楊 楠 洪玉燕 潘夢(mèng)婷 許 文 徐惠龍 范世明

三葉青(Tetrastigmahemsleyanum.Diels et Gilg)為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤,別名金線吊葫蘆、石猴子等[1],即福建、浙江習(xí)用傳統(tǒng)中藥“一粒珠”[2],也是福建省特色畬藥[3]。三葉青含有酚酸類、黃酮類等成分,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[4,5]。三葉青藥用價(jià)值高,其塊根市場(chǎng)供不應(yīng)求,其葉產(chǎn)量較為穩(wěn)定,但不同采收期對(duì)其活性成分累積影響較大。研究不同采收期對(duì)明確三葉青葉中有效成分的變化規(guī)律具有重要意義。目前三葉青采收期研究主要集中在塊根,且1～4月均可采收[6]。本研究建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定三葉青葉中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷、綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸的含量。以有效成分與生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法對(duì)不同采收期的三葉青葉進(jìn)行評(píng)估,為三葉青葉質(zhì)量評(píng)價(jià)和開發(fā)利用研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),Xevo TQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司),CPA225D型半微量天平(德國(guó)Sartorius公司),BSA224S萬(wàn)分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),KQ-500E臺(tái)式超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),FY135型中藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司),HC-2068高速離心機(jī)(安徽中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料本研究樣品采自福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園,由福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的葉片。對(duì)照品牡荊苷(MUST-16030811)、異牡荊苷(MUST-15071112)、葒草苷(MUST-13070502)、異葒草苷(MUST-13100902)購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司,牡荊素鼠李糖苷(Y130506)、異牡荊素鼠李糖苷(64820991)、葒草素鼠李糖苷(44257931)、異葒草素鼠李糖苷(50993776)、綠原酸(327979)、新綠原酸(906332)、隱綠原酸(905997)購(gòu)于北京賽百草科技有限公司。內(nèi)標(biāo)甘草苷(MUST-14100910)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純);其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱:Waters CORTECS?UPLC?C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脫(0～0.5 min,A=5%;0.5～1.5 min,5%A→9%A;1.5～4.5 min,9%A→11%A;4.5～6.5 min,11%A→12.5%A;6.5～9.6 min,A=12.5%;9.6～10.4 min,12.5%A→20%A;10.4～10.5 min,20%A→5%A;10.5～12 min,A=5%);進(jìn)樣量:2 μl;流速:0.25 ml/min;柱溫:45 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件電噴霧正負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓3.5 kV(正離子模式)和2.5 kV(負(fù)離子模式);脫溶劑氣流(氮?dú)?流速800 L·Hr-1;脫溶劑溫度500 ℃;離子源溫度150 ℃;錐孔氣流(氮?dú)?流速50 L·h-1;二級(jí)錐孔萃取電壓:3.00 V;停留時(shí)間:5 ms;碰撞氣體氬氣;載氣:氮?dú)?。采用MRM定量模式,11種分析物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1。

表1 11個(gè)成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜測(cè)定條件

2.3 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取牡荊苷、異牡荊苷、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對(duì)照品適量,用甲醇制成濃度約為1.259、0.985、1.468、0.966、0.879、0.942、0.886、1.251、0.752、0.794、1.510 mg/ml的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液,其他不同濃度對(duì)照品溶液由10%甲醇稀釋得到,內(nèi)標(biāo)液為甘草苷(100 ng/ml)。

2.4 供試品溶液的制備將三葉青葉粉碎,過(guò)40目篩,精密稱取0.1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml,密塞,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率50 kHz)提取30 min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,取適量提取液12 000 r/min離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,濾液為樣品溶液和內(nèi)標(biāo)液按1∶9(100 μl∶900 μl)混合均勻進(jìn)行測(cè)定。

2.5 熵權(quán)TOPSIS法模型的建立建立原始評(píng)價(jià)矩陣:以三葉青中酚酸類成分含量、黃酮類成分含量、生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo),原始矩陣公式為:

A=(χij)m×n

(1)

χij為第j個(gè)指標(biāo)下第i個(gè)項(xiàng)目的評(píng)價(jià)值,m為采收月份(m=12),n為評(píng)價(jià)指標(biāo)(n=3)。2)建立標(biāo)準(zhǔn)歸一化決策矩陣:本研究中的3個(gè)指標(biāo)均為正向化指標(biāo),但各指標(biāo)量綱不一,需進(jìn)行歸一化處理,公式為:

(2)

3)熵權(quán)法[7]:以歸一化數(shù)據(jù)計(jì)算各指標(biāo)的信息熵(ej)、信息效用值(hj)、熵權(quán)系數(shù)(Wj),公式分別為:

(3)

hi=1-ej

(4)

(5)

4)建立TOPSIS法[7]:首先確定評(píng)價(jià)指標(biāo)的正理想解(A+)和負(fù)理想解(A-):

(6)

接著計(jì)算出各評(píng)價(jià)指標(biāo)分別與正負(fù)理想解的距離值D+和D-,最終計(jì)算得出評(píng)價(jià)指標(biāo)與最優(yōu)方案的接近度(Ci值),根據(jù)Ci值大小排序來(lái)評(píng)定三葉青葉的最佳采收期。計(jì)算公式如下:

(7)

(8)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 質(zhì)譜測(cè)定方法三葉青樣品和混合對(duì)照品溶液按照上述色譜及質(zhì)譜條件下分析得三葉青的UPLC-MS/MS色譜圖,11種化合物和內(nèi)標(biāo)均能在各自通道中分離良好。見圖1。

注:1.新綠原酸;2.綠原酸;3.隱綠原酸;4.異葒草苷;5.葒草苷;6.牡荊苷;7.異牡荊苷;8.異葒草素鼠李糖苷;9.葒草素鼠李糖苷;10.甘草苷11.牡荊素鼠李糖苷;12.異牡荊素鼠李糖苷。圖1 空白(A)對(duì)照品(B)三葉青葉(C)色譜圖

2.6.2 線性與范圍取各對(duì)照品儲(chǔ)備液,用10%甲醇稀釋系列梯度濃度的對(duì)照品混合溶液,測(cè)定前對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液按1∶9混合均勻測(cè)定。以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對(duì)分析物濃度(X)作線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),并以信噪比10計(jì)算定量限(LOQ),以信噪比3計(jì)算檢測(cè)限(LOD)。見表2。

2.6.3 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取線性最低濃度點(diǎn)、低、中、高混合對(duì)照品溶液1 μl,一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次,及連續(xù)6 天測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,其日內(nèi)精密度和日間精密度RSD均在1.13%～4.78%,表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批(201601)三葉青葉6份,按供試品制備方法進(jìn)行制備,分別在室溫下放置0、4、8、12、18和24 h進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,其RSD均在3.58%～4.92%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批(201601)三葉青葉6份,按供試品制備方法進(jìn)行制備,依法測(cè)定,11種成分含量的RSD均在4.53%以內(nèi),表明重復(fù)性良好。

2.6.6 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)已知含量三葉青葉約0.05 g,近似1∶1分別加入11個(gè)對(duì)照品,重復(fù)6次,按供試品制備方法進(jìn)行制備,依法測(cè)定,計(jì)算各個(gè)成分回收率范圍在98.09%～101.16%,其RSD范圍均在2.22%～3.20%,表明方法回收率符合分析要求。

2.7 不同采收期的酚類含量與生物量的動(dòng)態(tài)變化11種成分在12個(gè)采收期呈不同的變化規(guī)律(見圖2),牡荊苷和異牡荊苷變化趨勢(shì)為1月份開始急速上升,2月份達(dá)到峰值后下降,6月份后含量最低,均小于0.0562 mg/g;異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷均在3～5月份含量較高,隨后含量逐漸下降。葒草素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸積累趨勢(shì)基本趨于一致,5月份含量最高,6月份突然降低即出現(xiàn)上升后下降的循環(huán)。三葉青葉生物量累積在4～6月份呈上升趨勢(shì),6月份出現(xiàn)峰值,7～11月份保持較高水平。

注:不同小寫字母表示不同月份之間的比較,P<0.05。圖2 不同月份采收的三葉青葉中11個(gè)成分含量及生物量動(dòng)態(tài)變化

2.8 熵權(quán)TOPSIS法綜合評(píng)價(jià)分析熵權(quán)TOPSIS法是以標(biāo)準(zhǔn)化處理的評(píng)價(jià)指標(biāo)為基礎(chǔ)通過(guò)計(jì)算權(quán)重,來(lái)體現(xiàn)各指標(biāo)的重要程度,同時(shí)將無(wú)量綱化的指標(biāo)通過(guò)計(jì)算正負(fù)理想解和相對(duì)貼近度綜合評(píng)價(jià)最佳采收期[8,9]。各指標(biāo)權(quán)重結(jié)果為信息熵值e={0.8602,0.8984,0.8532};信息效用值h={0.1398,0.1016,0.1468};權(quán)重系數(shù)Wj={36.02%,26.17%,37.81%};說(shuō)明生物量是采收期評(píng)價(jià)分析中的重要因素。TOPSIS法計(jì)算得到D+、D-及評(píng)價(jià)指標(biāo)與最優(yōu)方案的接近度(Ci值),結(jié)果見表3,排名靠前為5月、6月、4月,7月,因此三葉青葉的采收期以4～7月份為最佳。

表3 不同采收期三葉青葉綜合評(píng)價(jià)排序

3 小結(jié)

課題組前期通過(guò)研究三葉青葉中有效成分發(fā)現(xiàn)葉中酚類成分含量較高,尤其是總黃酮[10,11]。因此本研究對(duì)8個(gè)黃酮類成分和3個(gè)酚酸類成分的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷和綠原酸在三葉青葉中含量均較高,牡荊苷、異牡荊苷、異葒草苷和隱綠原酸含量相對(duì)較低。11種成分含量隨時(shí)間變化有所差異,但基本符合3～5月份含量最高,其他月份含量較低。三葉青從11月下旬至次年2月進(jìn)入休眠期,基本停止生長(zhǎng),從3月下旬開始逐漸萌發(fā)新枝葉,此階段三葉青逐步解除休眠,抽發(fā)新芽,確保植株的正常生長(zhǎng),有效成分積累較高,到5月達(dá)到峰值,6～8月份為夏季,三葉青生長(zhǎng)旺盛,進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段[12]。在實(shí)際采收過(guò)程中6月份生物量最高,黃酮類和酚酸類成分含量在3～5月份較高,符合植物生長(zhǎng)規(guī)律。為了更好地分析三葉青葉的最佳采收期,利用熵權(quán)TPOSIS法對(duì)葉片有效成分和生物量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),三葉青葉在5月份采收最優(yōu),4、6、7月份采收次之,中藥材適宜采收期的確立既要重視指標(biāo)性化學(xué)成分體系的選擇,同時(shí)也要注重其藥用部位的生物產(chǎn)量,以實(shí)現(xiàn)藥材生產(chǎn)的質(zhì)量最優(yōu)和產(chǎn)量最大化原則。故建議在4～7月份采收最佳。