陳 科，汪廷彩，梁 言，孫文佳，劉鴻鋼，黎欣欣，周憶蓮，雷 毅

(廣東省食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510435)

白蘭地是以葡萄為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、橡木桶陳釀、調(diào)配而成的蒸餾酒[1-2]。白蘭地含有醇類、酯類和醛類等多種風(fēng)味物質(zhì)，其含量及其之間的相互作用是影響白蘭地品質(zhì)和風(fēng)味的主要因素。不同國(guó)家的白蘭地以法國(guó)的最為馳名，且以干邑最為優(yōu)質(zhì)。干邑白蘭地經(jīng)過橡木桶陳釀以及自身的氧化、水解等過程，揮發(fā)性成分發(fā)生了變化，最終發(fā)酵成具有花香和果香、品質(zhì)醇美的法國(guó)干邑酒，因此揮發(fā)性物質(zhì)是分辨干邑白蘭地風(fēng)格差異、真?zhèn)舞b別與質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)[3-13]。法國(guó)國(guó)家干邑專業(yè)協(xié)會(huì)Bureau National Interprofessionnel du Cognac 每年組織兩次國(guó)際間比對(duì)，組織方利用法國(guó)干邑屬地優(yōu)勢(shì)制備酒樣，通過向各國(guó)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放樣品開展實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)活動(dòng)，其目的在于提升法國(guó)當(dāng)?shù)馗梢鼐频钠焚|(zhì)，更旨在考核和評(píng)價(jià)各參試實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)干邑白蘭地?fù)]發(fā)性成分的技術(shù)能力[14-16]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同品類酒測(cè)定其揮發(fā)性成分進(jìn)行了相關(guān)研究，得出應(yīng)用不同檢測(cè)技術(shù)可以分析各揮發(fā)性成分的含量及其間差異[17-20]。曾朝珍等[21]采用液液萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同陳釀時(shí)間的蘋果白蘭地中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，表明不同大類的蘋果白蘭地呈現(xiàn)出不相同的風(fēng)味特征；付安珍等[22]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)4 種杏白蘭地的香氣成分進(jìn)行分析和比較，得到不同品種的杏對(duì)杏白蘭地香氣成分有很大影響；王斌等[23]采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離并分析了4 種不同蘋果白蘭地酒的香氣成分；趙志聰?shù)萚24]采用HS-SPME 和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)蘋果白蘭地一次蒸餾不同餾分中的香氣成分進(jìn)行分析。

目前國(guó)內(nèi)白蘭地中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)分析主要參照GB/T 11856—2008《白蘭地》[25]，采用氣相色譜法和滴定法測(cè)定揮發(fā)性成分[26-27]。由于滴定法操作較為繁瑣耗時(shí)，不能很好解決國(guó)際比對(duì)樣品測(cè)試量有限、樣品開封后不易保存、報(bào)送時(shí)間較短等檢測(cè)技術(shù)問題。氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、所需待測(cè)揮發(fā)性成分樣品量少、靈敏度高的特點(diǎn)，因此本文選用氣相色譜（gas chromatography,GC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）技術(shù)測(cè)定國(guó)際比對(duì)干邑白蘭地中各揮發(fā)性成分，保證測(cè)試過程定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。通過參加國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，能更好了解自身檢測(cè)技術(shù)能力與國(guó)際檢測(cè)整體水平的差距，有利于保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，同時(shí)為實(shí)驗(yàn)室開展常態(tài)化外部比對(duì)以及為同行實(shí)驗(yàn)室開展該類測(cè)試提供方法學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：N°61、N°60、N°59 干邑白蘭地酒樣，均由法國(guó)Bureau National Interprofessionnel du Cognac提供。N°61為測(cè)試樣品，N°60和N°59為留樣。

試劑及耗材：乙酸乙酯(純度99.57%)、乙縮醛(純度99.44%)、正丙醇(純度99.73%)、活性戊醇(純度99.8 %)、正己醇(純度99.69 %)、癸酸乙酯(純度99.6 %)、仲丁醇(純度99.87 %)、正丁醇(純度99.80 %)、順式-3-己烯醇(純度99 %)、4-甲基-2-戊醇(純度98.52 %)、乙酸正戊酯(純度99.2 %)，Dr.Ehrenstorfer 標(biāo)準(zhǔn)品；異丁醇(純度99.9 %)、異戊醇(純度99.9 %)、乳酸乙酯(純度99.7 %)、糠醛(純度99.8 %)、甲醇(純度99.9 %)、異丁醛(純度99.8 %)、丁酸乙酯(純度99.8%)、叔戊醇(純度99.7%)，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；辛酸乙酯(純度99.4 %），天津阿爾塔科技有限公司；月桂酸乙酯(純度99.7 %），美國(guó)CATO Research Chemicals Inc；無水乙醇(色譜純），天津市康科德科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

儀器設(shè)備：7890B 氣相色譜儀，8890 氣相色譜儀，均配氫火焰離子化檢測(cè)器，7890B-5977B 頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，毛細(xì)管色譜柱CP-Wax 57，美國(guó)Agilengt 公司；Milli-Q 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）稱取適量乙醛、乙酸乙酯、乙縮醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯和糠醛標(biāo)準(zhǔn)品，用60 %乙醇溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為20 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液。移取適量標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋至刻度，配制成200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）稱取適量異丁醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丁醇、正己醇、順-3-己烯醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為2 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液。移取適量標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋至刻度，配制成10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）稱取適量甲醇標(biāo)準(zhǔn)品，用40%乙醇溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為5000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取適量標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋至刻度，配制成200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（4）稱取適量乙酸正戊酯、4-甲基-2-戊醇和叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液定容至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為200 mg/L和10 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 樣品前處理

移取比對(duì)酒樣至10.0 mL 容量瓶，加入100 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，充分混勻后，待測(cè)。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：CP-Wax 57 CB(50 m×250 μm×0.2 μm)；氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；檢測(cè)器溫度為280 ℃；載氣為He，尾吹氣，N2尾吹流量30.0 mL/min，空氣流量350.0 mL/min，氫氣流量35.0 mL/min，進(jìn)樣為分流模式，載氣為N2，吹掃流量3.0 mL/min，色譜柱流量1.0 mL/min。進(jìn)樣量0.2 μL。7890B 用于檢測(cè)13 種揮發(fā)性成分，8890 用于測(cè)定甲醇。不同儀器型號(hào)的氣相色譜參數(shù)與升溫程序，見表1。

表1 不同氣相色譜參數(shù)與升溫程序

1.2.3.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

（1）色譜條件。進(jìn)樣口溫度：220 ℃；載氣：高純氦(純度＞99.999%)，流速1.5 mL/min；氫氣流速35.0 mL/min?？諝饬魉?50.0 mL/min；升溫程序：初始溫度40 ℃，恒 溫5 min，以10 ℃/min 升 至100 ℃，恒溫1.5 min，以15 ℃/min升至220 ℃，恒溫10 min；進(jìn)樣量1 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊電離源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；監(jiān)測(cè)方式：選擇離子掃描(SIM)。溶劑延遲3.5 min。揮發(fā)性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜參數(shù)，見表2。

表2 揮發(fā)性物質(zhì)的色譜保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的選擇

實(shí)驗(yàn)室對(duì)N°61 國(guó)際比對(duì)干邑白蘭地中揮發(fā)性成分測(cè)定進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，首先采用氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性成分乙醛、甲醇、乙酸乙酯、乙縮醛、正丙醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇、乳酸乙酯、糠醛、正己醇、辛酸乙酯、異丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、順-3-己烯醇、月桂酸乙酯。初測(cè)結(jié)果表明，異丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、順-3-己烯醇、癸酸乙酯和月桂酸乙酯揮發(fā)性成分含量較低，以氣相色譜儀的檢測(cè)靈敏度不足以對(duì)其含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。因此，將上述揮發(fā)性成分采用靈敏度更高的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀重新定量測(cè)定，選用乙酸正戊酯、4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)物，通過優(yōu)化色譜類型、升溫程序等儀器條件，最終得到一種具有良好定量測(cè)定6 種揮發(fā)性成分效果的方法。甲醇參考GB 5009.266—2016[28]，樣品經(jīng)氣相色譜分離，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，叔戊醇為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。其余的醇類、酯類和醛類揮發(fā)性成分采用氣相色譜法測(cè)定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于個(gè)別揮發(fā)性成分如異丁醛檢測(cè)過程容易受雜質(zhì)峰干擾，癸酸乙酯測(cè)定過程容易受升溫程序和基質(zhì)效應(yīng)[29]影響。因此調(diào)整和優(yōu)化氣相色譜條件的流速和升溫程序，使干邑酒中揮發(fā)成分逐個(gè)分離。由圖1—圖3 可知，經(jīng)色譜條件優(yōu)化，14 種揮發(fā)性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液能初步分離，為了提高檢測(cè)靈敏度，通過配制低濃度內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行曲線校準(zhǔn)后內(nèi)標(biāo)法定量分析，能更好將低濃度的異丁醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丁醇、正己醇、順-3-己烯醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯9 種揮發(fā)性成分有效分離。甲醇優(yōu)化升溫程序，能對(duì)樣品該成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析和色譜分離。上述揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜信息，結(jié)果見表3。

圖1 14種揮發(fā)性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)（200 mg/L）的氣相色譜圖

圖2 9種揮發(fā)性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)（10 mg/L）的氣相色譜圖

圖3 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)氣相色譜圖

表3 各種揮發(fā)性物質(zhì)的保留時(shí)間、峰面積和峰高

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

由圖4 可知，異丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、順-3-己烯醇、正己醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯經(jīng)過質(zhì)譜條件優(yōu)化，均能有效分離。

圖4 9種揮發(fā)性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)(10 mg/L)的總離子流色譜圖

2.4 方法的線性回歸方程

移取1.2.1（3）標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋至刻度，配制成0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取適量1.2.1（4）標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋至刻度，配制成100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1000 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定。由表4 可知，低濃度揮發(fā)性成分經(jīng)校準(zhǔn)，其在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2≥0.9990。

表4 揮發(fā)性成分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度試驗(yàn)

考察檢測(cè)方法的重復(fù)性，取N°61 樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，同一份樣品平行獨(dú)立操作兩次，連續(xù)平行測(cè)定6 次，計(jì)算組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。由表6可知，N°61 中各揮發(fā)性成分的RSD 均在0.0 %～2.2%內(nèi)。結(jié)果表明，該方法的精密度較好，具有較好的重復(fù)性，可用于干邑白蘭地?fù)]發(fā)性成分的測(cè)定。

2.6 留樣復(fù)測(cè)

取N°60 和N°59 比對(duì)樣品進(jìn)行留樣復(fù)測(cè)，按照“1.2.2”進(jìn)行樣品的處理和測(cè)定，同一份樣品平行獨(dú)立操作兩次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果與N°60、N°59的指定值與滿意值范圍相比。由表5 可知，N°60 和N°59 檢測(cè)數(shù)值在滿意范圍內(nèi)，證明優(yōu)化的檢測(cè)方法能滿足國(guó)外比對(duì)要求。

表5 N°59和N°60留樣復(fù)測(cè)的測(cè)定結(jié)果與評(píng)價(jià)

2.7 比對(duì)樣品測(cè)試

氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定N°61干邑比對(duì)樣品揮發(fā)性成分，平行雙樣測(cè)定后取其平均值為最終結(jié)果。比對(duì)結(jié)果返回后，對(duì)N°61 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表6 可知，N°61 國(guó)際比對(duì)樣品中10 種醇類、6 種酯類和5 種醛類共21 個(gè)參數(shù)的測(cè)定數(shù)據(jù)均在允許范圍內(nèi)，結(jié)果滿意。

表6 N°61的測(cè)定結(jié)果與評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

采用氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，綜合考察儀器靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)等影響，分別優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，通過精密度試驗(yàn)和留樣復(fù)測(cè)，檢測(cè)國(guó)際比對(duì)干邑白蘭地中醇類、酯類和醛類等揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度高、選擇性和線性關(guān)系良好，適用于干邑白蘭地中揮發(fā)性成分的檢測(cè)。同時(shí)應(yīng)經(jīng)常鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室參與高水平的國(guó)際比對(duì)，有助于實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)存在問題，提高檢測(cè)分析能力，保證實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量與控制水平，縮小與國(guó)際先進(jìn)實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)水平差距。