KW結(jié)節(jié))；Ⅳ級(jí)：全球硬化>50%。②IFTA評(píng)分(0～3分)：0分，IF和TA無(wú)受累；1分，IF和TA受累面積<25%；2分，IF和TA受累面積為25%～50%；3分，IF和TA受累面積>50%。③間質(zhì)炎癥評(píng)分(0～2分)：0分，無(wú)；1分，IFTA區(qū)域存在炎癥；2分，IFTA區(qū)域以外存在炎癥。④小動(dòng)脈玻璃樣變?cè)u(píng)分(0～2分)：0分，無(wú)；1分，1個(gè)；2分，≥2個(gè)。⑤小動(dòng)脈硬化評(píng)分(0～2分)：0分，無(wú)；1分，內(nèi)膜增厚但未超過(guò)中膜厚度；2分，內(nèi)膜增厚并超過(guò)中膜厚度。

1.2.3 YAP的免疫熒光染色 對(duì)58例腎活檢組織石蠟塊和8例切除腎的癌旁正常腎組織進(jìn)行4 μm厚切片，進(jìn)行免疫熒光染色。石蠟切片脫蠟至水，用EDTA抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)，然后用30 mL/L胎牛血清密封，并與YAP(#14074，Cell Signaling Technology，MA，美國(guó))抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后，切片與FITC標(biāo)記的二抗(GB22303，Servicebio，中國(guó))孵育。并用DAPI(G1012，Servicebio，中國(guó))進(jìn)行細(xì)胞核染色。使用Leica DM2500顯微鏡(Leica Microsystems，德國(guó))，以盲法為每個(gè)切片隨機(jī)拍攝20幅圖像(400倍)，通過(guò)Image-ProPlus V.6.0(Media Controbernetics，Bethesda，MD，美國(guó))進(jìn)行量化。

2 結(jié)果

2.1 DKD不同臨床分期患者臨床資料的比較

在58例DKD患者中，38例為男性，20例為女性，腎活檢時(shí)年齡為(52.9±11.8)歲。除了HbA1c和FBG之外(P<0.01)，DKD 1期的各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示，DKD 1期患者比DKD 2期(P<0.01)和DKD 3期(P<0.01)患者更年輕且DM病程更短。與DKD 1期相比，DKD 2期患者的Scr(P<0.01)、24 h UP(P<0.05)和UACR(P<0.05)升高，ALB(P<0.05)和eGFR(P<0.01)降低，但是FBG和HbA1c在二者之間未見(jiàn)顯著性差異。DKD 3期患者比DKD 2期患者的Scr(P<0.01)和胱抑素C(P<0.01)升高，eGFR降低(P<0.01)，但是其他指標(biāo)在兩組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與DKD 1期相比，DKD 3期患者的Scr(P<0.01)、BUN(P<0.01)、胱抑素C(P<0.01)和24h UP(P<0.05)水平更高，ALB(P<0.01)和eGFR(P<0.01)水平更低，其他指標(biāo)在兩組之間未見(jiàn)顯著性差異(表1)。

表1 對(duì)照組和DKD患者臨床資料比較

2.2 DKD不同臨床分期患者病理分類(lèi)的比較

DKD患者的病理分類(lèi)數(shù)據(jù)顯示，關(guān)于腎小球損傷，DKD 2期和DKD 3期患者的全球硬化比率高于DKD 1期患者(P<0.05)，但是腎小球病變分級(jí)在3組之間未見(jiàn)顯著性差異。DKD患者均出現(xiàn)明顯的腎小管間質(zhì)損傷，分別有36.8%的DKD 1期、55.6%的DKD 2期和71.4%的DKD 3期患者的IFTA評(píng)分為3分，DKD 3期患者的IFTA評(píng)分顯著高于DKD 1期的患者(P<0.05)。IFTA評(píng)分中，TA受累范圍在DKD 1期和DKD 2期患者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均低于DKD 3期患者；IF受累范圍在DKD 2期和DKD 3期之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均高于DKD 1期患者(P<0.05，P<0.01)。此外，DKD 3期患者的炎癥評(píng)分(P<0.05)和小動(dòng)脈玻璃樣變?cè)u(píng)分(P<0.01)均顯著高于DKD 1期，DKD 2期患者的小動(dòng)脈硬化評(píng)分顯著高于DKD 1期患者(P<0.05，表2)。

表2 DKD患者腎臟病理資料的比較

2.3 DKD患者腎組織中YAP的活化

DKD 1期和對(duì)照組患者之間腎臟YAP的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與DKD 1期患者相比，DKD 2期患者腎小管上皮細(xì)胞中YAP表達(dá)增加(P<0.01)，且主要分布于細(xì)胞質(zhì)。但是與DKD 2期患者相比，DKD 3期患者腎臟中出現(xiàn)更高的YAP表達(dá)和核移位(P<0.01)。重要的是，腎臟YAP表達(dá)呈現(xiàn)DKD分期依賴(lài)性的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)增加(圖1)。

A：YAP在對(duì)照組和DKD患者腎石蠟切片中的表達(dá)，用共聚焦掃描顯微鏡拍攝；B：用ImageJ對(duì)YAP的相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量并分析。YAP：Yes相關(guān)蛋白；DKD：糖尿病腎臟病。標(biāo)尺為200 μm。 bP<0.01。圖1 對(duì)照組和DKD患者腎小管上皮細(xì)胞中的YAP表達(dá)

2.4 DKD患者腎組織YAP水平與臨床資料的相關(guān)性

DKD患者腎組織YAP水平與臨床資料的相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表3)，YAP水平與eGFR呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.854，P<0.01)，與Scr(r=0.849，P<0.01)、胱抑素C(r=0.717，P<0.01)呈高度正相關(guān)。類(lèi)似地，eGFR與Scr(r=-0.884，P<0.01)、胱抑素C(r=-0.753，P<0.01)呈高度負(fù)相關(guān)。

表3 DKD患者eGFR水平和腎組織YAP水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 DKD患者腎組織YAP水平與病理分類(lèi)的相關(guān)性

DKD患者腎組織YAP水平與病理分類(lèi)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表4)，腎組織YAP表達(dá)與IF受累范圍(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范圍(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA評(píng)分(r=0.522vsr=-0.377)的相關(guān)性顯著優(yōu)于eGFR水平。腎小球病理分級(jí)、全球硬化比率、炎癥評(píng)分、小動(dòng)脈玻璃樣變?cè)u(píng)分和小動(dòng)脈硬化評(píng)分與YAP和eGFR的相關(guān)系數(shù)∣r∣均<0.4。因此我們認(rèn)為與DKD患者eGFR顯著相關(guān)的是腎小管間質(zhì)損傷而不是腎小球病變，腎臟中YAP水平與eGFR下降具有明顯相關(guān)性，在腎小管間質(zhì)纖維化評(píng)估方面優(yōu)于eGFR水平。

表4 DKD患者eGFR水平和腎組織YAP水平與臨床指標(biāo)和病理分類(lèi)的相關(guān)性

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明腎臟間質(zhì)纖維化在DKD發(fā)生發(fā)展中的作用[1]。在不同臟器損傷的纖維化中顯示了Hippo-YAP信號(hào)通路的作用[12-16]，但是臨床上尚未見(jiàn)到腎臟YAP水平在DKD患者進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)方面的報(bào)道。我們團(tuán)隊(duì)新近在DKD大鼠模型中證實(shí)了腎臟YAP的活化與腎臟纖維化密切相關(guān)[10]。本研究進(jìn)一步在DKD患者腎組織中評(píng)價(jià)了腎臟YAP水平與DKD進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)和腎臟纖維化程度的相關(guān)性，主要包括以下亮點(diǎn)：①隨著KDIGO指南CKD分期進(jìn)展，DKD患者腎臟YAP水平呈CKD臨床分期依賴(lài)性地點(diǎn)對(duì)點(diǎn)增加；②YAP水平與TA/腎臟纖維化病理分級(jí)的相關(guān)性顯著優(yōu)于eGFR。

YAP是經(jīng)典Hippo信號(hào)通路的下游效應(yīng)器，在急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)和CKD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12，17]。研究顯示YAP的功能依賴(lài)于其活化的時(shí)間[16]。在AKI中，YAP的激活促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡作用，但是YAP長(zhǎng)期過(guò)度活化導(dǎo)致細(xì)胞去分化，從而促進(jìn)纖維化進(jìn)展[18]。在應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期病理刺激(如高血糖癥)時(shí)，Hippo途徑的失活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子YAP去磷酸化，從而驅(qū)動(dòng)YAP的核轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子(TEAD 1-4)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致腎臟適應(yīng)性不良修復(fù)和纖維化[8]。YAP的藥理學(xué)和遺傳學(xué)抑制可以逆轉(zhuǎn)成纖維細(xì)胞活化和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而延緩腎小管IF[19-22]。本研究證實(shí)了DKD患者腎臟YAP表達(dá)和核移位隨著CKD分期加重而增加，且與eGFR水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與Scr和胱抑素C呈正相關(guān)，提示YAP在DKD進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)中的作用。

目前臨床上DKD患者行腎活檢僅限于非典型表現(xiàn)者，因此一般選擇功能學(xué)改變(eGFR和UACR)來(lái)判斷患者進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。行腎活檢DKD患者，其病理分類(lèi)仍然沿用國(guó)際腎臟病理學(xué)會(huì)的共識(shí)，包括腎小球病變分級(jí)、IFTA評(píng)分、間質(zhì)炎癥評(píng)分、小動(dòng)脈玻璃樣變?cè)u(píng)分和小動(dòng)脈硬化評(píng)分。相對(duì)嚴(yán)重的腎小球疾病腎活檢標(biāo)本中，腎小球硬化(glomerulosclerosis，GS)和IFTA與eGFR相關(guān)[23-25]。新近研究顯示當(dāng)eGFR>60(mL·min-1·1.73 m-2)時(shí)，eGFR與GS和IFTA的相關(guān)性較弱[26]，而在eGFR>30 (mL·min-1·1.73 m-2)的DKD人群中本研究得到了相似結(jié)論。本研究中，即使處于CKD 1期和CKD 2期，也有36.8%～55.6%的DKD患者的IFTA評(píng)分為3分，提示了腎小管間質(zhì)損害在DKD中的重要性。并且無(wú)論是eGFR，還是腎組織YAP水平，均顯示與腎小球病變(腎小球病變分級(jí)和全球硬化比率)較弱的相關(guān)性。此外在腎小管損傷方面，YAP水平與腎小管間質(zhì)損傷，包括IF受累范圍(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范圍(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA評(píng)分(r=0.522vsr=-0.377)的相關(guān)性明顯優(yōu)于eGFR，這進(jìn)一步提示腎組織YAP水平在預(yù)測(cè)腎纖維化中的作用。

本研究尚存在一定局限性，本研究為單中心設(shè)計(jì)，樣本量有限。最重要的是，所選病例均是存在不典型癥狀的腎活檢DKD患者，他們大多數(shù)存在尿蛋白快速增加或腎病綜合征表現(xiàn)，因此我們不能確定未經(jīng)腎活檢的DKD患者YAP水平與eGFR等臨床分級(jí)和IFTA等病理分級(jí)的相關(guān)性是否與本研究的結(jié)論一致，因此開(kāi)發(fā)Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)的血/尿生物學(xué)標(biāo)志物在臨床上更適用于未經(jīng)腎活檢的DKD患者的評(píng)估。此外，因?yàn)樗x病例為近5年的DKD患者，尚缺乏YAP對(duì)DKD患者長(zhǎng)期預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的數(shù)據(jù)。因此，對(duì)患者長(zhǎng)期隨訪，并觀察YAP水平與每年eGFR下降率、終末期腎臟病的發(fā)生和是否死亡等指標(biāo)的相關(guān)性，有益于進(jìn)一步判斷其在DKD患者預(yù)后中的預(yù)測(cè)價(jià)值。

總之，本研究在經(jīng)腎活檢的DKD患者中證實(shí)，YAP水平顯著關(guān)聯(lián)eGFR，其與腎小管間質(zhì)損害的關(guān)聯(lián)性?xún)?yōu)于eGFR，提示DKD患者腎小管結(jié)構(gòu)性損傷早于eGFR預(yù)測(cè)，YAP的組織學(xué)分析可能是DKD腎臟纖維化評(píng)估的一種補(bǔ)充方法，有待進(jìn)一步研究。