高云慨 陳小妹 陳春泉 周凌聿 鄧英林 尹青春

(海南省食品檢驗(yàn)檢測中心國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室〔熱帶果蔬質(zhì)量與安全〕,海南 ?？?570100)

據(jù)統(tǒng)計(jì)[1],中國飲用咖啡的消費(fèi)者已達(dá)3.3億人,近年來咖啡消費(fèi)市場規(guī)模保持20%的年化速度飛速增長。中國咖啡種植主要分布在溫潤潮濕的云南、四川及海南地區(qū)。研究[2]表明,咖啡及其產(chǎn)品在采收、加工、貯藏過程中易受到霉菌的侵染,產(chǎn)生各種真菌毒素。Bessaire等[3]采集了9個(gè)國家咖啡樣本,多數(shù)樣本中含有多種霉菌毒素,其中赭曲霉毒素A含量最高。飲用咖啡是機(jī)體攝入該毒素的主要途徑,因在生產(chǎn)及食用環(huán)節(jié)難以完全避免其毒性,已成為危害健康的主要關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素[4-5]。

赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)是由真菌產(chǎn)生的具有結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物,常見的有赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)等[6-7]。其主要通過侵害動(dòng)物肝臟與腎臟,具有致癌、致畸等毒副作用,已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列入2B類致癌目錄,危害性僅次于黃曲霉毒素[8]。研究[9]表明,OTA和OTC在特定條件下可以相互轉(zhuǎn)化,具有協(xié)同毒副效應(yīng)。同時(shí),代謝的多種真菌毒素的協(xié)同作用對人體健康的影響更具危害性[10-11]。葉林鏈等[12]從肉豆蔻中分離了一株赭曲霉毒素產(chǎn)毒菌,同時(shí)檢出了OTA、OTB兩種真菌毒素,說明在植物源樣本中存在不同結(jié)構(gòu)的赭曲霉毒素。GB 2761—2017對咖啡中赭曲霉毒素A限值有明確要求,但其他赭曲霉毒素類型尚未見相關(guān)規(guī)定[13]。

近年來,高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因其強(qiáng)大的分離能力和較好的靈敏度、準(zhǔn)確性,逐步被應(yīng)用于部分真菌毒素的定性和定量分析[14-18]。免疫親和柱法對真菌毒素具有高特異性,是目前國家標(biāo)準(zhǔn)檢測咖啡赭曲霉毒素A采用的前處理方法,但由于采用抗原抗體結(jié)合的凈化方式,其前處理過程復(fù)雜、使用成本高,檢測的真菌毒素種類有限。相比免疫親和柱,QuEChERS前處理技術(shù)采用提取與凈化結(jié)合方式,具有操作簡單、快速、價(jià)格便宜且選擇性好等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于多種真菌毒素的高通量檢測[19-23]。

目前國內(nèi)有關(guān)咖啡及制品中真菌毒素檢測的研究較少[24],尚未見針對咖啡中同時(shí)檢測OTA、OTB、OTC 3種類型赭曲霉毒素方法研究及評價(jià)的報(bào)道。研究擬將高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與QuEChERS技術(shù)結(jié)合,采用內(nèi)標(biāo)法定量,旨在建立能快速篩查和準(zhǔn)確定量咖啡中3種赭曲霉毒素檢測方法,以期為全面監(jiān)測、評估咖啡中赭曲霉毒素的污染風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

OTA、OTC:天津阿爾塔科技有限公司;

OTB:德國Dr. Ehrenstorfer公司;

13C20-OTA:北京曼哈格生物科技有限公司;

QuEChERS提取鹽包:4 g硫酸鎂、1.0 g氯化鈉,美國Agilent公司;

凈化柱:SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管,日本SHIMADZU公司;

Waters Oasis?PRime HLB:200 mg,6 mL,美國Waters公司;

ZanChERS-Myco17凈化小柱:北京科德諾思技術(shù)有限公司;

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),美國Waters公司;

乙腈、甲酸、甲醇:德國MERCK公司;

咖啡生豆、烘焙咖啡豆、速溶咖啡粉:市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)譜儀:AB Sciex Triple QuadTM4500型,美國SCTEX公司;

電子天平:XS204S型,瑞士梅特勒—托利多公司;

冷凍離心機(jī):5804R型,德國Eppendorf公司;

超聲波器:SK 7200型,上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

(1) 質(zhì)譜條件:離子源(ESI);正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描;噴霧電壓4 500 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣為氮?dú)?加熱氣為氮?dú)?碰撞室入口電壓10 V。

(2) 色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積5.0 μL;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B為乙腈;流速0.3 mL/min;洗脫程序:0～2.0 min,10% B;2.0～3.0 min,10%～90% B;3.0～3.2 min,90%～10% B;3.2～5.0 min,10% B。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1) 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg/mL):準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 的3種赭曲霉毒素混標(biāo)100 μL,用乙腈定容至10 mL,并于-18 ℃貯藏備用。

(2)13C20-OTA內(nèi)標(biāo)使用溶液(10.0 μg/mL):準(zhǔn)確吸取100 μg/mL13C20-OTA溶液1.0 mL,用乙腈定容至10 mL,并于-18 ℃貯藏備用。

1.2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 稱取不含3種赭曲霉毒素的咖啡空白基質(zhì)樣品,按1.2.2的方法處理得到基質(zhì)溶液,使用該溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1～20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

1.2.4 樣品前處理 稱取1.0 g(精確至0.01 g)咖啡粉碎樣品至50 mL干凈離心管中,加入100 ng/mL的13C20-OTA內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL及10 mL乙腈提取液(V乙腈∶V甲酸∶V水為65∶5∶30),分別漩渦超聲5 min,加入3.2 g QuEChERS鹽包,劇烈振搖分散,10 000 r/min離心5 min。吸取2 mL上清液上ZanChERS-Myco17凈化小柱,收集濾液過0.22 μm PTFE濾膜,上質(zhì)譜測定。

1.2.5 線性關(guān)系 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),將3種赭曲霉毒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分析結(jié)果繪制校準(zhǔn)曲線,計(jì)算相應(yīng)線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.6 檢出限及定量限 通過測定系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,檢出限以3倍信噪比(S/N=3)時(shí)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度換算,定量限以10倍信噪比(S/N=10)時(shí)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度換算。

1.2.7 回收率和精密度測定 分別選取不含3種赭曲霉毒素的咖啡生豆、烘焙咖啡粉、速溶咖啡粉作為基質(zhì),分別配制含混標(biāo)溶液2,5,10 μg/kg 3個(gè)水平的供試品溶液進(jìn)行測定,每個(gè)水平6個(gè)平行,計(jì)算各水平目標(biāo)物回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 實(shí)際樣品測定 采用市售的咖啡生豆(預(yù)包裝)、咖啡生豆(散裝)、研磨咖啡粉(預(yù)包裝)、研磨咖啡粉(散裝)、速溶咖啡(預(yù)包裝)、速溶咖啡(散裝)共30個(gè)樣品,主要產(chǎn)地為海南省,按試驗(yàn)建立的方法及GB 5009.28—2016進(jìn)行測定,每種類型5個(gè)樣品,每個(gè)樣2個(gè)平行。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取質(zhì)量濃度為20 ng/mL的OTA、OTB、OTC和13C20-OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)調(diào)諧,依次選擇正、負(fù)離子模式掃描一級質(zhì)譜,比較正、負(fù)離子模式的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種目標(biāo)物采用正離子模式響應(yīng)最好。繼續(xù)采用正離子模式掃描二級質(zhì)譜,同時(shí)選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化各目標(biāo)物的其他參數(shù),篩選最優(yōu)的定性和定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 OTA、OTB、OTC和13C20-OTA的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜柱及流動(dòng)相的篩選

試驗(yàn)對比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、CORTECS T3(2.7 μm,2.1 mm×100 mm)、CORTECS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm) 3款類型不同填充粒徑的色譜柱和0.2%甲酸水/甲醇、水/甲醇、0.2%甲酸水/乙腈、水/乙腈4種不同配比流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果顯示,采用Waters BEH C18及CORTECS T3色譜柱均能分離4種化合物,其中Waters BEH C18色譜柱響應(yīng)值最高,分離效果最好。李碩等[24]采用UPLC-MS/MS測定咖啡粉中黃曲霉毒素和雜色曲霉素,發(fā)現(xiàn)C18色譜柱填料為實(shí)心核殼顆粒分離效果要優(yōu)于全多孔顆粒。對比4種不同配比流動(dòng)相,當(dāng)流動(dòng)相中添加甲酸后,峰型對稱、信號響應(yīng)更高,并隨著甲酸濃度的增加,其響應(yīng)不斷增強(qiáng)。其中0.2%甲酸水/乙腈作為流動(dòng)相的色譜峰型及信號響應(yīng)最好。葉林鏈等[12]研究發(fā)現(xiàn),選擇乙腈為流動(dòng)相,不加酸,OTA、OTB的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移,加酸后能改善目標(biāo)化合物的峰型。赭曲霉毒素化合物由于含較多羧酸,添加適量的酸可以使其保持分子形式有利于色譜柱的保留,促進(jìn)分離[25]。因此,選擇Waters BEH C18色譜柱,0.2%甲酸水/乙腈為流動(dòng)相。4種化合物質(zhì)譜總離子流圖如圖1所示。

圖1 OTA、OTB、OTC和13C20-OTA質(zhì)譜總離子流圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

乙腈作為提取溶劑具有沉淀蛋白的作用,對脂肪及蛋白含量較高的食品具有較好的選擇[26]。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)考察了6種不同配比提取溶劑1[乙腈—水(V乙腈∶V水為90∶10)]、提取溶劑2[乙腈—水(V乙腈∶V水為75∶25)]、提取溶劑3[乙腈—水(V乙腈∶V水為65∶35)]、提取溶劑4[乙腈—水(V乙腈∶V水為55∶45)]、提取溶劑5[乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶40∶5)]、提取溶劑6[乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶35∶10)]的提取效果。由圖2可知,溶劑中加入適量水可以增強(qiáng)乙腈的滲透性,添加無機(jī)鹽可以促進(jìn)乙腈與水相分層,當(dāng)V乙腈∶V水為65∶35時(shí),開始分層,其中V乙腈∶V水為55∶45的分層效果最好,提取效率最高。當(dāng)提取液中含有5%甲酸時(shí),OTA、OTB的回收率較高,但甲酸含量過高,3種目標(biāo)化合物的回收率均降低。有研究[27]表明,體系中加入適當(dāng)?shù)乃峥稍鰪?qiáng)對酸敏感的真菌毒素的提取效果并降低基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)中加入適當(dāng)?shù)乃峒盁o機(jī)鹽可以使目標(biāo)物保留分子形式利于提取及減少乙腈中水溶性雜質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng),從而獲得較高提取效果。綜合考慮,選擇乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶40∶5)作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對3種化合物回收率的影響

2.4 凈化方式優(yōu)化

研究[28]表明,可采用不同類型凈化方式去除干擾物質(zhì),提高凈化效果。試驗(yàn)分別選用WondaPak QuEChERS凈化管、ZanChERS-Myco17凈化小柱、PRime HLB凈化柱3種凈化方式,以回收率為指標(biāo),考察3種目標(biāo)化合物的凈化情況。由圖3可知,WondaPak QuEChERS凈化管、ZanChERS-Myco17凈化小柱對3種目標(biāo)化合物凈化效果較好,其中ZanChERS-Myco17凈化小柱凈化效果最佳,整體回收率為85.5%～107.5%。QuEChERS凈化管采用的凈化劑含有PSA、GCB、C18,這些成分可有效去除脂類、糖類及色素等成分,但會(huì)對酸性及含有苯環(huán)的官能團(tuán)毒素具有吸附作用,可能是導(dǎo)致回收率偏低的原因。PRime HLB凈化柱能夠有效去除蛋白、鹽、磷脂等干擾物,但對咖啡色素的凈化效果不明顯,基質(zhì)干擾大,導(dǎo)致回收率偏低。ZanChERS-Myco17凈化小柱采用磁性金屬有機(jī)骨架(MOFs)材料鍵合NH2基團(tuán),相比凈化管具有較高的理論塔板數(shù)及選擇性。因此,選取ZanChERS-Myco17凈化方式。

圖3 凈化方式對3種目標(biāo)化合物回收率的影響

2.5 線性范圍、檢出限及定量限

García-Moraleja等[29]以生咖啡豆為基質(zhì),建立了UPLC-MS/MS測定OTA的方法,檢出限及定量限分別為1.13,1.45 μg/kg。由表2可知,試驗(yàn)方法在0.1～20.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)3種目標(biāo)物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.999 46,檢出限為0.1～0.2 μg/kg,定量限為0.2～0.7 μg/kg,其中OTA的檢出限及定量限分別為0.2,0.7 μg/kg,均小于同類方法及GB 5009.96—2016中的檢出限和定量限,說明試驗(yàn)方法的靈敏度較高。

表2 3種化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.6 回收率與精密度試驗(yàn)

基質(zhì)效應(yīng)是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素,減少基質(zhì)效應(yīng)的影響一般可選擇同位素內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配校正法[30-31]。鑒于咖啡基質(zhì)較為復(fù)雜,試驗(yàn)選擇內(nèi)標(biāo)法定量。分別選取不含目標(biāo)物的咖啡生豆、研磨咖啡粉、速溶咖啡粉作為陰性樣品,各添加2,5,10 μg/kg 3個(gè)水平濃度OTA、OTB和OTC混標(biāo)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液,按1.2.7的方法分別計(jì)算3種化合物的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),每個(gè)濃度6個(gè)平行,結(jié)果見表3。由表3可知,3種毒素的平均回收率為79.0%～103.0%,RSD為1.5%～7.6%,方法準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好,滿足檢測要求。

表3 3種化合物的回收率和RSD

2.7 實(shí)際樣品測定

由表4可知,30份咖啡樣品中共檢出4批含有OTA,含量為0.82～2.15 μg/kg,均低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值(5.0 μg/kg)。經(jīng)比對,除樣品YMS4因檢測結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)方法定量限而無法準(zhǔn)確定量外,試驗(yàn)方法測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%,說明該方法測定樣品結(jié)果準(zhǔn)確可靠。一般來說,咖啡樣品中赭曲霉毒素的污染主要來自生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程中殘留毒素的直接接觸及真菌侵染后產(chǎn)生代謝物兩個(gè)方面,此次檢出的4批樣品中,3批來自散裝貯藏,可能是由于散裝咖啡密封不嚴(yán)、貯藏條件控制不當(dāng)而被真菌污染產(chǎn)生毒素所致。生咖啡豆中OTA殘留量通常會(huì)比烘焙咖啡的高,主要原因是烘焙過程中高溫可一定程度上降低OTA水平[32-33]。試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),生咖啡豆OTA檢出含量要高于研磨咖啡。

表4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果?

相關(guān)研究[34]數(shù)據(jù)顯示,咖啡及制品在一些國家或地區(qū)具有較高的赭曲霉毒素檢出率及殘留量。對實(shí)際樣品檢測發(fā)現(xiàn),赭曲霉毒素檢出率及含量均較低,另外,散裝貯藏方式咖啡檢出率高于預(yù)包裝,說明可能存在真菌污染導(dǎo)致毒素積累的風(fēng)險(xiǎn)。建議在咖啡生產(chǎn)及銷售過程中應(yīng)對貯藏條件及方式加以嚴(yán)格控制,防止產(chǎn)毒真菌污染。

3 結(jié)論

采用QuEChERS前處理方法結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定量,通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件、提取條件和凈化條件,建立了可同時(shí)測定咖啡基質(zhì)中3種赭曲霉毒素的UPLC-MS/MS方法。該方法相較標(biāo)準(zhǔn)方法的免疫親和柱法更加簡便、準(zhǔn)確、靈敏,其分析時(shí)間短,適用于咖啡基質(zhì)中3種赭曲霉毒素的快速篩查及定量檢測。后續(xù)可結(jié)合微生物學(xué)手段明確污染源,以期為全面監(jiān)測、評估咖啡中赭曲霉毒素的污染風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。