張周莉 黎 東 羅 斯 羅星宇 雍 萍 易 達

(南充市食品藥品檢驗所,四川 南充 637000)

雙炔酰菌胺(mandipropamid,MPD)是一種商品化的扁桃酸酰胺類殺菌劑[1],屬于羧酸酰胺類(carboxyl acid amide, CAA)殺菌劑族[2],目前主要應用于黃瓜霜霉菌[3]、荔枝霜疫霉菌[4]、葡萄霜霉病[5]、辣椒疫霉病[6]、馬鈴薯晚疫病[7]、番茄晚疫病[8]、“爛芋皮”病[9]等的防治。MPD是通過干擾致病真菌的磷脂生成,以及阻止細胞壁沉積物的生物合成,來達到抑制孢子囊產(chǎn)生和菌絲體生長[10-11]的目的,表現(xiàn)出對游動孢子的萌發(fā)有明顯抑制作用[12],尤其是對由卵菌引起的葉部和果實病害具有較好的防治效果。

2019年2月13日,歐洲食品安全局(EFSA)修訂了MPD在各種蔬菜中的最大殘留限量[13];2019年3月22日,美國環(huán)保署發(fā)布的2019-05406號文件中,規(guī)定了MPD在部分豆類及蔬菜中的殘留限量[14]。研究表明,MPD易在果蔬中殘留[15],會對環(huán)境、土壤造成一定程度的污染,且其降解過程緩慢,主要依靠微生物進行降解[16]。同時,MPD的殘留也會對食品的香氣成分的潛在變化造成一定程度的影響,影響產(chǎn)品品質(zhì)。González-lvarez等[17]研究發(fā)現(xiàn),由MPD處理后的葡萄加工制得的葡萄酒中的2-苯乙醇含量明顯增加。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中,雖然規(guī)定了MPD在20種食品或農(nóng)產(chǎn)品、藥用植物中的殘留限量,但均為臨時限量且未匹配相應的檢測方法。此外,GB 23200.113—2018和GB/T 20769—2008中均未涉及MPD的檢測,GB 23200.121—2021中雖有列出MPD的檢測方法,但其洗脫時間長,易受基質(zhì)物質(zhì)干擾。

目前,有關MPD的分析方法主要有液相色譜法(LC)[18-19]和液相質(zhì)譜法(LC-MS)[20-21]。MPD常常被用于治療黃瓜霜霉病[22],但其在黃瓜中的半衰期長[18]。課題團隊[23]前期通過高效液相色譜法建立了一種準確度和精密度高,線性關系良好的黃瓜中MPD殘留量的測定方法。研究擬采用乙腈提取樣品,QuEChERS法凈化提取液, UPLC-MS方法檢測,開發(fā)一種黃瓜中MPD殘留量的定性及定量分析方法,旨在為MPD的安全使用和風險監(jiān)測提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MPD標準品:100 μg/mL,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;

乙腈、甲酸:色譜純,美國Fisher公司;

無水硫酸鎂、氯化鈉:分析純,成都市科隆化學品有限公司;

檸檬酸鈉二水化合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水化合物:分析純,中國醫(yī)藥集團有限公司;

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA,40～60 μm)、石墨化炭黑(GCB,40～120 μm):深圳逗點生物技術有限公司;

0.22 μm有機過濾膜:美國Ameritech公司;

實驗室用水為Milli-Q超純水;

黃瓜:市售。

1.2 儀器與設備

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀:QTRAP?4500型,美國AB SCIEX公司;

精密分析天平:ML203/02型,上海Mettler Toledo公司;

渦旋振蕩器:Multi-Reax型,德國Heidolph公司;

冷凍離心機:5810R型,德國Eppendorf公司;

超聲儀:KQ-700DE型,昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 按GB 2763—2021中附錄A的規(guī)定執(zhí)行。

1.3.2 樣品處理 在前期試驗[23]的基礎上稍加改進。稱取勻漿后的10 g(精確至0.001 g)試樣于50 mL離心管中,精確加入10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min,超聲5 min,加入提取包(4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水化合物、0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水化合物),劇烈振蕩混勻2 min,4 000 r/min離心10 min。定量吸取5 mL上清液,依次加入150 mg無水硫酸鎂、25 mg PSA、2.5 mg GCB,渦旋混勻2 min,4 000 r/min離心10 min,吸取上清液過 0.22 μm有機微孔濾膜,待上機測定。

1.3.3 標準溶液配制 準確吸取1 mL MPD標準溶液于100 mL容量瓶中,用超純水定容,得到1 μg/mL的MPD標準儲備溶液。

(1) 溶劑標準溶液配制:精確吸取一定量的標準儲備溶液,分別用50%乙腈水溶液稀釋成0.01,0.05,0.10,0.20,0.50 μg/mL的溶劑標準工作液。

(2) 黃瓜基質(zhì)標準溶液配制:稱取空白樣品,依次按1.3.1和1.3.2的方法處理,得到空白基質(zhì)溶液,按V超純水∶V空白基質(zhì)溶液為1∶1混合并充分混勻,得到50%空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量的標準儲備溶液,用50%空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.01,0.05,0.10,0.20,0.5 μg/mL的基質(zhì)匹配標準工作溶液。

1.3.4 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析

(1) 液相色譜條件:色譜柱為Shim-pack GIST C18柱(2.1 mm×100 mm,2.0 μm);流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為乙腈;洗脫速度0.3 mL/min;進樣體積1 μL;柱溫40 ℃。液相色譜洗脫程序見表1。

表1 液相色譜洗脫程序

(2) 質(zhì)譜條件:ESI離子源;正離子模式:檢測方式為MRM;氣簾氣0.207 MPa;離子化電壓5 500 V;離子源溫度450 ℃;噴霧氣0.345 MPa;輔助加熱氣0.345 MPa;母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.4 定性判斷

試樣中MPD色譜峰的保留時間與MPD標準溶液的保留時間應當一致,變化范圍在±2.5%以內(nèi),且同時應檢測到2對離子。樣品中MPD的2對離子的相對豐度比與濃度相當標準溶液的相對豐度比符合表3規(guī)定,則判定該樣品中存在MPD為陽性。

表3 定性判斷依據(jù)

1.5 回收率和精密度

稱取陰性黃瓜樣品3份,分別加入0.1,0.5,1.0 mL的MPD標準儲備溶液,其他處理步驟同樣品處理。

1.6 檢出限與定量限

取標準曲線第1個點的標準溶液,通過UPLC-MS儀進行分析,測其信噪比,以S/N=3計算檢出限(LOD),以S/N=10計算定量限(LOQ)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

通過Analyst?軟件采集試驗數(shù)據(jù),通過Sciex OS-MQ軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,結(jié)果使用外標法進行定量計算,并按式(1)計算樣品中MPD含量。

(1)

式中:

X——樣品中MPD含量,mg/kg;

c——測得質(zhì)量濃度,μg/mL;

V——定容體積,mL;

m——稱樣量,g;

f——稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將0.1 μg/mL的MPD標準溶液以針泵注射的方式進行MPD的一級質(zhì)譜母離子全掃描,確定出準分子離子質(zhì)量數(shù)為412.0 Da。由圖1可知,MPD具有一個手性碳原子,由一對對映異構(gòu)體組成,結(jié)合化學結(jié)構(gòu)分析,母離子受到電子轟擊后,極易失去末端丙炔的碳原子或造成末端乙炔斷裂,分別生成醇或酚[24]。

圖1 雙炔酰菌胺可能的裂解途徑

將準分子離子作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描,經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到離子碎片如圖2所示。其中,355.9,327.9,204.0,125.1 Da的響應值明顯高于其他碎片離子的。

圖2 雙炔酰菌胺的子離子碎片

將得到的4組離子對分別固定去簇電壓和碰撞能量,并對其進行優(yōu)化,使離子碎片的響應達到最高,優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表4。

表4 質(zhì)譜條件

2.2 色譜條件優(yōu)化

查閱相關文獻發(fā)現(xiàn),當在正離子模式下采用MRM方式掃描目標化合物時,有機相通常選用乙腈或甲醇溶液[25],水相通常選用甲酸水、乙酸銨水溶液或兩者的混合溶液[26]。分別采用甲醇—水、乙腈—水作為流動相,考察不同流動相條件下MPD的分離和響應情況。結(jié)果表明,在相同的儀器條件下,當流動相為乙腈時,MPD的響應更高且峰型良好。因此,采用乙腈—水體系作為流動相。進一步對乙腈—水、乙腈—0.1%甲酸水、乙腈—乙酸銨水的體系進行比較,隨著甲酸的加入,MPD的分離度更高、峰型更好且保留時間穩(wěn)定,響應值較高。通過對乙腈—甲酸水體系和乙腈—乙酸胺水體系的比較,發(fā)現(xiàn)乙腈—0.1%甲酸水體系的峰型更好,分離度更高。因此,選擇乙腈—0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.3 離子對的選擇

通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),有學者[27]將412.0/327.9,412.0/125.1分別作為定量離子對和定性離子對的情況,也有學者[28]將412.0/327.9,412.0/355.9分別作為定量離子對和定性離子對的情況。這是由于在不同的儀器條件和試驗環(huán)境下,不同離子對的響應有所不同。將質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL的MPD標準溶液在優(yōu)化后的質(zhì)譜和色譜條件下進行分析,提取離子流色譜圖和信噪比如圖3所示。

圖3 雙炔酰菌胺XIC圖及信噪比圖

由圖3可知,412.0/327.9,412.0/355.9兩對離子對具有較強的信號強度和較高的信噪比,與李建敏[28]的結(jié)果相似,這可能與所采用的儀器品牌和型號比較接近,MPD響應具有一定相似性有關。通常將響應強度相對較大的離子碎片設定為定量離子,響應強度相對較弱的離子碎片設定為定性離子,由圖3可知,327.9離子碎片的響應值較355.9離子碎片的高,故選取412.0/327.9作為定量離子對,412.0/355.9作為定性離子對。

2.4 基質(zhì)效應

分別配制黃瓜基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線,采用標準曲線斜率比較法來進行基質(zhì)效應評價。將溶劑標準溶液和黃瓜基質(zhì)標準溶液分別注入儀器進行測定,以MPD濃度為X軸、412.0/327.9定量離子峰面積為Y軸作標準曲線。結(jié)果表明,在0.01～0.50 μg/mL范圍內(nèi),兩組標準工作液的標準曲線線性關系均良好。黃瓜基質(zhì)標準曲線斜率對溶劑標準曲線斜率的比值為 0.95,在0.8～1.2范圍內(nèi),基質(zhì)效應不明顯,說明黃瓜基質(zhì)對MPD含量檢測結(jié)果的影響較小。這可能是由于試驗過程中在樣品提取凈化后加入一定量的超純水對樣品進行稀釋后再上機檢測,使得進入檢測儀器的基質(zhì)濃度降低,減弱了基質(zhì)干擾。因此,結(jié)合試驗操作的簡便和檢測結(jié)果的準確性等綜合因素考察,采用50%乙腈水作為溶劑配制標準曲線。

2.5 標準曲線

將溶劑標準曲線注入UPLC-MS中,以標準工作液質(zhì)量濃度為X軸,以MPD定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為Y軸進行線性回歸建立標準曲線,結(jié)果見圖4。

圖4 雙炔酰菌胺標準曲線圖

由圖4可知,在優(yōu)化后的儀器條件下,MPD保留時間為2.64 min,峰型較好,無明顯拖尾或前移等情況,也未出現(xiàn)異常峰,響應值能滿足定量需求。通過相對豐度比計算,符合表3的判定要求。當MPD質(zhì)量濃度為0.01～0.50 μg/mL時,標曲的線性關系良好,其回歸方程為Y=16 969X-11 086,R2=0.999 8,符合試驗要求。

2.6 回收率和精密度

在陰性黃瓜樣品中分別添加1,5,10倍定量限濃度的MPD標準溶液進行回收率試驗,計算出精密度結(jié)果見表5。

表5 黃瓜中添加雙炔酰菌胺標準品的回收率和精密度試驗結(jié)果

由表5可知,黃瓜中MPD的回收率分別為89.6%,93.8%,96.0%,RSD為0.72%～1.80%。彭茂民等[29]用酸化后的乙腈提取番茄并通過分散固相萃取法(QuEChERS)凈化,再采用UPLC-MS-MS測定其中MPD殘留量,平均回收率為84.5%～98.4%,與試驗結(jié)果相似。MPD回收率為89.6%～96.0%,說明試驗方法對黃瓜的處理步驟能在有效排除雜質(zhì)干擾的基礎上,盡可能地弱化其他試驗因素對MPD殘留量檢測的影響,測定結(jié)果與真實值接近。

2.7 檢出限

取標準曲線第1個點的標準溶液,即質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL的MPD溶液注入UPLC-MS,測得信噪比。以正離子模式信噪比為響應,按照S/N=3或10代入計算,測得LOD值和LOQ值分別為0.003,0.009 mg/kg。

2.8 實際樣品檢測

隨機在市場上抽取10份黃瓜作為待測樣品,按照試驗步驟處理、上機分析,樣品中MPD含量結(jié)果見表6。

表6 黃瓜中雙炔酰菌胺含量測定結(jié)果?

抽檢的10份黃瓜中,有5份樣品中檢出MPD殘留,范圍為0.081 6～0.177 mg/kg,檢出率達50%。GB 2763—2021中規(guī)定,MPD的ADI值為0.2 mg/kg·BW,且黃瓜中MPD的臨時最大殘留限量為0.2 mg/kg,說明此次抽檢的樣品存在不同程度使用MPD農(nóng)藥的情況,但是均未超出標準所允許殘留的最大限值。

3 結(jié)論

采用UPLC-MS法對黃瓜中雙炔酰菌胺進行檢測,分別優(yōu)化了質(zhì)譜、色譜條件并考察了不同流動相的洗脫效果以及基質(zhì)效應的影響。結(jié)果表明,樣品經(jīng)QuEChERS法凈化后用0.1%甲酸水和乙腈作為流動相進行測定,線性關系良好,回收率及精密度等符合分析要求。該方法操作簡便快捷、準確度高、穩(wěn)定性好、用時短,滿足黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量的分析測定。后續(xù)可考察試驗方法對其他品種的水果或蔬菜中雙炔酰菌胺殘留量的測定,不斷優(yōu)化檢測方法,加強對雙炔酰菌胺應用的風險監(jiān)測。