李林瑋，毛亞浩，余 君，陳 雄，楊春雷，姚 蘭

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北 武漢 430030）

雪茄是一種卷煙制品，具有獨(dú)特的香氣，由茄衣、茄套、茄芯3 部分組成，其中茄芯是雪茄的主體部分，對(duì)吸食的風(fēng)味特征起主導(dǎo)作用[1]。發(fā)酵是提高雪茄煙葉品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，而在這一過程中微生物發(fā)揮著重要作用。經(jīng)過發(fā)酵的煙葉刺激性大大降低，香氣也更加突出[2-3]。煙葉發(fā)酵方式分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，自然發(fā)酵時(shí)間較長、成本也高[4]。研究表明，在煙葉發(fā)酵過程中人工添加微生物能縮短發(fā)酵時(shí)間，增加香氣，改善煙葉品質(zhì)[5]。因此在雪茄煙葉中添加微生物進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)提高雪茄的品質(zhì)具有重要的意義。

大量研究表明，微生物在煙葉發(fā)酵中應(yīng)用廣泛，且在改善煙葉品質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。 李寧等[9]將蠟樣芽孢桿菌添加到雪茄煙葉表面進(jìn)行人工發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)煙葉含氮化合物含量顯著降低，煙葉刺激性和勁頭明顯得到改善，香氣增加。黃申等[10]將嗜麥芽窄食單胞菌制成菌劑后加入煙葉中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后煙葉香氣質(zhì)有所提升。蔡文等[11]在煙葉中添加具有產(chǎn)蛋白酶能力的高斯芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)煙葉的刺激性、雜氣降低，香氣增加。薛云等[12]采用芽孢桿菌ZZ-8 固態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理煙葉，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的煙葉香氣質(zhì)有所提升，刺激性、雜氣降低，吸食品質(zhì)提高。

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)煙葉的研究不僅僅局限于添加微生物探究煙葉品質(zhì)的變化上，還包括利用宏基因組學(xué)進(jìn)一步分析煙葉中的微生物多樣性[13-14]。張鴿等[6]對(duì)雪茄外包皮煙葉表面細(xì)菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落演替由發(fā)酵前的棒狀桿菌屬、假單胞菌屬變?yōu)榘l(fā)酵后期的葡萄球菌屬。張磊等[15]通過對(duì)雪茄煙葉不同發(fā)酵階段微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌、四鏈球菌為煙葉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。細(xì)菌作為雪茄煙葉中主要的微生物種類，在煙葉發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用[16]。鄭霖霖等[17]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和真菌的多樣性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈降低趨勢(shì)，葡萄球菌和曲霉屬為雪茄茄芯煙葉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。鄭天飛等[18]通過高通量測(cè)序?qū)Σ煌a(chǎn)地的雪茄煙葉微生物群落進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的雪茄煙葉表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為葡萄球菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌，優(yōu)勢(shì)真菌屬為曲霉。

基于外源微生物在發(fā)酵雪茄煙葉品質(zhì)形成過程中的重要影響，研究以前期篩選得到的一株可產(chǎn)蛋白質(zhì)酶、淀粉酶和木質(zhì)素酶的巨大芽孢桿菌為材料，將其與營養(yǎng)物質(zhì)一同添加到茄芯煙葉中進(jìn)行發(fā)酵，探究其對(duì)雪茄煙葉主要化學(xué)成分、感官品質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為人工添加微生物發(fā)酵，提升茄芯煙葉的發(fā)酵品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以湖北恩施州晾制結(jié)束的CX-014 雪茄茄芯中部煙葉為供試煙葉。供試菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium） m1。

主要試劑有胰蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）、酵母粉（蘇州嘉葉生物科技有限公司），其余試劑均來自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器設(shè)備有恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津歐諾儀器儀表有限公司）、冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）、高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.2～7.4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雪茄煙葉箱式發(fā)酵 參照李磊[19]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，取7.5 kg 煙葉回潮至水分含量為30%，將Bacillus megateriumm1 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，離心取菌體。將菌體（按煙葉重量添加10%的菌體）與營養(yǎng)液（1%谷氨酸、2%葡萄糖）混合后，用霧化小噴壺均勻噴灑在煙葉上，平衡水分后裝入紙箱中，設(shè)置自然發(fā)酵（只加水，Y2）和Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液（Y6）2 個(gè)箱式發(fā)酵處理，發(fā)酵前的煙葉記為Y0。在煙葉中心放置溫度探頭，設(shè)置濕度為80%，初始溫度為30℃，當(dāng)煙葉中心溫度達(dá)到設(shè)定溫度后，恒溫恒濕箱溫度以2℃的速度依次遞增，當(dāng)煙葉中心溫度達(dá)到45℃時(shí)翻堆，翻堆2 次后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2 煙草常規(guī)化學(xué)成分的測(cè)定 水溶性總糖及還原糖參照YC/T 159—2002 進(jìn)行測(cè)定，總植物堿參照YC/T 160—2002 進(jìn)行測(cè)定，總氮參照YC/T 161—2002 進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 感官評(píng)價(jià) 參照YC/T 415—2011 進(jìn)行煙葉感官評(píng)價(jià)。將煙葉樣品送至湖北省煙草科學(xué)研究院，由評(píng)吸專家以盲評(píng)的方式采用10 分制評(píng)吸方法對(duì)煙葉刺激性、苦感、雜氣、烤香和木香等5 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，各指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 雪茄煙葉感官評(píng)價(jià)各指標(biāo)評(píng)分要求

1.2.4 雪茄煙葉表面微生物的收集 取10 g 煙葉樣品剪切成段，使其與液體充分接觸；將其置于80 mL 無菌蒸餾水中，室溫靜置15 min，5 000 r/min 離心10 s，渦旋90 s，5 000 r/min 離心1 min，去除葉片殘留；將樣品在10 000 r/min 下離心10 min，收集微生物細(xì)胞；然后用洗滌緩沖液（100 mmol/L 的Tris-HCl，50 mmol/L 的EDTA-Na2，20 g/L 的聚乙烯吡咯烷酮，1 mL/L 的吐溫－20，1.4 mol/L 的NaCl，pH值為8）洗滌細(xì)胞顆粒；室溫旋轉(zhuǎn)45 s，65℃水浴5 min，6 000 r/min 離心6 min；重復(fù)洗滌直至上清液幾乎無色，然后收集微生物細(xì)胞。建議沉淀的量在200 mg 以上。微生物沉淀用液氮速凍20 min 以上，然后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中保存。

1.2.5 DNA 提取建庫及宏基因組測(cè)序 收集好的微生物菌體沉淀送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行DNA 提取建庫以及后續(xù)的宏基因組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行，采用Origin 2019 軟件進(jìn)行分析作圖、美吉生信云在線平臺(tái)進(jìn)行微生物多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus megaterium m1 對(duì)雪茄煙葉化學(xué)成分及感官品質(zhì)的影響

從圖1 可以看出，煙堿、還原糖、總糖、總氮含量在發(fā)酵后均呈下降趨勢(shì)，相比于自然發(fā)酵前，自然發(fā)酵后4 種物質(zhì)的含量分別降低了8.55%、24.82%、14.29%、7.03%； 而Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后4 種物質(zhì)分別比發(fā)酵前下降了17.31%、71.64%、55.81%、10.61%；與自然發(fā)酵相比，添加巨大芽孢桿菌和營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵后，雪茄煙葉中煙堿、還原糖、總糖含量分別降低了9.58%、9.52%、9.53%；這說明Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵在一定程度上改善了雪茄煙葉的品質(zhì)。

圖1 雪茄煙葉發(fā)酵前后煙葉化學(xué)成分的變化

由圖2 可知，發(fā)酵前雪茄煙葉刺激性較大，苦味明顯，雜氣重，烤香和木香都不突出，而經(jīng)過自然發(fā)酵和Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后感官評(píng)價(jià)各指標(biāo)均有了明顯改善。相比于自然發(fā)酵，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后，雪茄煙葉刺激性進(jìn)一步降低，苦味、雜氣明顯改善，烤香、木香等香味得到提升。這說明經(jīng)過Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵后，煙葉的刺激性、雜氣、苦感等顯著降低，煙葉品質(zhì)明顯提高。

圖2 雪茄煙葉發(fā)酵前后的感官評(píng)價(jià)

2.2 雪茄煙葉化學(xué)成分與感官評(píng)定相關(guān)性程度分析

為進(jìn)一步研究雪茄煙葉化學(xué)成分與感官評(píng)定指標(biāo)間的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)程度分析，結(jié)果如圖3所示。煙葉中煙堿、總糖、總氮含量與苦感、雜氣、刺激性均呈正相關(guān)，還原糖、總糖、總氮含量與烤香和木香均呈負(fù)相關(guān)。這種成分含量與感官指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系正好解釋了Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后，還原糖、總糖、煙堿、總氮含量降低，煙葉感官品質(zhì)明顯改善的試驗(yàn)結(jié)果。

圖3 雪茄煙葉化學(xué)成分與感官評(píng)定的相關(guān)程度分析

2.3 Bacillus megaterium m1 對(duì)雪茄煙葉表面細(xì)菌群落影響

2.3.1 細(xì)菌α 多樣性分析 多樣性可以用來反映物種組成的多樣性和豐富度。雪茄煙葉表面細(xì)菌多樣性指數(shù)如表2 所示，與Y0（發(fā)酵前煙葉）相比，Y2（自然發(fā)酵后煙葉）的細(xì)菌多樣性和物種組成存在較大差異。Chao 指數(shù)通常用來估計(jì)物種總數(shù)，自然發(fā)酵后煙葉的物種總數(shù)顯著降低（從發(fā)酵前13 432.33 降至發(fā)酵后4 880.33）。Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)常用來估計(jì)樣本中微生物的多樣性，Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高。表2 的結(jié)果顯示，與發(fā)酵前相比，自然發(fā)酵煙葉的Simpson 指數(shù)顯著上升，從發(fā)酵前的0.02 上升至0.56，Shannon指數(shù)明顯降低，從發(fā)酵前的5.47 下降至1.47，這說明經(jīng)過自然發(fā)酵后，煙葉表面細(xì)菌多樣性顯著降低；而相較于自然發(fā)酵后的雪茄煙葉，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后雪茄煙葉的Chao 指數(shù)顯著降低，Shannon 指數(shù)有所降低，而Simpson指數(shù)稍微升高，表明煙葉表面的細(xì)菌多樣性有所降低，這意味著Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液可能在一定程度上加速了細(xì)菌群落的自然演替進(jìn)程。

表2 雪茄煙葉表面細(xì)菌群落α 多樣性分析

2.3.2 細(xì)菌OTU 分析 雪茄煙葉發(fā)酵過程中表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，由圖4 可知，門水平上，發(fā)酵前煙葉（Y0）表面有109 個(gè)OTU，屬水平上有2 378 個(gè)OTU，而自然發(fā)酵后煙葉（Y2）在門水平僅有29 個(gè)OTU，屬水平為1 137 個(gè)OTU，其中發(fā)酵前屬水平上特有的細(xì)菌OTU 有1 265 個(gè)，自然發(fā)酵后僅為24 個(gè)OTU。圖5 為自然發(fā)酵后煙葉與Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉（Y6）表面細(xì)菌多樣性的韋恩圖，由圖5 可知，與自然發(fā)酵后煙葉相比，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉表面細(xì)菌門水平和屬水平上細(xì)菌OTU 均顯著降低，門水平上只有22 個(gè)OTU，屬水平上為739個(gè)OUT，其中自然發(fā)酵后煙葉門水平上特有的細(xì)菌OTU 為 9 個(gè)，屬水平上有442 個(gè)，而經(jīng)過Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后門水平上特有的細(xì)菌OTU 僅為2 個(gè)，屬水平上為44 個(gè) 。

圖4 基于門水平（A）和屬水平（B）自然發(fā)酵細(xì)菌OTU 分布的韋恩圖

圖5 基于門水平（A）和屬水平（B）不同發(fā)酵后細(xì)菌OTU 分布的韋恩圖

綜上所述，雪茄煙葉的發(fā)酵進(jìn)程可能與其表面細(xì)菌群落演替存在一定的相關(guān)性。與發(fā)酵前相比，自然發(fā)酵后雪茄煙葉表面細(xì)菌多樣性顯著降低，而在添加Bacillus megateriumm1 和營養(yǎng)液發(fā)酵后，細(xì)菌多樣性又進(jìn)一步降低，說明Bacillus megateriumm1加營養(yǎng)液發(fā)酵可能在一定程度加速了雪茄煙葉表面細(xì)菌群落的演替進(jìn)程，這與雪茄煙葉表面細(xì)菌群落 多樣性分析的結(jié)果一致。

2.3.3 細(xì)菌群落組成分析 雪茄煙葉表面細(xì)菌群落相對(duì)豐度的變化如圖6、圖7 所示。從門水平（圖6）來看，發(fā)酵前煙葉（Y0）表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），自然發(fā)酵后煙葉（Y2）以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其相對(duì)豐度可達(dá)到93.36%，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉（Y6）表面的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌也是厚壁菌門（Firmicutes），相對(duì)豐度可達(dá)到97.40%。從屬水平（圖7）來看，發(fā)酵前雪茄煙葉表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Aureimonas、假單胞菌屬（Pseudomonas）等，自然發(fā)酵后煙葉表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬發(fā)生了顯著變化，葡萄球菌屬（Staphylococcus）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)91.59%，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬也為葡萄球菌屬（Staphylococcus），相對(duì)豐度達(dá)95.55%，而發(fā)酵前相對(duì)豐度較高的鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬等發(fā)酵后相對(duì)豐度均下降。這說明雪茄煙葉發(fā)酵后，葡萄球菌屬會(huì)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其可能與雪茄煙葉的發(fā)酵進(jìn)程密切相關(guān)。但相比于自然發(fā)酵，人工添加Bacillus megateriumm1 和營養(yǎng)液會(huì)在一定程度上加速煙葉表面細(xì)菌的群落演替，從而促進(jìn)雪茄煙葉發(fā)酵進(jìn)程。

圖6 不同雪茄煙葉表面門水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度

圖7 不同雪茄煙葉表面屬水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度

細(xì)菌群落互作關(guān)系分析結(jié)果（圖8）表明，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落之間存在著顯著的相互作用。相對(duì)豐度較高的葡萄球菌屬（Staphylococcus）與其余菌屬均呈負(fù)相關(guān)，而其余菌屬間均呈正相關(guān)。這說明在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落除葡萄球菌屬外，其余菌屬間為共生關(guān)系，葡萄球菌與其余菌屬為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。這可能是因?yàn)槠咸亚蚓苓m應(yīng)煙葉表面的環(huán)境，從而更好地利用雪茄煙葉中的營養(yǎng)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)快速生長，同時(shí)這也解釋了葡萄球菌屬細(xì)菌在雪茄煙葉發(fā)酵過程中相對(duì)豐度顯著增加，發(fā)酵后成為雪茄煙葉表面絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物的原因。通過雪茄煙葉細(xì)菌群落（屬水平）與KEGG 功能貢獻(xiàn)度分析結(jié)果（圖9）可以看出，在屬水平上豐度排名前十的物種中，發(fā)酵前煙葉（Y0）中對(duì)次級(jí)代謝物的生物合成、不同環(huán)境微生物的代謝、氨基酸的生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)等功能途徑貢獻(xiàn)度較高的細(xì)菌屬主要為鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬。而自然發(fā)酵后煙葉（Y2）和Bacillus megateriumm1加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉（Y6）中對(duì)功能途徑貢獻(xiàn)度較高的主要為葡萄球菌屬。與自然發(fā)酵后煙葉相比，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后煙葉中葡萄球菌屬的貢獻(xiàn)度較高，可達(dá)98%以上。這說明葡萄球菌在發(fā)酵過程中對(duì)雪茄煙葉內(nèi)部的功能途徑有著顯著影響，而這些功能途徑與雪茄煙葉的香氣產(chǎn)生可能有密切聯(lián)系；同時(shí)，也意味著加入Bacillus megateriumm1 和營養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)協(xié)同促進(jìn)雪茄煙葉的發(fā)酵進(jìn)程，進(jìn)而提高雪茄煙葉的品質(zhì)。

圖8 雪茄煙葉細(xì)菌群落互作關(guān)系分析

圖9 雪茄煙葉細(xì)菌群落與KEGG 功能貢獻(xiàn)度分析

2.3.4 細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析 為了確定雪茄煙葉細(xì)菌群落與化學(xué)成分和感官品質(zhì)之間的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析，結(jié)果見圖10。從圖10A 可以看出，葡萄球菌屬（Staphylococcus）與還原糖、總糖、煙堿呈顯著負(fù)相關(guān)，甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Auremonas、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）與其均呈顯著正相關(guān)。從圖10B 可以看出，葡萄球菌屬（Staphylococcus）與刺激性、雜氣、苦味等不良指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)，而甲基桿菌屬、Auremonas、鞘氨醇單胞菌屬與其均呈顯著正相關(guān)，葡萄球菌屬與烤香呈顯著正相關(guān)，其余菌屬與其呈負(fù)相關(guān)。這在一定程度也說明了在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落的演替，特別是葡萄球菌相對(duì)豐度的增加，對(duì)雪茄煙葉品質(zhì)的提高有重要的影響。

圖10 雪茄煙葉細(xì)菌群落與化學(xué)成分（A）及感官評(píng)價(jià)（B）的相關(guān)程度分析

3 討 論

雪茄煙葉主要化學(xué)成分包括還原糖、總糖、總氮、煙堿等指標(biāo)，其含量與煙葉的內(nèi)在質(zhì)量密切相關(guān)[20]。研究表明，煙葉中糖類物質(zhì)在燃吸過程中可適度平衡煙氣，使雪茄煙的吃味更加醇和，糖類物質(zhì)含量過高會(huì)破壞煙氣的協(xié)調(diào)與平衡，使得煙氣平淡無味[21]；含氮化合物含量過高，雪茄煙燃燒時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性堿性物質(zhì)，使煙氣的堿性和刺激性增強(qiáng)，進(jìn)而影響雪茄煙的品質(zhì)[22]；煙堿含量過高會(huì)影響雪茄煙的煙氣特征和安全性，適量的煙堿可以給吸食者帶來更好的體驗(yàn)感[23]。感官評(píng)定也是判斷雪茄煙發(fā)酵效果的重要指標(biāo)之一，是煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要手段和重要依據(jù)[24]。雪茄煙葉化學(xué)成分及感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵后煙葉的還原糖、總糖、總氮、煙堿含量下降幅度較大。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，相比于其他處理，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵處理的雪茄煙葉刺激性、苦味、雜氣等不良指標(biāo)得到明顯改善，烤香、木香等香味更突出，這可能是由于加入的營養(yǎng)液中含有葡萄糖和谷氨酸，而氨基酸和葡萄糖在一定條件下會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生致香物質(zhì)；另外，Bacillus megateriumm1 具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、木質(zhì)素酶的能力，能降解煙葉中的蛋白質(zhì)、淀粉、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，進(jìn)而改善煙葉品質(zhì)。毛多斌等[25]在煙葉中添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，煙葉的刺激性降低，香氣質(zhì)和香氣量明顯提高。Li 等[26]在雪茄煙葉中添加纖維素降解菌和營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酸）進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉香氣量顯著提升。這說明在雪茄煙葉發(fā)酵過程中添加外源微生物和營養(yǎng)物質(zhì)能顯著改善雪茄煙葉品質(zhì)。

為了進(jìn)一步探究Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液改善雪茄煙葉品質(zhì)的作用機(jī)制，分析了不同發(fā)酵處理前后雪茄煙葉表面的細(xì)菌多樣性。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，相比于發(fā)酵前，自然發(fā)酵和Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后雪茄煙葉表面的細(xì)菌多樣性和豐度均顯著降低，其中Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵處理的細(xì)菌多樣性和豐度下降幅度較大，說明Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液更有助于促進(jìn)雪茄煙葉表面細(xì)菌群落的演替，這與Liu 等[27]關(guān)于發(fā)酵前后微生物多樣性的研究結(jié)果基本一致。細(xì)菌群落組成結(jié)果表明，在門水平上，發(fā)酵前雪茄煙葉表面的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門主要為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，而在自然發(fā)酵后、Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后雪茄煙葉表面均以厚壁菌門為主，其中Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后厚壁菌門相對(duì)豐度較高，可達(dá)97.40%；在屬水平上，發(fā)酵前雪茄煙葉表面細(xì)菌種類較豐富，其優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬等，自然發(fā)酵后、Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后雪茄煙葉表面均以葡萄球菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其中Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后葡萄球菌屬的相對(duì)豐度較高，可達(dá)95.55%。這與葉長文等[28]通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后雪茄煙葉表面優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬的研究結(jié)果一致。

通過互作關(guān)系分析可知，葡萄球菌與其余菌屬均存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這也解釋了發(fā)酵后期葡萄球菌屬成為雪茄煙葉表面絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物的這一現(xiàn)象。細(xì)菌群落與KEGG 功能貢獻(xiàn)度分析發(fā)現(xiàn)，相比于其他處理，Bacillus megateriumm1 加營養(yǎng)液發(fā)酵后，雪茄煙葉表面的葡萄球菌屬微生物對(duì)豐度排名前5 的代謝途徑貢獻(xiàn)度均較高，可達(dá)到98%以上，說明葡萄球菌屬微生物對(duì)發(fā)酵過程中煙葉內(nèi)部的功能途徑有顯著影響，而煙葉內(nèi)部的功能途徑又與煙葉的香氣品質(zhì)及內(nèi)在質(zhì)量密切相關(guān)。這意味著加入Bacillus megateriumm1 和營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵在一定程度上可促進(jìn)雪茄煙葉細(xì)菌群落演替和發(fā)酵進(jìn)程，提高雪茄煙葉的品質(zhì)。Zhang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在雪茄煙葉表面接入不動(dòng)桿菌可促進(jìn)微生物演替和煙葉發(fā)酵進(jìn)程，縮短發(fā)酵時(shí)間。而該試驗(yàn)利用Bacillus megateriumm1 和營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵也取得了相似結(jié)果。

在細(xì)菌群落和功能分析的基礎(chǔ)上，對(duì)雪茄煙葉細(xì)菌群落與主要化學(xué)成分和感官品質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，葡萄球菌與還原糖、總糖、煙堿呈顯著負(fù)相關(guān)，與煙葉的雜氣、刺激性、苦味等不良指標(biāo)也顯著負(fù)相關(guān)。這進(jìn)一步說明在發(fā)酵過程中，葡萄球菌的相對(duì)豐度增加，可能對(duì)雪茄煙葉品質(zhì)的改善發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌會(huì)參與脂肪代謝，并產(chǎn)生大量的脂肪酸，脂肪酸可以進(jìn)一步降解形成醛類、甲基酮等香氣物質(zhì)，是煙葉香氣的主要來源[30-31]。國內(nèi)外關(guān)于葡萄球菌在食品領(lǐng)域的應(yīng)用已有大量報(bào)道，該菌有助于改善發(fā)酵食品的感官，包括顏色、香氣和味道[32]。Wang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，添加植物乳桿菌和葡萄球菌發(fā)酵后的肉飯中橙花醇、醛類和部分氨基酸含量顯著提高，發(fā)酵肉飯的風(fēng)味品質(zhì)得到明顯改善。Li 等[34]在奶酪中添加乳桿菌和葡萄球菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)奶酪中的蛋白質(zhì)、游離脂肪酸含量顯著增加，奶酪的風(fēng)味品質(zhì)明顯提升。但關(guān)于葡萄球菌在雪茄煙葉中應(yīng)用和發(fā)酵作用機(jī)制的研究鮮見報(bào)道，還有待進(jìn)一步研究。

總的來看，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中添加巨大芽孢桿菌和營養(yǎng)液協(xié)同發(fā)酵，可推動(dòng)雪茄煙葉發(fā)酵進(jìn)程，加速細(xì)菌群落演替，并明顯改善雪茄的香氣品質(zhì)和安全性，降低煙葉雜氣。