沈 磊 李明霞 彭 湃 周軍格 楊 軍 （長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院麻醉科，武漢 430000）

腦缺氧缺血可引起廣泛的生物反應(yīng)，包括去極化、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致神經(jīng)變性［1］。依托咪酯是一種常用的靜脈麻醉劑，可在麻醉期間保持良好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道，依托咪酯在非小細(xì)胞肺癌等癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用［2］。最近有報(bào)道稱，依托咪酯具有神經(jīng)保護(hù)作用。依托咪酯通過(guò)抗凋亡、抗氧化作用改善過(guò)氧化氫刺激的PC12細(xì)胞損傷，或減少細(xì)胞死亡對(duì)抗神經(jīng)元缺氧損傷［3-4］。然而，依托咪酯是否會(huì)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞產(chǎn)生有益作用仍有待闡明。依托咪酯麻醉會(huì)在心血管中誘導(dǎo)不同的微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)，如miR-129-5p、miR-105、miR-324-3p 等［5］。研究顯示，miR-142-3p 對(duì)腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。然而miR-142-3p對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷及依托咪酯能否通過(guò)調(diào)控miR-142-3p 減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷尚不明確。本研究旨在探究依托咪酯對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡和炎癥損傷的保護(hù)作用，并以miR-142-3p為切入點(diǎn)，闡明其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；依托咪酯（>98%）、CCK-8試劑（美國(guó)Sigma-Aldrich）；Lipofectamine 3000、TRIzol 試劑、TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen）；miR-con、miR-142-3p 模擬物、anti-miR-con、miR-142-3p 抑制物（antimiR-142-3p）（上海吉瑪）；抗細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）一抗、抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-caspase-3）一抗、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（美國(guó)Abcam）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA 緩沖液、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL Plus試劑盒（上海碧云天）；SYBR Green Universal qPCR Master Mix（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧損傷 采用含10%胎牛血清、37 ℃、含5%CO2、95%空氣的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12 細(xì)胞。缺氧損傷時(shí)，將PC12 細(xì)胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h［7］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將PC12 細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、缺氧組（缺氧處理24 h）、缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組（2、6、12 μmol/L 依托咪酯干預(yù)24 h 后，行缺氧處理）、miR-con+缺氧組（轉(zhuǎn)染miR-con 后，行缺氧處理24 h）、miR-142-3p+缺氧組（轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物后，行缺氧處理24 h）、antimiR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯組（轉(zhuǎn)染antimiR-con 后，12 μmol/L 依托咪酯干預(yù)24 h，再行缺氧處理24 h）、anti-miR-142-3p+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯組（轉(zhuǎn)染anti-miR-142-3p后，12 μmol/L依托咪酯干預(yù)24 h，再行缺氧處理24 h）。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 于96 孔板（2.5×104個(gè)/孔）培養(yǎng)細(xì)胞4 h，按照1.2.2 分組處理后，加入CCK-8（10 μl/孔）孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm 處吸光度（A）值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 于6孔板（1.0×105個(gè)/孔）培養(yǎng)細(xì)胞4 h，按照1.2.2 分組處理后收集各組細(xì)胞，利用Annexin-V-FITC/PI 試劑盒，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá) 于6 孔板（1.0×105個(gè)/孔）培養(yǎng)細(xì)胞4 h，按照1.2.2 分組處理后，收集各組細(xì)胞。RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，10%SDS-PAGE 分離總蛋白，并轉(zhuǎn)膜、封閉。分別于CyclinD1（1∶1 000）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗中4 ℃孵育12 h，洗膜，再于二抗中37 ℃孵育2 h。顯影，曝光，Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析。

1.2.6 ELISA 檢 測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6 水 平 于6孔板（1.0×105個(gè)/孔）培養(yǎng)細(xì)胞4 h，按照1.2.2分組處理后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，350 g 離心10 min。取上清液，ELISA 試劑盒測(cè)定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.7 RT-qPCR 檢測(cè)miR-142-3p 表達(dá) 于6 孔板（1.0×105個(gè)/孔）培養(yǎng)細(xì)胞4 h，按照1.2.2 分組處理后，收集各組細(xì)胞。TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR 擴(kuò)增。miR-142-3p 正向引物：5'-GCTCGACAAGGCTCGTTATGAA-3'，反向引物：5'-CCTTTGATTTTTGGGGCGGTA-3'；U6（對(duì)照）正向引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向引物：5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-142-3p相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件分析數(shù)據(jù)。以±s表示計(jì)量資料。采用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)，SNK-q檢驗(yàn)行組內(nèi)比較；獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間數(shù)據(jù)差異性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞活性及凋亡的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組PC12 細(xì)胞活性降低，凋亡率升高（P<0.05）。與缺氧組比較，缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組PC12 細(xì)胞活性呈增強(qiáng)趨勢(shì)，細(xì)胞凋亡率呈降低趨勢(shì)（P<0.05，圖1、表1）。

表1 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞活性及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of etomidate on activity and apoptosis of PC12 cells under hypoxia （±s，n=9）

表1 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞活性及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of etomidate on activity and apoptosis of PC12 cells under hypoxia （±s，n=9）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxia group， 2）P<0.05.

A value 1.056±0.10 0.513±0.051）0.679±0.062）0.825±0.082）0.902±0.092）63.768 0.000 Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate FP Apoptosis rate/%4.32±0.38 24.53±2.041）20.35±1.912）12.38±1.272）6.68±0.612）340.142 0.000

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.1 Detection of apoptosis by flow cytometry

2.2 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞中有關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組CyclinD1 蛋白表達(dá)量降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。與缺氧組比較，缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組CyclinD1 蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì)，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量呈降低趨勢(shì)（P<0.05，圖2、表2）。

表2 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of etomidate on expressions of CyclinD1 and Cleaved-caspase-3 protein in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxia group， 2）P<0.05.

Cleaved-caspase-3 0.24±0.03 0.75±0.071）0.62±0.062）0.45±0.042）0.32±0.032）166.878 0.000 Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate F P CyclinD1 0.86±0.07 0.41±0.041）0.61±0.062）0.75±0.072）0.90±0.092）90.977 0.000

圖2 Western blot 檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of CyclinD1 and Cleaved-caspase-3 protein detected by Western blot

2.3 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，缺氧組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P<0.05）。與缺氧組比較，缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈降低趨勢(shì)（P<0.05，表3）。

表3 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9，ng/L）Tab.3 Effects of etomidate on expressions of inflammatory factors in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9，ng/L）

表3 依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9，ng/L）Tab.3 Effects of etomidate on expressions of inflammatory factors in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxiagroup， 2）P<0.05.

Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate TNF-α 25.02±2.27 104.02±9.561）IL-1β 81.64±7.61 456.31±41.021）IL-6 12.17±1.14 64.58±6.111）81.17±7.522）384.97±33.142）48.67±4.282）60.53±5.242）254.67±22.132）32.61±2.942）42.19±3.912）147.84±12.572）19.54±1.512）FP 302.733 0.000 223.663 0.000 317.655 0.000

2.4 依托咪酯對(duì)miR-142-3p 表達(dá)的影響 對(duì)照組、缺氧組、缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組miR-142-3p 表達(dá)量分別為1.00±0.11、0.43±0.04、0.61±0.06、0.79±0.07、0.89±0.09。與對(duì)照組比較，缺氧組miR-142-3p 表達(dá)量減少（P<0.05）。與缺氧組比較，缺氧+不同劑量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯組miR-142-3p表達(dá)量呈增加趨勢(shì)（P<0.05）。

2.5 miR-142-3p 對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞活性、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響 miR-142-3p+缺氧組PC12 細(xì)胞miR-142-3p 表達(dá)量、細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)量較miR-con+缺氧組升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平、細(xì)胞凋亡率較miR-con+缺氧組降低（P<0.05，表4、圖3）。

表4 上調(diào)miR-142-3p對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞活性、凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of up-regulation of miR-142-3p on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

表4 上調(diào)miR-142-3p對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞活性、凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of up-regulation of miR-142-3p on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with miR-con+hypoxia group， 1）P<0.05.

A value 0.516±0.05 1.013±0.091）14.482 0.000 Groups miR-con+hypoxia miR-142-3p+hypoxia t P miR-142-3p 1.00±0.10 2.53±0.221）18.994 0.000 CyclinD1 0.42±0.04 0.88±0.081）15.429 0.000 Cleavedcaspase-3 0.76±0.07 0.37±0.031）15.363 0.000 TNF-α/（ng·L-1）105.11±9.25 30.94±2.341）23.321 0.000 IL-1β/（ng·L-1）455.61±41.02 95.56±9.161）25.699 0.000 IL-6/（ng·L-1）64.21±6.17 13.54±1.061）24.281 0.000 Apoptosis rate/%24.84±2.08 5.43±0.511）27.190 0.000

圖3 上調(diào)miR-142-3p對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of up-regulation of miR-142-3p on apoptosis of PC12 cells under hypoxia and expressions of related proteins

2.6 下調(diào)miR-142-3p 逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12 細(xì)胞活性、凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響 antimiR-142-3p+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯組miR-142-3p表達(dá)量、細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)量低于antimiR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯組，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平及細(xì)胞凋亡率均高于anti-miR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯組（P<0.05，圖4、表5）。

表5 下調(diào)miR-142-3p逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞活性、凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-142-3p reverses effects of etomidate on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

表5 下調(diào)miR-142-3p逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)缺氧處理的PC12細(xì)胞活性、凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-142-3p reverses effects of etomidate on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-con+hypoxia+12 μmol/L etomidate group，1）P<0.05.

Groups anti-miR-con+hypoxia+12 μmol/L etomidate anti-miR-142-3p+hypoxia+12 μmol/L etomidate miR-142-3p CyclinD1 IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）A value 1.00±0.10 0.91±0.09 Cleavedcaspase-3 0.33±0.03 TNF-α/（ng·L-1）42.02±3.86 147.39±11.94 19.47±1.64 Apoptosis rate/%6.61±0.65 0.910±0.09 0.537±0.051）10.869 0.000 t P 0.48±0.041）14.484 0.000 0.45±0.041）14.012 0.000 0.71±0.071）14.969 0.000 94.13±8.531）16.697 0.000 421.57±40.011）19.700 0.000 67.94±5.971）23.487 0.000 23.18±1.991）23.745 0.000

3 討論

缺氧可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度炎癥反應(yīng)，分泌大量炎癥因子，造成神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷，這些炎癥因子進(jìn)一步刺激神經(jīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡對(duì)治療腦缺氧十分關(guān)鍵［8-9］。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12 高度分化后，具有神經(jīng)細(xì)胞特性，常用作神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)化學(xué)研究的模型細(xì)胞［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡增加，且炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌量增加，表明缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型建立成功。

依托咪酯是一種常用的催眠和靜脈麻醉劑，其還具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡作用。例如，SUN 等［11］發(fā)現(xiàn)依托咪酯可抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中IL-1β 和TNF-α 表達(dá)；LV 等［12］報(bào)道依托咪酯通過(guò)降低炎癥標(biāo)志物IL-6、IL-1β 和TNF-α 分泌防止心肌缺血再灌注損傷；ZOU 等［13］報(bào)道稱，依托咪酯處理可通過(guò)降低TNF-α、IL-1β 表達(dá)、減少凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量緩解大鼠肢體缺血再灌注引起的肺損傷。本研究結(jié)果顯示，依托咪酯劑量依賴性地提高缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡，并降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，表明依托咪酯可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷。

miRNA 參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生理、病理過(guò)程，可作為腦缺氧損傷治療的分子靶點(diǎn)［14］。研究顯示，miR-142-3p 在腦缺血再灌注小鼠大腦皮層和氧糖剝奪誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)增加［15］；在培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，miR-142-3p 模擬物通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡增強(qiáng)細(xì)胞活力［16］。本研究結(jié)果顯示，miR-142-3p在缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)miR-142-3p 可抑制缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)，提示miR-142-3p可作為減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的分子靶點(diǎn)。WU 等［17］報(bào)道表明，麻醉劑右美托咪定通過(guò)調(diào)節(jié)miR-199a 保護(hù)PC12 細(xì)胞免受氧化損傷。本研究顯示，依托咪酯上調(diào)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-142-3p 表達(dá)，而下調(diào)miR-142-3p 可逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活性、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響，提示其可能通過(guò)上調(diào)miR-142-3p 減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

總之，依托咪酯通過(guò)上調(diào)miR-142-3p 表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用。這可能為改善缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷開(kāi)辟新視野。