高輝，吳江，李超

(上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院骨科，上海 201500)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種多見于絕經(jīng)后中老年婦女的以骨量減少、骨密度(BMD)下降、骨骼脆性增加為特征的骨代謝性疾病[1]。OP患者日?；顒又幸子诎l(fā)生骨折，其致殘、致死率高嚴重影響中老年人的生活質量[2]。OP主要是由于成骨細胞和破骨細胞的代謝平衡導致的，OP患者通常成骨細胞活性較弱、破骨細胞活性較強導致骨組織密度下降、脆性增加[3]。目前對于OP的治療藥物主要分為兩類：一類為促骨形成類藥物，另外一類為抑制骨吸收藥物。常見的促骨形成類藥物包括：他汀類藥物、重組人甲狀旁腺激素以及生長激素等；常見的抑制骨吸收藥物包括：雙膦酸鹽、性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等[4]。但目前治療OP的藥物均有一定的副作用且療效較長、費用較高等不足之處[5]。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是一種具有較強增殖能力且分化潛力大、免疫原性低的細胞[6]。HUC-MSCs經(jīng)過特定的誘導可以分化成多種組織細胞且無道德倫理問題限制，因此具有較大的應用前景[7]。XIA[8]等研究表明通過體外移植HUC-MSCs可以顯著改善OP癥狀，但目前關于HUC-MSCs治療OP的機制尚不完全統(tǒng)一?；诖吮狙芯客ㄟ^建立OP大鼠模型，并利用HUC-MSCs干預檢測其OP癥狀及相關通路情況蛋白表達情況。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級8周齡雌性SD大鼠60只，體質量(220±30)g，購自武漢華聯(lián)科有限公司，SYXK(鄂)2018-0104。本實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準同意，倫理審批號：J2021-0002。

1.2 材料

HUC-MSCs細胞株購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(貨號：ab83369)購自abcam；Ⅰ型膠原 C 端肽(c-terminal peptide of type Ⅰ collagen，CTX)試劑盒(貨號：XG-E990132)購自上海西格科技有限公司；Runx2抗體(貨號：ab92336)、β-catenin抗體(貨號：ab68183)、GAPDH(貨號：ab181602)均購自Abcam。

1.3 主要儀器

雙能X線骨密度儀(型號：AKDX-09W-I)購自艾克瑞公司；超低溫冰箱(型號：VIP ECO MDF-DU502VHL-PC)購自phcbi公司；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司。

2 方 法

2.1 分組及建立模型

大鼠適應性喂養(yǎng) 1 w，采用隨機數(shù)字表法分為3組，其中Sham組20只，Model組30只和HUC-MSCs組30只，采用兩側卵巢切除法制成OP大鼠模型，方法參考YANG等[9]研究：Model組和HUC-MSCs組大鼠采用水合氯醛麻醉后，從腰背部切口進入腹腔切除雙側卵巢，Sham組大鼠切除卵巢等重量的脂肪組織，手術后常規(guī)飼養(yǎng)。10 w后每組處死3只大鼠，心臟穿刺取血檢測大鼠雌激素水平，若雌激素水平差異有統(tǒng)計學意義則表明造模成功。

2.2 藥物干預

取凍存的HUC-MSCs細胞，復蘇后，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3 d換1次培養(yǎng)基，當細胞密度 80%～90%時，用0.25%胰酶消化，并傳3代。用生理鹽水配制成細胞密度為4×106/mL的細胞懸液。HUC-MSCs組大鼠完成手術后以4×106/3 d的細胞數(shù)目進行尾靜脈注射，Sham組和Model組注射等量生理鹽水。

2.3 檢測項目

2.3.1 大鼠相關血清指標檢測

各組取5只大鼠，碘伏消毒暴露心臟后，使用7號采血針刺入心臟，抽取10 mL全血，靜置1 h后，使用離心機以3000 r/min離心15 min，取上層血清按照試劑盒檢測方式檢測各組大鼠雌激素水平、血鈣水平、ALP水平、CTX水平。

2.3.2 大鼠骨組織相關指標檢測

各組取5只大鼠右側脛骨，使用4%多聚甲醛固定后，置于雙能X線骨密度儀上檢測大鼠BMD。采用 Micro CT 檢測大鼠即骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

各組取5只大鼠骨組織進行石蠟切片，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色，用顯微鏡觀察，使用Image-Pro Plus分析成骨細胞的表面與骨表面積比例(Obs/BS)和破骨細胞表面積與骨表面積比例(Ocs/BS)。

2.3.3 大鼠骨組織大鼠Wnt/β-catenin/Runx2信號通路相關蛋白檢測

各組取5只大鼠骨組織在研缽內(nèi)磨碎后，加入裂解液，加入量按照每100 mg骨組織加入1 mL裂解液，使用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法提取樣本中的蛋白，使用半干法將提取的蛋白轉移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉，加入各蛋白對應的抗體并孵育，彰顯后拍照，使用Image J軟件進行灰度值分析各蛋白的相對表達水平，本研究使用的內(nèi)參蛋白為GAPDH。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，作圖采用 GraphPad Prism 7.0軟件，大鼠雌激素水平、血鈣水平、ALP水平、CTX水平采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗法，骨組織切片成骨細胞、破骨細胞面積、體積比采用Image-Pro Plus軟件分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 大鼠血清指標檢測結果

檢測大鼠CTX、雌激素、血鈣和ALP水平發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，Model組和HUC-MSCs組大鼠雌激素水平(t=15.556，P<0.001；t=12.502，P<0.001)、血鈣水平(t=15.071，P<0.001；t=5.211，P<0.001)和ALP水平(t=3.721，P=0.006；t=2.357，P=0.046)均降低，差異均有統(tǒng)計學意義，CTX水平(t=6.417，P<0.001；t=2.407，P=0.043)升高，差異有統(tǒng)計學意義；相比Model組，HUC-MSCs組大鼠血鈣水平(t=6.620，P<0.001)和ALP水平(t=4.150，P=0.002)均升高，差異有統(tǒng)計學意義，CTX水平(t=4.895，P=0.001)降低，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

A為雌激素水平檢測結果；B為血鈣水平檢測結果；C為ALP水平檢測結果；D為CTX水平檢測結果；與Sham組相比，＊＊P<0.05；與Model組相比，##P<0.05。

3.2 大鼠骨組織檢測結果

檢測各組大鼠骨組織情況發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，Model組和HUC-MSCs組大鼠BMD水平(t=11.530，P<0.001；t=3.116，P=0.014)、Tb.N水平(t=19.750，P<0.001；t=5.757，P<0.001)、Tb.Th水平(t=7.800，P<0.001；t=3.004，P=0.017)均降低，差異均有統(tǒng)計學意義，Tb.Sp水平(t=22.577，P<0.001；t=8.016，P<0.001)升高，差異有統(tǒng)計學意義；相比Model組，HUC-MSCs組大鼠BMD水平(t=6.142，P<0.001)、Tb.N水平(t=10.898，P<0.001)、Tb.Th水平(t=4.000，P=0.004)均升高，差異有統(tǒng)計學意義，Tb.Sp水平(t=16.775，P<0.001)降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

A為BMD檢測結果；B為Tb.N檢測結果；C為Tb.Th檢測結果；D為Tb.Sp檢測結果；與Sham組相比，＊＊P<0.05；與Model組相比，##P<0.05。

3.3 大鼠骨組織染色結果

通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)Sham組破骨細胞較少、單位長度內(nèi)破骨細胞數(shù)量較少，Model組和HUC-MSCs組破骨細胞較多、單位長度內(nèi)破骨細胞數(shù)量較多且骨小梁周長較長，見圖3。

A為Sham組；B為Model組；C為HUC-MSCs組。

3.4 大鼠成骨/破骨細胞表面與骨表面積比例檢測結果

檢測各組大鼠成骨細胞和破骨細胞與骨面積比例發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，Model組和HUC-MSCs組大鼠Ocs/BS值(t=4.581，P=0.002；t=2.530，P=0.035)升高，差異有統(tǒng)計學意義，Obs/BS值(t=5.459，P=0.001；t=2.339，P=0.047)降低，差異有統(tǒng)計學意義；相比Model組，HUC-MSCs組大鼠Ocs/BS值(t=2.530，P=0.035)降低，差異有統(tǒng)計學意義，Obs/BS值(t=3.794，P=0.005)升高，差異有統(tǒng)計學意義，見圖4。

A為成骨細胞表面積與骨表面積比例值；B為破骨細胞表面積與骨表面積比例值；與Sham組相比，＊＊P<0.05；與Model組相比，##P<0.05。

3.5 大鼠骨組織Wnt/β-catenin/Runx2通路蛋白檢測結果

檢測各組大鼠骨組織Wnt/β-catenin/Runx2通路蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，Model組和HUC-MSCs組大鼠β-catenin蛋白(t=15.531，P<0.001；t=4.437，P=0.002)和Runx2蛋白(t=12.750，P<0.001；t=2.923，P=0.019)相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義；相比Model組，HUC-MSCs組大鼠β-catenin蛋白(t=9.035，P<0.001)和Runx2蛋白(t=14.484，P<0.001)相對表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

A為Sham組；B為Model組；C為HUC-MSCs組；左圖為蛋白質印跡圖，右圖為相對表達量柱狀圖；與Sham組相比，＊＊P<0.05；與Model組相比，##P<0.05。

4 討 論

OP的發(fā)生與骨代謝紊亂密切相關，正常情況下成骨細胞和破骨細胞存在一定的平衡，成骨細胞主要調(diào)節(jié)骨形成，破骨細胞控制骨吸收[10]。當成骨細胞活性弱于破骨細胞則會使得骨組織吸收量大于形成量。最終導致骨小梁結構稀疏、骨小梁分離度較大、骨骼脆弱、BMD下降等[11]。OP常發(fā)于絕經(jīng)后的女性，當女性絕經(jīng)后卵巢功能減退，會使得骨代謝紊亂，導致破骨細胞活性增強，加速骨小梁的吸收同時會抑制成骨細胞的活性使得骨形成速度緩慢，導致骨量丟失，最終導致OP[12]?；诖吮狙芯渴褂们谐笫箅p側卵巢構建OP大鼠模型。本研究使用HUC-MSCs作用OP大鼠模型，檢測大鼠血清骨代謝指標以及大鼠骨組織狀況以期探究HUC-MSCs對OP的作用效果，同時檢測了與OP密切相關的Wnt/β-catenin/Runx2通路蛋白表達，初步探究HUC-MSCs改善OP癥狀可能涉及的分子機制。

骨代謝有較多的血清學指標，其中常見的有血鈣、血磷、CTX、ALP等[13]。其中CTX是骨形成和骨吸收的重要指標之一。人體的鈣元素可以是骨鈣和血鈣，血鈣降低，說明人體組織中的鈣總量下降[14]。ALP是成骨細胞早期特異性標志物，在成骨過程中能水解磷酸酯和焦磷酸鹽活性，有利于骨礦化，促進骨形成[15]。ALP會隨著骨組織中成骨細胞的分化的增多，ALP的表達也隨之增強[16]。成骨吸收過程中破骨細胞會釋放CTX，CXT水平升高說明骨細胞被吸收使得骨量降低，可以作為OP的重要參考指標。本研究檢測了各組大鼠雌激素水平、血鈣水平和ALP水平發(fā)現(xiàn)，相比Sham組，Model組大鼠Model組大鼠雌激素水平、血鈣水平和ALP水平均顯著降低，CTX水平顯著升高。使用HUC-MSCs作用后雌激素水平、血鈣水平和ALP水平均顯著升高，CTX水平顯著降低。說明HUC-MSCs作用可以顯著改善大鼠OP癥狀。除了血清指標外骨小梁在OP的發(fā)展中起著重要的作用，通常情況下OP患者會出現(xiàn)骨質量降低、骨小梁數(shù)量減少、厚度變薄、骨小梁之間的間隙變大。本研究也檢測了骨小梁相關指標發(fā)現(xiàn)相比Sham組，Model組大鼠BMD、Tb.N、Tb.Th水平均顯著降低，Tb.Sp水平顯著升高，使用HUC-MSCs所用后BMD、Tb.N、Tb.Th水平均顯著升高，Tb.Sp水平顯著降低。這表明HUC-MSCs可以有效增加大鼠骨組織中骨小梁的數(shù)目和密度來改善大鼠OP癥狀。

成骨細胞和破骨細胞是骨具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，成骨細胞主要負責骨基質的合成是骨形成的主要細胞。破骨細胞內(nèi)，無機質被降解，骨組織以鈣離子的形式排入血流中是骨吸收的主要功能細胞[17]。當體內(nèi)成骨細胞活性降低破骨細胞活性升高會使得骨形成能力不足及功能減退，成骨細胞數(shù)量減少，骨量減少，進而發(fā)展成OP[18]。本研究檢測了成骨細胞和破骨細胞狀況發(fā)現(xiàn)相比Sham組，Model組大鼠Ocs/BS值顯著升高，Obs/BS值顯著降低，使用HUC-MSCs作用后Ocs/BS值顯著降低，Obs/BS值顯著升高。說明使用HUC-MSCs可以增加成骨細胞的數(shù)量，降低破骨細胞數(shù)量，使得骨組織向合成方向進展。這可能是因為骨髓具有較好的分化潛力，可以分化為成骨細胞，改善大鼠OP癥狀。

Wnt/β-catenin/Runx2通路在骨代謝中起著重要的作用[19]。當Wnt信號被激活時β-catenin會發(fā)生磷酸化并進入細胞核，激活下游的信號因子Runx2。Runx2是Runx家族的重要成員之一，在骨代謝中是一種骨組織特異性轉錄因子[20]。當Runx2含量減少時，會使得成骨組織中的成骨細胞的活性和分化均受到抑制，除此之外Runx2還會促進Ⅰ型膠原合成，提高ALP、血清骨鈣素和I型原骨膠原氨基酸前肽的水平，使得成骨細胞活性增強加速骨組織的積累[21]。本研究采用WB檢測了大鼠骨組織中β-catenin和Runx2蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠β-catenin和Runx2蛋白相對表達水平顯著降低，使用HUC-MSCs干預后大鼠β-catenin和Runx2蛋白相對表達水平顯著升高。這說明HUC-MSCs可以有效通過激活Wnt/β-catenin/Runx2通路，增強成骨細胞的活性使得大鼠OP癥狀得到了顯著的改善。

綜上所述，HUC-MSCs可以有效改善大鼠OP，其作用機制可能通過抑制破骨細胞活性并促進成骨細胞活性有關，同時HUC-MSCs改善OP癥狀與Wnt/β-catenin/Runx2信號通路也有密切關系。