劉 勇，龔椿營，艾均文，薛 宏，何行健，賈超華，陳卓華，任立志

（湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南 長沙 410127）

蠶桑文化是中國文明的起點(diǎn)，至少已有4 000 a以上的歷史。家蠶作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲對(duì)人類文化、經(jīng)濟(jì)發(fā)展貢獻(xiàn)巨大。種桑養(yǎng)蠶至今仍是部分地區(qū)農(nóng)民的重要收入來源。然而生產(chǎn)上，家蠶始終受到細(xì)菌病、病毒病等的侵害，給農(nóng)戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[1]。其中，以家蠶核型多角體病毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV）引起的血液型膿病對(duì)蠶桑產(chǎn)業(yè)的威脅最大，其傳染性極強(qiáng)，一旦發(fā)病就難以控制[2]。目前，環(huán)境消毒仍是預(yù)防蠶桑病害的主要措施，但該防治方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，嚴(yán)重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展。在此背景下，學(xué)者們通過傳統(tǒng)雜交育種、分子標(biāo)記育種和轉(zhuǎn)基因育種等方式選育抗性品種來預(yù)防家蠶頻發(fā)性血液型膿病，雖然這種方式前期投入大、開發(fā)周期長，但是一旦成功選育出抗性品種，其經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益都是不可估量的[3]。因此，基于材料間所存在的抗性差異而進(jìn)行家蠶抗病基因篩選、抗病機(jī)制解析成為近年來蠶桑領(lǐng)域的熱門課題。

BmNPV 是一種環(huán)狀雙鏈DNA 的核型多角體病毒，具有包涵體衍生病毒（occlusion-derived virus，ODV）和出芽型病毒（budded virus，BV）2 種不同形式，侵染家蠶的方式包括ODV 引起的食下感染和BV 引起的創(chuàng)傷感染[3]。BmNPV 在家蠶體內(nèi)復(fù)制增殖是一個(gè)十分高效且復(fù)雜的過程。不同家蠶品種對(duì)BmNPV 的抵抗力水平差異較大，多數(shù)家蠶品種對(duì)BmNPV 感染的抵抗力較弱，只有少數(shù)家蠶對(duì)其有抗性[4]。經(jīng)典遺傳分析表明，家蠶對(duì)BmNPV 的抵抗是由主效基因控制、多個(gè)微效基因協(xié)同作用的結(jié)果[5]。

隨著學(xué)者們對(duì)家蠶抗BmNPV 研究的不斷深入，一系列具有抗BmNPV 功能的蛋白和基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和鑒定。例如較早發(fā)現(xiàn)的家蠶脂肪酶（Bmlipase-1）、絲氨酸蛋白酶（BmSP2）等[6-7]；Lu 等[8]發(fā)現(xiàn)，敲除家蠶翻譯控制腫瘤蛋白（BmTCTP ）后，家蠶細(xì)胞對(duì)病毒的易感性增加，而BmTCTP基因的過表達(dá)顯著降低了病毒的復(fù)制量，對(duì)BmTCTP進(jìn)行SUMOylation修飾將有助于其免疫應(yīng)答，可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒活性；膽固醇- 25 -羥化酶（CH25H）在哺乳動(dòng)物中被鑒定為干擾素刺激基因（ISG），通過催化膽固醇轉(zhuǎn)化為25-羥基膽固醇（25HC）發(fā)揮抗病毒作用[9]；Wu 等[10]從家蠶中鑒定了BmCH25H基因，發(fā)現(xiàn)在BmNPV 感染的家蠶卵巢細(xì)胞（BmN 細(xì)胞）和家蠶幼蟲中，BmCH25H的表達(dá)在感染早期顯著上調(diào)；Li 等[11]發(fā)現(xiàn)，純化的家蠶絲氨酸蛋白酶142（Bm-Sp142）處理BmNPV 后，有效地削弱了其感染BmN 細(xì)胞的能力，在BmN 細(xì)胞中過表達(dá)Bm-SP142可抑制病毒的增殖。然而抗性主效基因仍然未能確定，抗病毒分子機(jī)制仍然存在很多未知。家蠶對(duì)BmNPV 的抗性基因鑒定和抗病毒機(jī)制分析值得進(jìn)一步深入研究。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從基因的整體轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜，并揭示復(fù)雜生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的一項(xiàng)技術(shù)，具有檢測(cè)范圍廣、可重復(fù)性高以及定量準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)研究的重要手段。家蠶血液型膿病主要通過食下感染引起，中腸是免疫病原體的重要組織器官。該研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，比較了家蠶BmNPV 抗性品系C9K 和敏感性品系HYB 感染BmNPV 后中腸組織的基因表達(dá)差異，以期篩選家蠶BmNPV 的抗性相關(guān)基因，為解析家蠶BmNPV 抗性機(jī)制以及抗病毒育種提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試家蠶品種為抗BmNPV 品種C9K 和敏感品種HYB，侵染用BmNPV 和家蠶品種均為湖南省蠶?？茖W(xué)研究所蠶品種研究室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的準(zhǔn)備和取樣 試驗(yàn)用不同家蠶品種均正常飼育至五齡，五齡起蠶全部蛻皮完成后不喂食，饑餓處理6 h 后進(jìn)行添食試驗(yàn)；每個(gè)家蠶品種設(shè)置試驗(yàn)組和對(duì)照組2 個(gè)處理，試驗(yàn)組添食涂抹BmNPV懸液（多角體病毒量2×107個(gè)/mL）的桑葉；對(duì)照組用正常的桑葉飼育，每組添食1 次，觀察進(jìn)食情況，保證每組桑葉完全進(jìn)食干凈。添食后第3 天（五齡第3 天）取中腸組織，3 頭家蠶的中腸樣品混合為1個(gè)樣品，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共12 個(gè)樣品，取樣后樣品于－80℃保存。

1.2.2 文庫的建立及測(cè)序 各試驗(yàn)材料送往攸歸（上海）生物科技有限公司，提取總RNA 并對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，RNA 樣品檢測(cè)合格后，構(gòu)建cDNA 文庫，使用Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)（HiSeq/MiSeq）進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序中產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw reads）為fastq 格式序列，使用NGS QC Toolkit 軟件進(jìn)行質(zhì)控并去除接頭，在此基礎(chǔ)上過濾掉低質(zhì)量堿基以及N 堿基，得到高質(zhì)量的clean reads。使用Bowtie2 軟件將過濾后的clean reads 與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫KAIKObase（http：//sgp.dna.affrc.go.jp/）進(jìn)行比對(duì)、匹配和分析，軟件參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。通過基因組以及基因比對(duì)率來評(píng)估樣本的情況。

1.2.3 基因定量、差異基因篩選、功能富集 使用Cufflinks 軟件獲取FPKM 值，在計(jì)算基因的表達(dá)量差異時(shí)，通過Htseq-count 軟件獲取落到各樣本基因的reads 數(shù)目，使用DESeq （2012）R package的estimateSizeFactors 函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用nbinomTest 函數(shù)計(jì)算差異比較的pvalue 和foldchange 值。采用NB 法（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對(duì)reads 數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用CPM 值來估算基因表達(dá)量。挑選出P＜0.05 的差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行DEGs 的GO 和KEGG 富集分析，以判定DEGs 主要影響的生物學(xué)功能或者通路。同時(shí)對(duì)DEGs 進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示DEGs 在不同樣本間的表達(dá)模式。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證 （1）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為40 μL（冰上配制），包 含5×RT MasterMix 8 μL、RNA 模 板2 μg， 用RNase-free dH2O 補(bǔ)全至40 μL。反應(yīng)條件為37℃15 min，60℃10 min，置于4℃冰箱保存。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。使用abm 的BlasTagTM 2×qPCR MasterMix 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光定量PCR，隨機(jī)選取5 個(gè)DEGs 設(shè)計(jì)引物（表1），以TIF-4A 基因作為內(nèi)參基因。PCR 反應(yīng)體系20 μL，包含Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 模板2 μL，用ddH20 補(bǔ)全至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)；95℃變性10 s，65℃退火1 min，97℃變性1 s（該步驟為熔解曲線分析）；37℃退火30 s 終止反應(yīng)。

表1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證所用qRT-PCR 引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量評(píng)估與可靠性分析

cDNA 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序均由攸歸（上海）生物科技有限公司完成，利用Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)（HiSeq/MiSeq）對(duì)12 個(gè)文庫（每個(gè)樣品1 個(gè)文庫）進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)出數(shù)據(jù)如表2 所示，各文庫用于后續(xù)分析的clean bases 大小介于6.02～6.98 Gb 之間，GC 含量介于44.50%～48.00%之間。Q20（堿基質(zhì)量值20）和 Q30（堿基質(zhì)量值30）分別表示測(cè)序過程中堿基檢出精確度為99.0%和99.9%。12 個(gè)文庫的Q20 都在98.05%及以上，Q30 都在94.21%及以上；使用hisat2 （https://ccb.jhu.edu/software/hisat 2/index.shtml）將clean reads 與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫KAIKObase（https://kaikobase.dna.affrc.go.jp）進(jìn)行比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)reads 與每一個(gè)參考基因組的比對(duì)結(jié)果，如表3 所示，12 個(gè)文庫的數(shù)據(jù)能定位到基因組上的測(cè)序序列的比例均在90%以上。質(zhì)量評(píng)估和數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果說明測(cè)序質(zhì)量較高，測(cè)序數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)質(zhì)量評(píng)估

表3 reads 和參考基因組的比對(duì)統(tǒng)計(jì)

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

依據(jù)DESeq 軟件包中的負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)計(jì)算基因差異表達(dá)量，以P＜0.05 且差異倍數(shù)大于2 為篩選條件比較材料間的DEGs 數(shù)量，結(jié)果如表4 所示。C9KCK 和 C9K 之間檢測(cè)到623 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因有282 個(gè)，下調(diào)基因有341 個(gè)；HYBCK和HYB 之間檢測(cè)到429 個(gè)DEGs，上調(diào)基因有254個(gè)，下調(diào)基因有175 個(gè)，說明與空白對(duì)照相比，添食BmNPV 后家蠶的基因表達(dá)有所變化。HYBCK和C9KCK 之間檢測(cè)到2 250 個(gè)DEGs，上調(diào)基因有1 114 個(gè)，下調(diào)基因有1 136 個(gè)，HYB 和C9K 之間檢測(cè)到2 313 個(gè)DEGs，上調(diào)基因有1 042 個(gè)，下調(diào)基因有1 271 個(gè)，2 種不同品系間基因表達(dá)和調(diào)控存在明顯差異，表達(dá)量變化顯著的DEGs 數(shù)量遠(yuǎn)多于同一品系不同處理間的。

表4 差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.3 BmNPV 侵染誘導(dǎo)下差異表達(dá)基因富集分析

對(duì)HYB 和C9K 添食BmNPV 后與空白對(duì)照的DEGs 進(jìn)行了GO 富集分析和KEGG 富集分析，結(jié)果如圖1 和圖2 所示。

圖1 差異表達(dá)基因GO 功能分類

圖2 KEGG 顯著富集散點(diǎn)圖

HYB 添食BmNPV 后有429 個(gè)基因表達(dá)差異顯著，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，對(duì)其功能進(jìn)行描述（結(jié)合GO 注釋結(jié)果），共注釋到206 個(gè)條目，歸屬到生物過程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular funtion）3 大類的分別有73、16 和117 條，分別占比35.4%、7.8%和56.8%；在生物過程中主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、幾丁質(zhì)代謝、脂質(zhì)代謝過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 合成、蛋白質(zhì)水解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原過程等條目；在細(xì)胞組分中主要集中在膜結(jié)構(gòu)、 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等條目；在分子功能中主要表現(xiàn)在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、水解酶活性、蛋白質(zhì)二聚活性、磷酸二酯水解酶活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、DNA 序列特異性結(jié)合、幾丁質(zhì)結(jié)合、鐵離子結(jié)合等條目。

C9K 添食BmNPV 后有623 個(gè)基因表達(dá)差異顯著，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，對(duì)其功能進(jìn)行描述（結(jié)合GO 注釋結(jié)果），共注釋到263 個(gè)條目中，其中歸屬到生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的分別有96、20、145 條，還有2 條未分類（5′-deoxynucleotidase activity、non-motile cilium assembly），分別占比36.5%、7.6%、55.1%、0.8%；在生物過程中主要集中在神經(jīng)酰胺分解過程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)水解、碳水化合物代謝過程、脂質(zhì)代謝過程、金屬離子傳輸、肽聚糖分解過程、脂肪酸代謝過程、氧化還原過程、幾丁質(zhì)代謝過程等條目；在細(xì)胞組分中主要集中在細(xì)胞外空隙、胞外區(qū)、過氧物酶體、膜結(jié)構(gòu)、膜、細(xì)胞核等條目；在分子功能中主要集中在N-?；拾贝减０匪饷富钚浴⒓禾腔D(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、羧酸酯水解酶活性、 -N-乙酰己糖胺酶活性、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、鈣離子結(jié)合、水解酶活性等條目。

為了解DEGs 的生物學(xué)行為，通過與KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)注釋結(jié)果HYB、C9K 的DEGs分別注釋到80 和89 個(gè)通路（pathway）中，最顯著的有20 個(gè)通路（圖2），2 個(gè)品系以代謝通路的DEGs 最多，包括P450 相關(guān)代謝、甘油酯、羧酸、抗壞血酸和醛酸代謝、外源物質(zhì)代謝等，其他HYB的DEGs 還涉及蛋白質(zhì)加工、氨基酸合成、Hippo 信號(hào)通路、Toll 和Imd 信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、溶酶體、糖胺聚糖降解等通路，C9K 的顯著富集通路還包括戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、鞘糖脂生物合成、類固醇生物合成、氨基酸的生物合成、多糖降解、脂肪酸降解、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解等通路。

2.4 2 種不同品系的差異表達(dá)基因富集分析

前期研究表明，C9K 對(duì)BmNPV 的抗性要顯著高于HYB，而2 個(gè)品系的轉(zhuǎn)錄組比較分析基因表達(dá)差異明顯（P＜0.05），對(duì)照組HYBCK 和C9KCK之間的DEGs 有2 250 個(gè)，侵染組HYB 和C9K 之間的DEGs 有2 313 個(gè)。對(duì)2 個(gè)品系的DEGs 進(jìn)行了GO 分析和KEGG 分析，以此進(jìn)一步分析DEGs 的功能信息，篩選潛在的與抗性相關(guān)的基因信息。

通過GO 注釋、分類富集分析，HYBCK–VS–C9KCK 和HYB–VS–C9K 的DEGs 分 別 被 注 釋 到670 和669 個(gè)條目中，各條目在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能3 大功能類別占比分別為40.5%、10.7%、48.3%和39.6%、10.9%、49.3%；TOP30 見圖1，在生物過程中富集在DNA 整合、蛋白質(zhì)水解、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、紡錘體組裝核對(duì)點(diǎn)、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、核苷酸切除修復(fù)、碳水化合物代謝過程、氮復(fù)合代謝過程、脂質(zhì)代謝過程、DNA 介導(dǎo)轉(zhuǎn)座等條目；在細(xì)胞組分中主要富集在轉(zhuǎn)錄因子TFIIH 核心復(fù)合物、細(xì)胞外間隙、線粒體內(nèi)膜、胞外區(qū)、細(xì)胞膜、 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等條目；在分子功能中結(jié)合（核酸結(jié)合、DNA 結(jié)合、鐵離子結(jié)合等）和酶活性（天冬氨酸內(nèi)切酶活性、絲氨酸內(nèi)切酶活性、水解酶活性，脂肪酸合酶活性、氧化還原酶活性等）條目占比較高，其他富集條目涉及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等。

對(duì)2 個(gè)品系的KEEG 分析結(jié)果顯示，HYBCK –VS–C9KCK 有415 個(gè)DEGs 被注釋到122 個(gè)通路中，HYB–VS–C9K 有484 個(gè)DEGs 被注釋到129 個(gè)通路中，其中以代謝通路占比最高，主要包括細(xì)胞色素P450 代謝、視黃醇代謝、甘油脂代謝、脂肪酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、酪氨酸代謝、苯丙烷代謝、卟啉與葉綠素代謝、外源物質(zhì)代謝等，其他通路還涉及代謝產(chǎn)物的生物合成和降解、信號(hào)通路、同源重組、核苷酸切除修復(fù)等。

2.5 差異基因維恩分析

基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式在不同材料間存在一定差異，同時(shí)為了減少背景誤差，筆者對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行維 恩 分 析，HYBCK–VS–C9KCK 和HYB–VS–C9K這2 組數(shù)據(jù)對(duì)比分析得到1 340 個(gè)共有DEGs，其中顯著上調(diào)的有620 個(gè)，顯著下調(diào)的有720 個(gè)；GO 分析結(jié)果顯示有740 個(gè)DEGs 共同注釋到445 個(gè)條目中，在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能3 大功能類別占比分別為37.4%、9.8%、52.8%，DEGs 主要集中于代謝過程、酶活性、膜相關(guān)、分子結(jié)合等條目中；KEGG 富集結(jié)果顯示有241 個(gè)DEGs 注釋在115個(gè)通路中，其中以代謝通路相關(guān)的DEGs 最多，其他DEGs 還主要注釋到Toll 和Imd 信號(hào)通路、同源重組、代謝產(chǎn)物合成、糖胺聚糖降解等通路中。同時(shí)，對(duì)HYBCK–VS–HYB 和C9KCK–VS–C9K 進(jìn)行維恩比較，共獲得89 個(gè)共有DEGs，其中一致上調(diào)表達(dá)的DEGs 有23 個(gè)，一致下調(diào)的有13 個(gè)，GO 分析顯示DEGs 主要富集在碳代謝、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、水解酶活性、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等條目中，KEGG 分析顯示代謝通路富集最高，其次是類固醇生物合成、甘油酯代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、溶酶體等通路。

基于2 組維恩分析，筆者未發(fā)現(xiàn)4 次下調(diào)表達(dá)的DEGs，而4 次上調(diào)表達(dá)的DEGs 有8 個(gè)，分別為KWMTBOMO 03226（LOC 101744459，synaptic vesicle 2-related protein）、KWMTBOMO 04228（LOC 101737295，putative inorganic phosphate cotransporter）、KWMTBOMO 04299（GlcNA case 2，beta-N-acetylglucosaminidase 2）、KWMTBOMO 05498（CTL11，C-type lectin 11）、KWMTBOMO 09593（LOC 101740685，vanin-like protein1）、KWMTBOMO 13544（LOC 105-841535，uncharacterized）、KWMTBOMO 16344（LOC 101735545，uncharacterized）、KWMTBOMO 16422（UGT33D5，UDP-glycosyltransferase UGT33D5）。

C-型凝集素（C-type lectin，CTL）是動(dòng)物中最大的凝集素家族，含有1 個(gè)或2 個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（CRD）的鈣依賴性糖結(jié)合蛋白，在病原體識(shí)別、補(bǔ)體系統(tǒng)、信號(hào)激活及傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，C-型凝集素主要參與識(shí)別和凝集細(xì)菌，在對(duì)病毒的免疫應(yīng)答方面也有報(bào)道，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)日本對(duì)蝦中的3個(gè)C-型凝集素（MjLecA、MjLecB 和 MjLecC）可以識(shí)別白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）囊膜蛋白，結(jié)合病毒衣殼蛋白，從而降低WSSV 對(duì)宿主的感染[12]。糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）是自然界廣泛存在的一大類酶，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDPglycosyltransferase，UGTs）在外源物質(zhì)的代謝和解毒方面起著重要作用，植物和哺乳動(dòng)物中關(guān)于UGTs的研究報(bào)道較多，而昆蟲中則相對(duì)較少[13-14]。而上述分析結(jié)果顯示，C 型凝集素基因（KWMTBOMO 05498）和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（KWMTBOMO 16422）在抗性品系 C9K 對(duì)照組中表達(dá)水平顯著高于敏感品系HYB，且在感染后具有上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，顯示這些基因可能存在抗BmNPV 作用，可作為抗性候選基因用于后續(xù)研究驗(yàn)證。

2.6 qRT-PCR 驗(yàn)證

選取HYBCK–VS–C9KCK 和HYB–VS–C9K 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)log2FoldChange 以及qRT-PCR 的log2Relative expression ratio 進(jìn)行比較，數(shù)值大于0 代表上調(diào)，小于0 代表下調(diào)，結(jié)果如表5 所示，除個(gè)別存在微小差異外，與RNA-seq 結(jié)果表現(xiàn)出相同的下調(diào)或上調(diào)的基因表達(dá)趨勢(shì)，表明轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異分析結(jié)果可信。

表5 家蠶中腸5 個(gè)基因的RNA-Seq 和RT-qPCR 數(shù)據(jù)的比較

3 結(jié)論與討論

BmNPV 是家蠶的主要病原體之一，然而BmNPV 感染和宿主防御的機(jī)制尚不清楚。該研究中，通過對(duì)HYB（易感品系）和C9K（抗性品系）的中腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較分析了可能與家蠶BmNPV 抗性相關(guān)的基因。結(jié)果表明，BmNPV 侵染能夠誘導(dǎo)2 個(gè)品系家蠶的全基因組轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生較大變化，GO 分析顯示這些變化主要涉及到代謝過程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜結(jié)構(gòu)、酶活性、信號(hào)傳導(dǎo)、結(jié)合功能等，KEGG 分析顯示這些差異基因主要參與能量代謝、氨基酸的代謝、糖類代謝、次級(jí)產(chǎn)物代謝等?？偟膩碚f，病毒侵染后抗性品系的差異基因數(shù)量多于敏感品系，2 個(gè)不同品系之間的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與調(diào)控差異明顯。

昆蟲主要依靠先天免疫來抵御病原體的入侵，鱗翅目昆蟲的抗病毒免疫方式包括全域蛋白質(zhì)合成停止、rRNA 降解、腸液抗病毒蛋白的滅活作用、黑化、細(xì)胞凋亡、基于RNAi 的抗病毒反應(yīng)和宿主基因編碼的抗病性等[15-17]。

病毒作為一種細(xì)胞內(nèi)寄生物，其復(fù)制增殖嚴(yán)格依賴于宿主細(xì)胞。在此過程中，宿主細(xì)胞會(huì)通過自我凋亡的方式來抵御病毒的自身復(fù)制增殖及持續(xù)感染，有效地降低病毒的擴(kuò)增和傳播速度。研究表明，細(xì)胞凋亡過程中，線粒體結(jié)構(gòu)、膜通透性及膜電位等發(fā)生變化，且細(xì)胞色素C 在整個(gè)過程中發(fā)揮了重要作用[18]。該試驗(yàn)也檢測(cè)到了一些與凋亡通路相關(guān)的基因在病毒侵染后上調(diào)高量表達(dá)，如KWMTBOMO 01304、KWMTBOMO 01730、KWMTBOMO 11732，其 中KWMTBOMO 01304 為細(xì)胞色素C 基因，其在抗性品系中的表達(dá)要高于敏感品系。

黑化是昆蟲的一種重要體液反應(yīng)，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）是黑化過程中的關(guān)鍵酶，由酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）通過一系列絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而活化，同時(shí)也受到絲氨酸蛋白酶抑制劑的負(fù)調(diào)控作用。PO 催化黑色素形成以包裹并殺死入侵病原體，PPO 的活化級(jí)聯(lián)能夠有效地阻斷桿狀病毒感染[19-20]。在該研究中，2 個(gè)品系在病毒侵染后都有部分絲氨酸蛋白酶上調(diào)表達(dá)，而絲氨酸蛋白酶抑制劑下調(diào)表達(dá)，2 個(gè)差異品系的比較中，例如絲氨酸蛋白酶3 基因（serine protease 3，KWMTBOMO 09454）在抗性品系中上調(diào)高量表達(dá)，而絲氨酸蛋白酶抑制劑3 基因（serine protease inhibitor 3，KWMTBOMO 03900）下 調(diào) 表 達(dá)。這暗示著絲氨酸蛋白酶及其抑制劑可能參與了家蠶抗BmNPV 過程。

在先天免疫反應(yīng)中，對(duì)病原體的識(shí)別是引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[21]，模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）能識(shí)別病原物表面的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），繼而激活體內(nèi)的Toll 通路、Imd 通路、JAK-STAT 通路等來清除病原物。Imd 和Toll 信號(hào)通路在昆蟲的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，2 條信號(hào)通路均是典型的NF-kB（nuclear factor kappa B）依賴性通路，介導(dǎo)下游抗菌肽（AMPs）和其他效應(yīng)分子基因的表達(dá)；Toll 通路介導(dǎo)對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌感染的免疫反應(yīng)，而Imd 通路介導(dǎo)對(duì)革蘭氏陰性菌的免疫反應(yīng)[22]。在果蠅的抗病毒免疫報(bào)道中，Imd和Toll 通路在抑制果蠅病毒復(fù)制等方面發(fā)揮了重要作用[23-24]，但相關(guān)信號(hào)通路在家蠶抗BmNPV 的報(bào)道中較少見。

該研究中，信號(hào)通路相關(guān)的肽聚糖識(shí)別蛋白（peptidoglycan reconynition protein，PGRP）和葡聚糖識(shí)別蛋白（glucan recognition protein，GRGP）在病毒侵染后上調(diào)表達(dá)，但在敏感品系中的表達(dá)高于抗性品系?？咕氖且活悓?duì)細(xì)菌、真菌、病毒等病源微生物有廣譜抑制活性的小肽類物質(zhì)，包括gloverin、lebocin（凝集素）、attacin（攻擊素）和lysozyme（溶菌酶）等，研究發(fā)現(xiàn)glv-1 和glv-2 對(duì)苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病的的BV 具有抑制作用[25]，在家蠶體內(nèi)和體外過表達(dá)C-lysozyme 能夠顯著減少BmNPV 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并降低病毒毒力[26]。該研究結(jié)果也顯示，glv-3（KWMTBOMO 16379）、glv-4（KWMTBOMO 16426）在敏感品系中上調(diào)表達(dá)，lysozyme（KWMTBOMO 07068）在抗性品系中上調(diào)表達(dá)且敏感品系的表達(dá)高于抗性品系。

細(xì)胞色素P450 （Cytochrome P450）、酯酶（Esterase） 以及谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）是對(duì)昆蟲抗藥性有重要影響的3 個(gè)解毒酶系，通過基因擴(kuò)增或過表達(dá)解毒酶基因，提升其代謝活性，對(duì)次生物質(zhì)和殺蟲劑進(jìn)行解毒代謝。相關(guān)酶系在抗病毒方面還未見報(bào)道。在該研究的轉(zhuǎn)錄組比較分析中，3 種酶系的部分基因在病毒侵染后上調(diào)表達(dá)，且像esterase FE4（KWMTBOMO 09142）、GST（KWMTBOMO 15683）、CYP367A1（KWMTBOMO 09791）等基因在抗性品系的表達(dá)顯著高于敏感品系。這些基因可能與家蠶抗BmNPV 有關(guān)，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

不同的家蠶品系對(duì)BmNPV 的抗性存在差異，大量的研究報(bào)道認(rèn)為家蠶對(duì)BmNPV 的抗性是主效基因和多個(gè)微效基因共同作用的，對(duì)抗BmNPV 有關(guān)的基因和蛋白分子的挖掘和分析是一項(xiàng)很有意義的課題。該研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析獲得了大量的差異表達(dá)基因，其中免疫通路、蛋白識(shí)別等方面的候選基因值得進(jìn)一步的研究，為闡述家蠶對(duì)BmNPV 的抗性機(jī)理提供了有用的信息和數(shù)據(jù)。