黃 莎，陳 琳，楊動(dòng)聽，汪 昕，楊 選，王曄洋，李偉榮*

（1.麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江麗水 323000；2.麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江麗水 323000）

蜂蜜酒是世界上最早的酒精飲料，在公元五世紀(jì)至六世紀(jì)之間人們憑借經(jīng)驗(yàn)實(shí)踐制作蜂蜜酒，并將之儲(chǔ)存于瓦罐中。近幾年蜂蜜酒非常受歡迎[1]。蜂蜜酒采用稀釋蜂蜜，經(jīng)發(fā)酵過濾澄清得到，酒精度不高[2]。目前，蜂蜜酒釀造工藝存在兩大問題，一是蜂蜜酒發(fā)酵酒精度不高，周期長達(dá)數(shù)周甚至幾個(gè)月，因蜂蜜成分和發(fā)酵菌種的不同而有所差異[3]，酒精度不高使得蜂蜜酒不耐貯藏，發(fā)酵周期長使得商業(yè)化的生產(chǎn)成本增加，不利于蜂蜜酒的產(chǎn)品化開發(fā)；二是蜂蜜釀酒過程中產(chǎn)生不良風(fēng)味，使得蜂蜜酒品質(zhì)難以滿足人們對(duì)愉悅感受的追求[4]。

導(dǎo)致蜂蜜酒發(fā)酵酒精度不高、時(shí)間長的原因，一是蜂蜜自身的問題，蜂蜜的高滲透壓抑制大部分微生物的生長，蜂蜜缺乏酵母生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如氮源和礦物質(zhì)；二是與發(fā)酵的菌種及發(fā)酵溫度有關(guān)，菌種抗性能力的強(qiáng)弱、適應(yīng)性的好壞、接種量以及發(fā)酵溫度與發(fā)酵進(jìn)程和成品品質(zhì)密切相關(guān)[5]。蜂蜜酒的風(fēng)味來自于蜂蜜本身、酵母發(fā)酵及發(fā)酵工藝[6]。揮發(fā)性香氣物質(zhì)對(duì)蜂蜜酒品質(zhì)起著決定性的作用，不良風(fēng)味的產(chǎn)生嚴(yán)重影響蜂蜜酒的品質(zhì)。據(jù)研究報(bào)道，蜂蜜酒的不良風(fēng)味物質(zhì)主要來自于發(fā)酵不完全導(dǎo)致的二次發(fā)酵，蜂蜜酒的不良風(fēng)味與乙酸乙酯、辛酸和己酸的含量有關(guān)，這些揮發(fā)性物質(zhì)導(dǎo)致蜂蜜酒感官品質(zhì)下降，尤其是香氣和味道[7]。還有研究者發(fā)現(xiàn)用于發(fā)酵的菌株對(duì)酒的風(fēng)味有影響，不恰當(dāng)?shù)木暧锌赡軙?huì)產(chǎn)生異味[8]。本研究擬通過研究酵母菌種、酵母接種量、氮源、氮源添加量、蜂蜜稀釋度、pH 值等單因素條件對(duì)蜂蜜酒的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化工藝解決蜂蜜發(fā)酵酒精度不高及發(fā)酵過程產(chǎn)生不良風(fēng)味的問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及菌種：棗花蜜（波美度42 oBx），浙江麗水蜂農(nóng)；AQ 釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；LMD 釀酒酵母，憨酒匠自釀坊，原產(chǎn)國丹麥；DBS釀酒酵母，煙臺(tái)帝伯仕酵母有限公司；

試劑及耗材：純凈水；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、維生素B1，食品級(jí)，廣東順達(dá)食品配料城；其他檢測(cè)用試劑均為分析純?cè)噭ˋR）或生物試劑（BR）。

儀器設(shè)備：BSA224S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；T9CS 雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH 計(jì)，梅特勒-托利多；糖度計(jì)，上海力辰邦西儀器科技有限公司；氣相色譜儀，7890 安捷倫科技有限公司；Trace 1300-ISQ QD 氣質(zhì)聯(lián)用，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 純蜂蜜釀酒操作步驟

蜂蜜稀釋：按蜂蜜和水的質(zhì)量比加純凈水稀釋，并攪拌均勻，采用手持折光儀測(cè)定糖度，單位為oBx。

加氮源：蜂蜜中缺乏酵母生長繁殖所需的足夠氮源[9-10]，需將外源氮源(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、維生素B1 等加入蜂蜜稀釋液中，并攪拌均勻，才能使發(fā)酵進(jìn)行徹底。

滅菌和冷卻：將配制好的蜂蜜營養(yǎng)液置于80 ℃水浴保溫20 min，起到殺滅有害微生物的作用，冷卻至30 ℃左右。

加酵母：將酵母置于35 ℃左右含2%的蔗糖水溶液中活化約20 min，將活化好的酵母菌加入滅菌冷卻好的蜂蜜營養(yǎng)液中。

發(fā)酵：將接種好的蜂蜜營養(yǎng)液置于適宜溫度下發(fā)酵1個(gè)月左右。

澄清：將發(fā)酵液靜置一段時(shí)間，直至發(fā)酵液完全澄清，取澄清發(fā)酵液即得到蜂蜜酒成品。

1.2.2 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)研究不同酵母菌種、不同接種量、不同氮源、不同氮源添加量、不同蜂蜜稀釋度、不同pH 值對(duì)純蜂蜜發(fā)酵酒的影響，評(píng)價(jià)指標(biāo)有蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分。

1.2.3 發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，自變量選取A 酵母接種量、B 氮源添加量和C 蜂蜜稀釋度，響應(yīng)值為X 酒精度和Y 感官評(píng)分，采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵條件[11]，3因素3水平見表1。

表1 純蜂蜜酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 分析檢測(cè)

蜂蜜酒酒精度的測(cè)定參照GB 5009.225—2016執(zhí)行[12]；蜂蜜酒糖度采用手持折光儀進(jìn)行測(cè)定，單位為oBx；總糖、總酸和揮發(fā)酸參照GB/T 15038—2006 執(zhí)行[13]；甲醇的測(cè)定參照GB 5009.266—2016執(zhí)行[14]；衛(wèi)生指標(biāo)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的測(cè)定參照GB 4789.10—2016[15]和GB 4789.4—2016[16]執(zhí)行。

1.2.5 感官評(píng)價(jià)

蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5475—2020 執(zhí)行[17]，將酒樣水浴調(diào)溫至20～25 ℃，取酒樣注入潔凈透明的玻璃杯中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。外觀與色澤：在自然光亮處，用肉眼觀察酒樣的外觀與色澤，色澤及深淺、透明度和澄清度、有無沉淀及懸浮物；香氣：手握杯柱，將酒杯置于鼻孔下方，嗅聞?chuàng)]發(fā)香氣，然后慢慢搖動(dòng)酒杯，嗅聞空氣進(jìn)入后的香氣，加蓋用手握酒杯腹部2 min，搖動(dòng)后再嗅聞香氣；滋味：喝入適量酒樣，仔細(xì)品嘗后咽下，再體會(huì)后味[18]，最后根據(jù)表2評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[19]進(jìn)行打分。

表2 蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)參照何瑞的略做修改[20]，取樣品6 mL 加入到萃取瓶中，密封好后插入萃取針，50 ℃恒溫萃取40 min后插入進(jìn)樣口解析4 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 mm*0.25 mm，0.25 μm）；載氣氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：42 ℃保持4 min，以10 ℃/min 升至90 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min 升至130 ℃，保持2 min，最后以10 ℃升至240 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z；質(zhì)譜庫NIST 11。檢測(cè)出的物質(zhì)通過計(jì)算機(jī)檢索與Library-Mainlib 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)比，僅統(tǒng)計(jì)正反匹配度均超過800 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用WPS 2021 和Design Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同菌種及接種量對(duì)蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

實(shí)驗(yàn)選用3 種釀酒酵母，分別是DBS、AQ、LMD，對(duì)酒精度和感官評(píng)分的影響如圖1 所示。LMD 發(fā)酵得到的蜂蜜酒無論是酒精度還是感官評(píng)分都高于另外兩組，選用LMD 釀酒酵母作為發(fā)酵菌種。不同接種量對(duì)蜂蜜酒的酒精度和感官評(píng)分的影響如圖2 所示，酒精度和感官評(píng)分隨接種量的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，接種量2 g/L時(shí)最大。

圖1 不同酵母菌種對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

圖2 不同酵母接種量對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

2.1.2 不同氮源及添加量對(duì)蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

實(shí)驗(yàn)選用(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4和VB1作為氮源，研究不同氮源及添加量對(duì)酒精度和感官評(píng)分的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 和圖4 所示。3 種氮源的添加對(duì)酒精度無顯著影響，添加(NH4)2HPO4作為氮源蜂蜜酒的感官評(píng)分最高，添加VB1作為氮源得到的蜂蜜酒出現(xiàn)異味，影響感官體驗(yàn)。

圖3 不同氮源對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

圖4 不同氮源添加量對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

2.1.3 不同初始糖度對(duì)蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

不同初始糖度對(duì)蜂蜜酒酒精度的提升至關(guān)重要，初始糖度低無法提供足夠的碳源用于發(fā)酵產(chǎn)生酒精，過高的初始糖度會(huì)產(chǎn)生過高的滲透壓不利于酵母繁殖增長。不同初始糖度對(duì)蜂蜜酒的酒精度和感官評(píng)價(jià)的影響如圖5 所示，酒精度隨初始糖度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，初始糖度的增加，致使?jié)B透壓增加，限制了酵母的繁殖和產(chǎn)酒精的能力[20]。初始糖度的增加有利于蜂蜜酒的口感提升，增加蜂蜜酒的柔和感。

圖5 不同初始糖度對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

2.1.4 不同pH 值對(duì)蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

原蜂蜜稀釋液pH 值為7.0，使用檸檬酸調(diào)節(jié)蜂蜜稀釋液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0，再發(fā)酵得到蜂蜜酒，結(jié)果如圖6 所示。蜂蜜稀釋液的pH 值顯著影響蜂蜜酒的感官評(píng)分，蜂蜜稀釋液pH 值3.0 時(shí)得到的蜂蜜酒的酒精度和感官評(píng)分最低，未調(diào)節(jié)pH 值的蜂蜜稀釋液發(fā)酵得到的蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分最高。

圖6 不同初始pH值對(duì)蜂蜜酒酒精度和感官評(píng)分的影響

2.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酵母的接種量、氮源的添加量及初始糖度對(duì)蜂蜜酒的酒精度和感官評(píng)分有較大影響，選擇三者作為三因素，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，篩選出純蜂蜜發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4和表5。

表3 蜂蜜酒的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 蜂蜜酒酒精度的回歸模型分析

表5 蜂蜜酒感官評(píng)分的回歸模型分析

模型的二次多項(xiàng)式回歸方程：

根據(jù)表4 可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該模型誤差較小，擬合度好。A2、B2、C2對(duì)酒精度影響極顯著（P＜0.01），B 對(duì)酒精度影響顯著（P＜0.05），模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9736，表明該回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合度，可以用該方程表達(dá)酒精度與酵母接種量、氮源添加量和初始糖度之間的關(guān)系[21]。

模型的二次多項(xiàng)式回歸方程：

根據(jù)表5 可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該模型誤差較小，擬合度好。A、B、C、AB、A2、B2、C2對(duì)感官評(píng)分的影響極其顯著（P＜0.01），BC 對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9904，表明該回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合度，可以用該方程表達(dá)感官評(píng)分與酵母接種量、氮源添加量和初始糖度之間的關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面交互影響

各因素交互作用對(duì)酒精度的影響如圖7，當(dāng)酵母接種量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）兩兩交互作用時(shí)，對(duì)蜂蜜酒酒精度均有影響，但影響程度存在一定差異。酵母接種量（A）和氮源添加量（B）的響應(yīng)面較為平緩，等高線也顯示酒精度變化跨度小，說明酵母接種量（A）和氮源添加量（B）對(duì)酒精度的影響小于初始糖度（C），在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以獲得酒精度為最大值的點(diǎn)。

圖7 各因素交互作用對(duì)蜂蜜酒酒精度的影響響應(yīng)面

各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響如圖8，當(dāng)酵母接種量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）兩兩交互作用時(shí)，對(duì)蜂蜜酒感官評(píng)分均有影響，AB、AC、BC 面分別隨A、B、C 的增加，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，因此試驗(yàn)可以獲得感官評(píng)分最大值的點(diǎn)[19]。

圖8 各因素交互作用對(duì)蜂蜜酒感官評(píng)分的影響響應(yīng)面

由Design expert.V8.0.6 預(yù)測(cè)得到，最佳工藝是：酵母接種量2.14 g/L，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01oBx，此時(shí)模型預(yù)測(cè)值酒精度和感官評(píng)分分別為15.09 %vol 和86.4 分。為此設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到的蜂蜜酒酒精度為15.20 %vol，感官評(píng)分為86.5 分，與預(yù)測(cè)值相差不大，表明本工藝可行，純蜂蜜釀酒能夠達(dá)到這一酒精度尚數(shù)少見。

2.3 理化指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果

檢測(cè)優(yōu)化工藝后釀造得到的蜂蜜酒理化指標(biāo)，見表6。酒精度、總酸、揮發(fā)性酸均符合QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》標(biāo)準(zhǔn)[17]，但此標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)蜂蜜酒的總糖規(guī)范不夠明確，普遍認(rèn)為可參照葡萄酒[22]和其他果酒的標(biāo)準(zhǔn)[23]，根據(jù)含糖量高低分為干型（總糖≤4.0g/L）、半干型（總糖4.1～12.0 g/L）、半甜型（總糖12.1～45.0 g/L）、甜型（總糖≥45.1 g/L）蜂蜜酒[24-26]。此外，蜂蜜酒中甲醇、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未檢出。

表6 蜂蜜酒理化和衛(wèi)生指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4 風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

本工藝釀造得到的蜂蜜酒檢測(cè)出的風(fēng)味物質(zhì)組分及相對(duì)含量如表7 所示。檢測(cè)出14 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醛類和酯類相對(duì)含量最高，無不良風(fēng)味物質(zhì)出現(xiàn)，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。徐麗萍等[28]采用電子鼻和氣相色譜-離子遷移譜法對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分的遷移變化進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的蜂蜜酒在保留蜂蜜原有風(fēng)味的同時(shí)，新的風(fēng)味成分顯著增加，從而形成蜂蜜酒獨(dú)特的風(fēng)味特征。

表7 蜂蜜酒風(fēng)味物質(zhì)組分及相對(duì)含量

3 結(jié)論

本研究采用深棕色棗花蜜釀造蜂蜜酒，有研究表明深色蜂蜜的抗氧化活性顯著高于淺色的蜂蜜，釀成蜂蜜酒仍然如此[29]。通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)得到純蜂蜜釀酒的最佳發(fā)酵條件為菌種選用LMD釀酒酵母，酵母接種量2.14 g/L，氮源選擇(NH4)2HPO4，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01oBx，此條件下得到的蜂蜜酒感官評(píng)分86.5 分、總糖24.4 g/L、酒精度15.20 %vol、總酸3.6 g/L、揮發(fā)酸0.54 g/L，甲醇、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出，檢測(cè)出14 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。純蜂蜜釀造酒酒體協(xié)調(diào)，呈透明琥珀色，無明顯沉淀，無明顯酸澀味，蜜香酒香濃郁和諧。本研究將蜂蜜酒酒精度提高至15.20%vol，風(fēng)味也得到顯著提升。此外，蜂蜜酒仍值得深入研究，如蜂蜜酒的特征風(fēng)味以及風(fēng)味和化學(xué)物質(zhì)之間的聯(lián)系還不清楚[30]，本地坊間還傳言蜂蜜酒具有諸多功能性，滋陰補(bǔ)腎、延緩衰老等，趙彤等[31]也提出發(fā)酵蜂產(chǎn)品的功能性和作用機(jī)制值得深入研究。