李青霞，劉雪倩，馮一卓，白璐，趙凌霞

山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院（山西白求恩醫(yī)院 山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 同濟(jì)山西醫(yī)院）內(nèi)分泌科，太原030032

目前，急性腎損傷（AKI）呈現(xiàn)高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)。在導(dǎo)致AKI的諸多原因中，腎臟缺血再灌注損傷是主要原因之一，它常常引起急性腎小管上皮細(xì)胞壞死、凋亡、細(xì)胞脫落或結(jié)構(gòu)異常，最終引起腎小管梗阻、腎小管濾過液回漏和濾過功能衰竭。目前針對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的治療以改善腎臟缺血癥狀為主，而不能從根本上解決腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、數(shù)目減少等問題。干細(xì)胞能夠自我復(fù)制和更新，并且有一定的分化潛能，在特定條件下能向多種細(xì)胞分化進(jìn)而形成相應(yīng)組織和器官。與干細(xì)胞不同的是，祖細(xì)胞在發(fā)育過程中比干細(xì)胞更依賴于某些細(xì)胞系，但與完全分化和成熟的細(xì)胞相比，它們?cè)谏锝Y(jié)構(gòu)上均處于未分化或未成熟的狀態(tài)。干/祖細(xì)胞可以從骨髓、脂肪、臍帶等多種組織中獲得，具有來源廣泛的優(yōu)點(diǎn)［1-2］。多項(xiàng)研究表明，干細(xì)胞移植治療AKI具有較好的應(yīng)用前景［3-5］，現(xiàn)將相關(guān)研究綜述如下。

1 胚胎干細(xì)胞（ESCs）

ESCs是多能干細(xì)胞，來源于哺乳動(dòng)物受精卵的內(nèi)部細(xì)胞群，具有全能性。ESCs可自我更新和增殖，亦可多向分化形成外胚層、中胚層、內(nèi)胚層等多種細(xì)胞類型。學(xué)者們希望利用ESCs的全能性，體外誘導(dǎo)分化得到腎干/祖細(xì)胞，并移植到體內(nèi)分化為腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，治療腎臟疾病、改善腎臟功能。已有研究通過應(yīng)用不同的生物技術(shù)方法得到能夠無限增殖和全能分化的人ESCs，這將很好地應(yīng)用于移植治療、基因治療及生物發(fā)育等相關(guān)研究。

有學(xué)者誘導(dǎo)小鼠ESCs進(jìn)入腎祖細(xì)胞和充分分化的腎細(xì)胞，使用腎源性生長因子或化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合處理ESCs，使ESCs產(chǎn)生表達(dá)特定腎系細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞能夠在發(fā)育中的小鼠腎臟中形成管狀結(jié)構(gòu)，或被整合到腎臟實(shí)質(zhì)中，提示ESCs可以被應(yīng)用于腎臟損傷后的細(xì)胞治療［6］。在體外，ESCs可以通過抑制分化獲得連續(xù)傳代，并且分化為腎臟的多種細(xì)胞類型。另有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎發(fā)育過程中，一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子可鑒別腎臟祖細(xì)胞，如腎間充質(zhì)表達(dá)的SALL1和SIX2可以做為腎祖細(xì)胞的標(biāo)志物，幫助研究者觀察到ESCs分化至腎臟祖細(xì)胞的過程［7］，進(jìn)而識(shí)別、篩選和使用腎祖細(xì)胞。

在成功獲得人ESCs后，體外移植ESCs產(chǎn)生器官特異性細(xì)胞類型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)功能障礙器官的功能恢復(fù)。從ESCs可獲得腎臟祖細(xì)胞、較多種類的腎臟細(xì)胞及類腎器官。由ESCs獲得的類腎器官能夠體外模擬腎臟的功能，是一種有效的腎臟再生方法。但人ESCs的臨床應(yīng)用存在諸多問題：首先是與人類受精卵使用相關(guān)的倫理問題，其次是移植后的排斥反應(yīng)，最后是通過ESCs誘導(dǎo)分化所得的類腎器官常是不成熟的，沒有血管及尿液排出的途徑，遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到臨床移植應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，僅可用于生物組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選和疾病模型的制備。

2 胚胎腎中的干/祖細(xì)胞

人類胚胎發(fā)育分為三個(gè)胚層，腎臟來自于中胚層。按腎臟發(fā)育時(shí)間及先后順序，哺乳動(dòng)物腎臟的形成經(jīng)歷了前腎、中腎和后腎共3個(gè)發(fā)育階段。前腎和中腎是腎臟在胚胎發(fā)育過程的暫時(shí)性器官，在胚胎期相繼退化，而后腎的發(fā)生是永久性的，哺乳動(dòng)物的成年腎臟來源于后腎。后腎是由生腎索周圍未分化的腎間充質(zhì)和中腎導(dǎo)管的輸尿管芽相互作用形成的，這兩種組織均來自中胚層。輸尿管芽分泌誘導(dǎo)分化的因子誘導(dǎo)腎間充質(zhì)分化為上皮化的腎單位和間質(zhì)，同時(shí)引導(dǎo)輸尿管芽延長、分支形成下尿路，從集合管經(jīng)腎盂、輸尿管至部分膀胱［8］。多項(xiàng)研究表明，腎間充質(zhì)中含有腎干細(xì)胞，一個(gè)單獨(dú)的后腎未分化間充質(zhì)細(xì)胞可生成除集合管以外的所有腎上皮細(xì)胞［9-10］。因此，胚胎期后腎未分化間充質(zhì)細(xì)胞是一種多能的腎上皮前體細(xì)胞［11］，即多能性腎臟祖細(xì)胞，在合適的環(huán)境下能夠定向分化為腎單位上皮細(xì)胞，如腎小球足細(xì)胞、腎近端和遠(yuǎn)端小管及髓袢的上皮細(xì)胞，其在腎臟祖細(xì)胞相關(guān)研究方面具有廣闊應(yīng)用前景。

近年來，有學(xué)者分別將人胚胎中提取的包含神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1的腎祖細(xì)胞分別移植到病鼠腎臟和5/6腎切除模型中，顯示出對(duì)慢性腎功能衰竭的抑制作用［12］。然而，目前還沒有關(guān)于胚胎腎祖細(xì)胞對(duì)AKI模型治療潛能的研究報(bào)告。雖然有研究顯示腎祖細(xì)胞仍然存在于斑馬魚的成年腎臟中，并參與腎臟損傷后的再生和分化［13］，然而SIX2的譜系追蹤研究證實(shí)，成年小鼠中不存在胚胎腎祖細(xì)胞，這些細(xì)胞在腎臟完全發(fā)育成熟后就逐漸消失［14］。目前需明確腎祖細(xì)胞的鑒別、提取和體外培養(yǎng)方法，進(jìn)一步研究腎祖細(xì)胞的應(yīng)用。胚胎腎臟中的腎祖細(xì)胞增殖依賴于其周圍的生存環(huán)境，但對(duì)于其適宜環(huán)境尚未研究清楚，體外擴(kuò)增胚胎腎祖細(xì)胞的方法尚未建立，因此，加速胚胎腎祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增研究才有望將此類細(xì)胞應(yīng)用于移植治療。

3 成體腎臟干/祖細(xì)胞

腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其再生的難度也高于其他器官，而成體腎臟干/祖細(xì)胞具有自我復(fù)制、多向分化的能力，且來源相對(duì)容易，故成為腎臟再生醫(yī)學(xué)中最有前景的研究對(duì)象。研究證實(shí)，不同的哺乳動(dòng)物成熟腎臟組織中均含有干細(xì)胞，即成體腎臟干/祖細(xì)胞，這些成體腎臟干/祖細(xì)胞能分化成腎臟內(nèi)的各種細(xì)胞，體外誘導(dǎo)下甚至可以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的腎臟［15］。通過多種鑒定方法，可以從成體腎臟的不同部位分離腎臟干/祖細(xì)胞，如標(biāo)記保留法、克隆基因測(cè)定法、使用細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)、譜系追蹤法和側(cè)群細(xì)胞測(cè)定法［16-17］，雖然這些成體腎干/祖細(xì)胞與胚胎腎干/祖細(xì)胞一樣參與腎小球和腎小管上皮細(xì)胞的形成，但它們可能代表不同于胚胎腎祖細(xì)胞的細(xì)胞群，具有不同的基因表達(dá)譜和細(xì)胞表達(dá)機(jī)制。

各國研究者通過不同實(shí)驗(yàn)方法找出了多種類型的成體腎臟干/祖細(xì)胞，但是關(guān)于成體腎臟干/祖細(xì)胞還存在一些爭(zhēng)議。研究者提出成體腎臟干/祖細(xì)胞在急性、慢性腎損傷的修復(fù)過程中能夠發(fā)揮有益作用［18］。但也有部分研究認(rèn)為，成年腎臟不再出現(xiàn)SIX2基因的活化現(xiàn)象，腎臟的損傷修復(fù)與成體腎臟的干/祖細(xì)胞無關(guān)，可能是成熟的腎小管上皮細(xì)胞去分化后再現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志物有關(guān)［19］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腎臟細(xì)胞的自我更新和損傷修復(fù)是成熟腎小管上皮細(xì)胞對(duì)壞死細(xì)胞的替代［20］。所以研究者還需對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的特征描述，并驗(yàn)證細(xì)胞的分離方法是否科學(xué)、可重復(fù)，并檢查成體腎臟干/祖細(xì)胞群體的治療潛力。

4 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）

有學(xué)者用Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞，成功誘導(dǎo)出與ESCs相似的全能干細(xì)胞，即iPSCs。將體細(xì)胞重編程為iPSCs是再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)潛在治療方向，也是藥物篩選的一種工具［21］。

iPSCs作為全能型干細(xì)胞，可定向分化成腎祖細(xì)胞。BASTA等［7］通過誘導(dǎo)iPSCs形成腎臟祖細(xì)胞，體外誘導(dǎo)iPSCs 9 d后獲得SIX2陽性、SALLl陽性、WTl陽性、PAX2陽性的腎臟祖細(xì)胞，誘導(dǎo)效率高達(dá)90%，并且能在體外重構(gòu)后腎。有研究報(bào)道，可以用iPSCs在體外模擬體內(nèi)腎祖細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的過程，先誘導(dǎo)人iPSCs高效分化為中胚層細(xì)胞，這些中胚層細(xì)胞具有分化為胚胎腎祖細(xì)胞和成人腎細(xì)胞類型（如腎小球足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞）的潛力，進(jìn)而能夠在器官培養(yǎng)環(huán)境中形成三維腎小管結(jié)構(gòu)［22］。然而人iPSCs來源的中胚層細(xì)胞如何高效分化為腎臟前體細(xì)胞還需要進(jìn)一步研究。有學(xué)者利用人來源的iPSCs，通過調(diào)控CHIR99021、FGF9細(xì)胞因子的作用時(shí)間，控制輸尿管芽與后腎間充質(zhì)的形成比例，進(jìn)而控制輸尿管、集合管及腎單位的形成比例，構(gòu)建了類腎體［23］。類腎體尚未形成完整的腎臟結(jié)構(gòu)，但這些類腎體可以作為腎臟體外研究的模型、遺傳性腎臟疾病模型，用來研究藥物的腎臟毒性及人類腎臟發(fā)育過程。

重編程成體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs為臨床干細(xì)胞治療創(chuàng)造了新的機(jī)會(huì)。有研究發(fā)現(xiàn)，通過重編程外周血單核細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、韌帶細(xì)胞等多種體細(xì)胞能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs［24］。盡管不同來源的iPSCs數(shù)量不斷增加，但iPSCs產(chǎn)量有限，iPSCs在制備過程中存在低誘導(dǎo)率的問題，學(xué)者們通過降低培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度、添加維生素C、應(yīng)用生物化學(xué)制劑等方法提高iPSCs的誘導(dǎo)率。利用Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc可以將人胚胎腎皮質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs，其重編程效率約為成人真皮成纖維細(xì)胞的40倍［25］，這可能有助于腎臟疾病的研究，并加速細(xì)胞再生療法的發(fā)展。

相比ESCs的制取存在倫理學(xué)爭(zhēng)議，iPSCs在應(yīng)用方面一樣存在倫理學(xué)問題。首先是iPSCs有較強(qiáng)的致瘤特性，應(yīng)用于臨床有潛在風(fēng)險(xiǎn)；其次人iPSCs導(dǎo)入動(dòng)物胚胎中產(chǎn)生的嵌合體動(dòng)物存在極大的倫理道德爭(zhēng)議；最后是由iPSCs誘導(dǎo)的原始生殖細(xì)胞用于不孕癥患者，其出生的孩子也存在法律和道德爭(zhēng)議。盡管iPSCs在制備和使用中存在很多問題，但其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面依然越來越受關(guān)注，在疾病模型的建立、藥物篩選方面有巨大的應(yīng)用潛能。iPSCs有ESCs的特性而又能避免部分倫理問題和道德問題，其有望成為干細(xì)胞治療腎臟疾病、腎臟器官移植的種子細(xì)胞。

5 人工腎祖細(xì)胞

有學(xué)者通過將6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（SIX1、SIX2、OSR1、EYA1、HOXA11和SNAI2）在成人近端腎小管上皮細(xì)胞系中表達(dá)，導(dǎo)致實(shí)質(zhì)腎臟細(xì)胞中激活了與腎祖細(xì)胞一致的基因網(wǎng)絡(luò)［5］，說明完全分化的成人腎細(xì)胞可以重新編程獲得腎祖細(xì)胞，但是在體外將腎細(xì)胞以外的體細(xì)胞類型重新編程為腎祖細(xì)胞尚待實(shí)現(xiàn)。成人腎細(xì)胞通過細(xì)胞重編程生成腎祖細(xì)胞將是胚胎腎祖細(xì)胞的潛在來源，盡管相應(yīng)方法尚未建立，但考慮到從胚胎特別是人類胚胎中獲得足夠數(shù)量的干/祖細(xì)胞樣本非常困難，以上策略可能對(duì)腎臟祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用有重要價(jià)值。細(xì)胞重編程的領(lǐng)域發(fā)展迅速，這為細(xì)胞、組織甚至器官再生提供了的可能，為疾病的臨床治療帶來了新的希望，隨之而來的問題是新的細(xì)胞表型如何建立和改變。盡管在腎臟細(xì)胞生成iPSCs、iPSCs向腎臟分化及成年細(xì)胞向腎元祖細(xì)胞的重編程方面已經(jīng)取得了初步進(jìn)展，但仍然屬于臨床前期工作，存在大量的實(shí)際應(yīng)用問題。

6 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）

在疾病干細(xì)胞治療中，MSCs占有很重要的地位。MSCs源于中胚層，最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，存在于多種組織和器官中，具有干細(xì)胞的自我復(fù)制和多向分化潛能，現(xiàn)在已經(jīng)可以從胎盤、臍帶基質(zhì)、骨髓、肌肉、心臟、脂肪組織中找到［26］。在這些來源中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）是最早發(fā)現(xiàn)和提取的，也是目前研究中應(yīng)用最多的MSCs。另外，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）和肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞開展的研究也相對(duì)比較多，取材也比較容易［27-28］。最初研究認(rèn)為MSCs是通過分化為靶細(xì)胞和替代損傷組織發(fā)揮其作用，隨后研究表明，移植的MSCs并不能代替受損的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而是通過旁分泌機(jī)制減輕損傷并加速修復(fù)［29］。BMMSCs和ADSCs由于獲得相對(duì)容易，許多AKI動(dòng)物模型干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)多選用這兩種干細(xì)胞，特別是BMMSCs。有研究證實(shí)BMMSCs治療AKI動(dòng)物模型有效［30］。ADSCs可以從自體脂肪組織中提取獲得，是非免疫原性的，能夠避免論理爭(zhēng)議，并且在各種腎臟疾病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中顯示了其治療腎臟疾病的療效［31-32］。

早期研究表明，BMMSCs可以分化為腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而最近證據(jù)表明BMMSCs的分化能力是有限的，BMMSCs不能直接分化為腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞，它對(duì)腎功能的有益作用在很大程度上是由其產(chǎn)生的旁分泌因子介導(dǎo)的，這些旁分泌因子具有抗凋亡、促血管生成和免疫調(diào)節(jié)等作用［33］。ADSCs可能主要通過旁分泌作用來修復(fù)腎功能，實(shí)驗(yàn)表明，ADSCs可以通過抑制組織趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)從而減輕急性腎功能損傷［34］，還可以降低蛋白氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)，從而減少缺血再灌注損傷［35］。MSCs能夠分泌血管營養(yǎng)生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子1或肝細(xì)胞生長因子，這些因子有助于腎臟修復(fù)［36］。

腎臟損傷后，MSCs具有保護(hù)作用和損傷后的再生驅(qū)動(dòng)作用。有研究顯示，移植到小鼠體內(nèi)的人臍帶MSCs有刺激腎小管上皮細(xì)胞恢復(fù)線粒體質(zhì)量和功能的作用，能在相鄰的腎小管上皮細(xì)胞之間起到修復(fù)作用［37］。有數(shù)據(jù)顯示，在SIRT3表達(dá)缺陷的AKI小鼠中，人臍帶MSCs治療未能發(fā)生腎臟保護(hù)作用，強(qiáng)調(diào)了SIRT3在腎小管上皮細(xì)胞恢復(fù)中的功能。這表明人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞移植到AKI小鼠體內(nèi)時(shí)，可通過SIRT3刺激腎小管細(xì)胞生長并增強(qiáng)線粒體功能，通過促進(jìn)腎臟修復(fù)，從而誘導(dǎo)受損腎小管細(xì)胞的整體代謝重編程來維持能量供應(yīng)。

現(xiàn)有醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，除了腎臟替代治療外，幾乎所有藥物治療均未能顯著改善AKI患者的預(yù)后［38］。腎臟作為再生難度最大的器官之一，干細(xì)胞在腎臟疾病治療中的應(yīng)用研究也一直在開展，各種種屬包括人腎臟原位干細(xì)胞的研究成果有很多［39-40］，但是一直還沒有特異性的標(biāo)志物和（或）檢測(cè)方法來區(qū)分腎干/祖細(xì)胞。目前，干/祖細(xì)胞應(yīng)用于AKI臨床治療存在的問題仍很多：①ESCs/iPSCs定向分化為腎系細(xì)胞和已分化成熟腎細(xì)胞重編程成腎祖細(xì)胞的方法尚未完全建立，大多數(shù)研究主要利用動(dòng)物ESCs，而誘導(dǎo)人ESCs/iPSCs進(jìn)入人腎系細(xì)胞仍沒有規(guī)范可循的實(shí)驗(yàn)方法。②成熟腎臟的腎祖細(xì)胞不等同于胚胎腎臟的腎祖細(xì)胞，它們包含多種不同的細(xì)胞群，需要通過不同的方法鑒定，目前尚無統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的鑒定和分選方法。③腎干/祖細(xì)胞移植在AKI動(dòng)物模型中的治療效果已在少數(shù)研究中進(jìn)行報(bào)道，但在AKI患者中尚未有評(píng)估。④MSCs雖然在動(dòng)物腎臟疾病模型中有大量研究和獲益，但獲益原因尚待進(jìn)一步研究?？傊?，腎干/祖細(xì)胞移植可能為AKI提供了新的治療策略，但這一策略的臨床應(yīng)用需要深入研究，如胚胎或成人腎干/祖細(xì)胞的特性，以及多種干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法和有效移植方法等。