董瑞娜，王炳坤，呂雅潔，曹天宇，張衍國

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710038)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)是血管管腔內(nèi)側(cè)的單層細(xì)胞，可以感受血液中的信號并及時(shí)做出反應(yīng)。同時(shí)VECs在血管生成、血管內(nèi)外物質(zhì)交換和凝血等方面都扮演著重要角色[1]。不同解剖部位VECs在結(jié)構(gòu)和功能上存在明顯異質(zhì)性[2]。例如，在結(jié)構(gòu)上，大腦血管中連接緊密的內(nèi)皮細(xì)胞有助于血腦屏障的形成，而不連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞排列則構(gòu)成肝臟的竇狀結(jié)構(gòu)以促進(jìn)物質(zhì)交換[1]。在功能上，免疫方面，皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)高表達(dá)免疫相關(guān)分子人類白細(xì)胞抗原-Ⅱ(human leukocyte antigen-Ⅱ，HLA-Ⅱ)，可作為非專職型抗原呈遞細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答[3]；而肝竇VECs高表達(dá)清道夫受體，使其具有更強(qiáng)的內(nèi)吞活性[4]，可吞噬血液中的脂質(zhì)和可溶性抗原等[5]，促進(jìn)炎癥信號的傳導(dǎo)。在代謝方面，真皮、肝臟和胃腸道VECs多傾向于氧化磷酸化途徑，而糖異生途徑在大腦和子宮VECs中更為活躍。通過RNA測序分析，證實(shí)了哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞之間存在明顯的器官差異性[6]。因此，要準(zhǔn)確反映疾病特征，應(yīng)針對性培養(yǎng)相應(yīng)部位的VECs，就皮膚疾病而言，應(yīng)獲取皮損部位的原代MVECs進(jìn)行培養(yǎng)。

許多皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展與血管關(guān)系密切，如銀屑病、毛細(xì)血管瘤、硬皮病、瘢痕疙瘩等[7-10]。但目前，原代MVECs較難分離、純化困難且易伴隨其他細(xì)胞污染，對皮膚疾病發(fā)病機(jī)制的研究造成一定阻礙。因此，本文結(jié)合我們自身實(shí)踐，對當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道的真皮MVECs的分離、純化與鑒定方法以及其優(yōu)缺點(diǎn)等內(nèi)容進(jìn)行總結(jié)，旨在為讀者選擇合適的方法提供參考。

1 真皮MVECs的分離

1.1 組織塊貼壁法

使用組織塊貼壁法培養(yǎng)人真皮MVECs的具體方法為：真表皮分離后，將修剪成合適大小的組織塊貼附于預(yù)先用培養(yǎng)基濕潤的培養(yǎng)皿中，于細(xì)胞孵箱靜置數(shù)小時(shí)后加入培養(yǎng)液，待組織塊周邊有細(xì)胞游離爬出后將組織塊去除[11]。

該方法經(jīng)濟(jì)且易操作，但因真皮組織中成纖維細(xì)胞為優(yōu)勢細(xì)胞，易于生長，會(huì)對MVECs的生長產(chǎn)生抑制作用，易造成培養(yǎng)過程中大量成纖維細(xì)胞污染。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，爬出的大部分細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，MVECs很難爬出，考慮可能與其位于血管管腔內(nèi)側(cè)，難以貼壁有關(guān)。

1.2 機(jī)械按壓法

將真表皮分離后使用器械的彎曲部分對真皮施加壓力并向組織塊外側(cè)反復(fù)擠壓，將MVECs壓出，收集細(xì)胞懸液離心并將目的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中[9，12-16]。

通常認(rèn)為該法不易發(fā)生成纖維細(xì)胞污染，但在提取正常組織或瘢痕疙瘩MVECs的實(shí)驗(yàn)操作中，我們發(fā)現(xiàn)此方法操作難度大且效率低下?？赡苁且?yàn)椋孩僖蚪M織細(xì)胞外基質(zhì)較為緊密，單純靠擠壓組織中的血管內(nèi)膜獲取MVECs具有一定難度；②操作敏感度較高，不易保持恒定的按壓力度，壓力過大可能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞污染，壓力過小則難以提取真皮MVECs。因組織來源不同以及操作者個(gè)體差異，對力度的把握尚需多次嘗試。

1.3 酶消化法

1.3.1 組織塊酶消化法 應(yīng)用酶制劑降解細(xì)胞外基質(zhì)，使組織分散為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊，通過濾器或?yàn)V網(wǎng)收集細(xì)胞懸液，離心后獲取原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

目前分離真皮MVECs需使用的酶制劑包括：分離酶Ⅱ、胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶，脫氧核糖核酸酶Ⅰ等。其中分離酶Ⅱ可通過降解基底膜上的半橋粒對真表皮進(jìn)行分離；胰蛋白酶可作用于賴氨酸或精氨酸殘基處的羧基從而使細(xì)胞分離；膠原酶可水解結(jié)締組織中的膠原蛋白；透明質(zhì)酸酶可分解細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸；脫氧核糖核酸酶用于降解死細(xì)胞釋放的DNA(DNA會(huì)促使細(xì)胞凝集，從而使細(xì)胞懸液過于黏稠)。通過聯(lián)合使用上述酶制劑可將MVECs從組織中分離。

另外，部分實(shí)驗(yàn)室使用皮膚解離試劑盒獲取MVECs原代細(xì)胞[17-19]。該試劑盒含有酶A、D、P，可將修剪后的人全層皮膚解離為單細(xì)胞懸液，后通過解離器將單細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)中釋放出來。

1.3.2 勻漿與酶聯(lián)合法 該方法與組織塊酶消化法類似，即先進(jìn)行真表皮分離，后將真皮仔細(xì)剪碎呈勻漿狀再進(jìn)行酶消化。因組織與酶制劑的接觸面積增大，消化更為充分[3]。

酶消化法操作簡單，較為經(jīng)濟(jì)且所用酶制劑方便易得。但仍存在以下缺點(diǎn)：①純化工作量大；只可獲得混雜的皮膚組織來源細(xì)胞，無法直接獲得目的細(xì)胞，需要配合大量的后期純化工作；②干擾因素較多；消化時(shí)間長短、酶濃度高低等均可能對細(xì)胞的活力造成影響。因此，掌握酶聯(lián)合制劑的用法以及消化時(shí)長是很有必要的。下面將列舉部分酶聯(lián)合制劑的使用方法(表1)。

表1 不同酶消化法的操作條件

通過對以上三種方法的分析并結(jié)合自身實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)為組織貼壁法細(xì)胞爬出時(shí)間較長(2周左右)，其次爬出的細(xì)胞大多以梭形的成纖維細(xì)胞為主，鵝卵石樣MVECs少見，且此法更常用于成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。同時(shí)，機(jī)械按壓法成功概率較低，首先因細(xì)胞外基質(zhì)的存在，僅靠外力很難使MVECs脫落下來，其次從脫落的絮狀組織中爬出的多為成纖維細(xì)胞。因此我們更推薦酶消化法，此法操作簡單，細(xì)胞外基質(zhì)混雜較少，可以高效地使MVECs從組織中釋放出來，具有良好應(yīng)用前景。上述三種分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

表2 不同MVECs分離方法比較

1.4 其他注意事項(xiàng)

1.4.1 組織樣本處理 ①供體年齡不宜過大。衰老會(huì)影響血管生成能力，年輕供體的細(xì)胞增殖活力相對較強(qiáng)[28]。②組織應(yīng)盡量新鮮。細(xì)胞活力關(guān)系著培養(yǎng)成功與否，因此原代提取應(yīng)盡可能快速，以減少因環(huán)境變化引起的細(xì)胞損傷[29]。③組織樣本嚴(yán)格處理，原代提取無菌操作。對于組織預(yù)處理中使用750 mL/L乙醇進(jìn)行消毒的做法，目前存在爭議，因750 mL/L乙醇會(huì)使組織脫水，處理過久可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。因此，樣本不可在750 mL/L乙醇中浸泡過久，可短時(shí)間浸入750 mL/L乙醇后使用大量平衡鹽溶液多次沖洗。④保存組織樣本以及原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需添加抗菌素。大部分文獻(xiàn)提出通過青霉素、鏈霉素、慶大霉素和抗真菌劑(兩性霉素B)等聯(lián)合使用以抑制細(xì)菌或真菌的產(chǎn)生。

1.4.2 細(xì)胞提取操作細(xì)節(jié) ①剔除脂肪等皮下組織，減少混雜細(xì)胞。②確保真表皮充分分離，其方式包括分離酶Ⅱ消化與表皮切除兩種。我們結(jié)合自身實(shí)踐認(rèn)為，方法的選用需視皮膚狀態(tài)而定。若以真皮增厚為主要表現(xiàn)的疾病如瘢痕疙瘩等，切除表皮用時(shí)短且可避免酶對細(xì)胞的損傷，細(xì)胞活性較好。對于正常皮膚或非真皮層增生疾病，切除難度較大，更推薦采用分離酶Ⅱ進(jìn)行處理，消化時(shí)長不得超過15 h[9]。③修剪組織盡可能小，以便增加細(xì)胞提取率和酶作用效果(按壓法除外，組織塊過小會(huì)增加按壓難度)。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng) ①在細(xì)胞爬出的過程中，可采取半換液的方式進(jìn)行培養(yǎng)。②MVECs與成纖維細(xì)胞有明顯區(qū)別。MVECs原代培養(yǎng)會(huì)形成呈同心圓狀獨(dú)立生長的細(xì)胞島。文獻(xiàn)中認(rèn)為可通過換液時(shí)于顯微鏡下抽吸成纖維細(xì)胞將其去除[16]，但實(shí)際操作方面存在難度。

2 真皮MVECs的純化

在MVECs的分離過程中會(huì)摻雜其他細(xì)胞，其中以成纖維細(xì)胞為主，可對MVECs生長產(chǎn)生一定的抑制作用[16]。因此，純化是獲得MVECs極為關(guān)鍵的一項(xiàng)步驟。

2.1 差異胰蛋白酶消化

基于不同細(xì)胞貼壁能力的差異，該方法通過控制胰蛋白酶消化時(shí)長，使貼壁能力弱的細(xì)胞懸浮，從而實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞的分離[11，30]。原代培養(yǎng)5～7 d后，存在生長優(yōu)勢的成纖維細(xì)胞與MVECs競爭生長[9]，此時(shí)為采用本方法去除成纖維細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)。

此方法經(jīng)濟(jì)且簡單易行，但尚存在以下不足：①獲得的細(xì)胞純度不高。單純依賴貼壁能力差異純化MVECs，難免會(huì)存在其他細(xì)胞污染，無法達(dá)到研究所需的細(xì)胞純度。②需要連續(xù)傳代提高細(xì)胞純度。TSOU等[8]對原代培養(yǎng)的硬皮病MVECs進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在P7時(shí)許多細(xì)胞出現(xiàn)衰老跡象。因此對于原代細(xì)胞，P2～P6為開展實(shí)驗(yàn)的最佳選擇。但在純化過程中，連續(xù)的消化傳代易錯(cuò)過細(xì)胞的最佳使用時(shí)機(jī)。③純化效率受外界因素影響較大。酶濃度、消化時(shí)長、外界環(huán)境溫度、細(xì)胞活力等均可影響純化MVECs的效率。若酶濃度過高可對細(xì)胞造成損傷，消化時(shí)間不當(dāng)可導(dǎo)致其他細(xì)胞混雜，且外界溫度、細(xì)胞活力可影響酶消化細(xì)胞的時(shí)長。

2.2 流式細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)

FACS采用熒光素標(biāo)記不同分子[31]，通過精確的熒光過濾器和探測器，對混合細(xì)胞群中的細(xì)胞進(jìn)行分類[32]。

FACS獲得的細(xì)胞純度高，可以同時(shí)分選存在多種表面標(biāo)志的細(xì)胞且不影響細(xì)胞活力[33]，但也存在不足：①儀器價(jià)格昂貴；②儀器操作技術(shù)敏感性較高；③存在易發(fā)生交叉污染(其他細(xì)胞或細(xì)菌的污染)、噴嘴堵塞(細(xì)胞團(tuán)塊堵塞噴嘴)和試劑消耗量較大等情況[31]。

2.3 免疫磁珠分選(magnet-activated cell sorting，MACS)

多數(shù)文獻(xiàn)采用MACS對MVECs進(jìn)行純化[3，9，13-14，16-17，19，34-35]。MACS基于抗原抗體特異性識別的原理，使用高度特異性單克隆抗體偶聯(lián)的納米級磁化微粒對目的細(xì)胞進(jìn)行特異性的磁性標(biāo)記，通過高強(qiáng)度磁場分選進(jìn)而達(dá)到分離所需細(xì)胞的目的[31]。通常需要分別進(jìn)行一次CD31正篩選(VECs的表面標(biāo)志)[36]和CD45-負(fù)篩選(剔除CD31+的免疫細(xì)胞)以獲得高純度的MVECs[37]。

MACS分選的細(xì)胞純度較高，設(shè)備簡單，耗時(shí)短且效率高。小的磁珠一般不影響細(xì)胞的光散射特性以及熒光抗體對細(xì)胞的標(biāo)記，因此無需解離磁珠便可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。但此方法存在以下缺點(diǎn)：①成本較高。不能在普通試管中進(jìn)行，需配備一次性分離柱。②一次只能進(jìn)行一種細(xì)胞標(biāo)志的分選，不可同時(shí)進(jìn)行多種標(biāo)志的篩選。③磁珠可能存在細(xì)胞毒性。研究表明，細(xì)胞與高濃度的磁珠長時(shí)間接觸后，被吞噬的磁珠在胞內(nèi)聚集，影響細(xì)胞的正常生理功能[38]。此外，胞內(nèi)磁珠刺激細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，高ROS水平可氧化細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、破壞DNA并影響基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞生理功能下降甚至細(xì)胞死亡[39-40]。

在MACS中，需注意：①內(nèi)皮細(xì)胞與免疫磁珠的比例為關(guān)鍵參數(shù)[16]。因成纖維細(xì)胞可吞噬磁珠[38]，若磁珠數(shù)量過少，會(huì)導(dǎo)致部分MVECs丟失；若磁珠數(shù)量過高，會(huì)阻礙純化后期MVECs的生長，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞占比增加，因此需要正確計(jì)算磁珠的需要量。所需磁珠數(shù)目可根據(jù)培養(yǎng)中成纖維細(xì)胞的比例進(jìn)行計(jì)算。若出現(xiàn)較多的MVECs群，可考慮磁珠與細(xì)胞數(shù)目之比為1∶1；若成纖維細(xì)胞更多，可調(diào)整磁珠數(shù)量與細(xì)胞比例為1∶2～1∶4。②可在磁珠分選前進(jìn)行兩次差異分選，提前篩去部分成纖維細(xì)胞，以提高M(jìn)VECs純度[16]。上述三種純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 VECs純化方法優(yōu)缺點(diǎn)

細(xì)胞純化是完成分離后的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。純化方法的選擇受分離方式的影響，若選擇酶消化法進(jìn)行分離，在純化環(huán)節(jié)可選擇免疫磁珠或FACS。因?yàn)榉蛛x中存在大量真皮來源的其他細(xì)胞干擾，單純通過差異胰蛋白酶消化法難以達(dá)到目標(biāo)純度。MACS也可用作FACS前的預(yù)分離，以減少FACS所用時(shí)間[3]。若采用機(jī)械按壓法進(jìn)行分離，純化方法可選擇差異胰蛋白酶消化法，MACS為備選方案[9]。

3 VECs的鑒定

3.1 形態(tài)學(xué)

3.1.1 光學(xué)顯微鏡觀察 60 h內(nèi)可見貼壁細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加，細(xì)胞多呈短梭形。3～4 d細(xì)胞形態(tài)拉長呈“紡錘形”。6～10 d細(xì)胞密集，呈典型單層“鋪路石樣”[34，41]。

3.1.2 電鏡觀察 MVECs細(xì)胞內(nèi)可見Weibel-Palade小體[34，42]，胞質(zhì)內(nèi)富含線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、發(fā)育完好的高爾基復(fù)合體，細(xì)胞表面存在鋸齒狀橋粒。

3.2 細(xì)胞標(biāo)志

3.2.1 血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31) CD31是MVECs上表達(dá)最豐富的跨膜糖蛋白，與白細(xì)胞運(yùn)輸、機(jī)械力傳導(dǎo)和血管通透性有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)CD31抗體可抑制小鼠腫瘤內(nèi)部的血管生成，可見CD31對血管的形成必不可少。CD31主要分布于細(xì)胞連接深處，但其分子定位處于動(dòng)態(tài)變化之中，其在胞膜上的分布不僅與細(xì)胞骨架重排有關(guān)，同時(shí)受細(xì)胞膜微域的影響。CD31是最敏感的內(nèi)皮標(biāo)記物[43]，常被用于血管定位或鑒定。

3.2.2 von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF) vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種多聚糖蛋白，在止血、血管壁穩(wěn)態(tài)和損傷后修復(fù)中扮演著重要角色。當(dāng)內(nèi)皮損傷或受到刺激時(shí)，vWF從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放，沉積于血管的受損部位，導(dǎo)致局部血小板聚集[44]。vWF主要儲(chǔ)存于胞質(zhì)的Weibel-Palade小體中。自從1972年HOYER等在VECs中發(fā)現(xiàn)vWF后，因其具有高度的敏感度和良好的特異度，常被用作MVECs標(biāo)志物[45]。

3.2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(VE-cadherin，CD144) VE-Cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的主要蛋白，不僅維持著血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性，還調(diào)控著內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育與生長。其主要分布在內(nèi)皮之間的黏附連接處[46]。VE-Cadherin僅在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，因此是內(nèi)皮細(xì)胞最特異的標(biāo)志物之一[47]。

3.2.4 CD34 CD34是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白[48]，在細(xì)胞間黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[37]。CD34起初被視為造血干細(xì)胞的標(biāo)志，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)其可表達(dá)于早期VECs，其主要見于外周循環(huán)的血管腔內(nèi)膜和血管出芽端的細(xì)胞外膜上[49]，少部分存在于未參與循環(huán)的小血管內(nèi)膜，可作為內(nèi)皮標(biāo)記物之一[50]。但在體外培養(yǎng)中，因細(xì)胞接觸以及外部環(huán)境影響，MVECs可能丟失這一標(biāo)志物[8]。

3.2.5 內(nèi)皮糖蛋白(CD105) CD105是一種同源二聚體跨膜糖蛋白，對血管生成至關(guān)重要，例如CD105基因敲除小鼠，因血管生成缺陷在子宮內(nèi)便死亡[34，51]。CD105在增殖活躍的內(nèi)皮細(xì)胞上高度表達(dá)，可作為MVEVs的一種標(biāo)志物[52]。

3.2.6 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(CD143) CD143作為一種胞外糖蛋白，存在于內(nèi)皮細(xì)胞的管腔面。與正常內(nèi)皮細(xì)胞相比，出芽VECs中CD143表達(dá)顯著下調(diào)[53]。因此CD143低表達(dá)可作為新血管形成過程中內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物[54-55]。

上述六種分子均為VECs標(biāo)記物，但在相關(guān)文獻(xiàn)中，多采用CD31與vWF進(jìn)行MVECs鑒定。若在純化方法中，選擇免疫磁珠或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面標(biāo)志物的分選，可忽略鑒定部分直接進(jìn)行后續(xù)操作。

4 結(jié)束語

不同組織來源的VECs之間存在差異。因此要反映疾病特征，應(yīng)獲取相應(yīng)部位的MVECs進(jìn)行研究。本文通過對原代MVECs的分離、純化與鑒定方法的分析，希望尋找一種能夠快速獲得高質(zhì)量、高純度的原始病理狀態(tài)下MVECs的方法，從而明確不同疾病下的細(xì)胞功能，增進(jìn)對疾病發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程的了解與認(rèn)識，為疾病的治療和預(yù)防提供更加直觀的新思路和新見解。