高玉亭，李 振，趙彩虹，趙雨薇，王 澤，郝慧琴

（山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 晉中 030619）

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是炎癥、腫脹和關節(jié)破壞，主要影響外周關節(jié)[1]。治療RA 的傳統(tǒng)藥物主要有非甾體抗炎藥和改善病情的抗風濕藥物等。目前用于治療RA 的藥物價格昂貴，并且經常對患者的健康造成不利影響，迫切需要通過更加安全、有效和廉價的治療方法應用于RA 治療，而針對RA 炎癥的局部應用藥物是潛在的治療方法[2]。中醫(yī)藥在RA 治療中具有巨大的潛力，局部使用中藥膏劑用于治療關節(jié)炎等肌肉骨骼損傷和疼痛有著悠久的歷史并廣泛應用于臨床[3-4]。

傅山風濕外治方來源于清代山西名醫(yī)傅山《大小諸證方論》，由牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥6 味藥組成，具有祛風勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效，局部應用于治療“痹證”[5]。課題組前期研究結果顯示，傅山風濕外治方對RA 的治療作用可能與抑制Notch1/Jagged1 通路激活，調節(jié)Th1/Th2 細胞因子平衡有關[6]，但其對Notch2/DLL1 通路的影響尚不明確。Notch2 調控破骨細胞生成介導RA 骨破壞，而RA 以慢性炎癥和關節(jié)破壞為主要特征，因此，本研究探討局部應用傅山風濕外治方對膠原誘導性關節(jié)炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠炎性細胞因子和Notch2 表達的影響，以期為局部應用傅山風濕外治方治療RA提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.2 傅山風濕外治方外治方的制備

黃明膠（Cat. No.1812001）購自東阿阿膠股份有限公司，天南星（Cat. No.180101）和羌活（Cat. No.181101）購自山西元和堂中藥有限公司，乳香（Cat.No.18180405402）購自河北百合中藥飲片有限公司，沒藥（Cat. No.465180701）購自安國市遠元藥業(yè)有限公司，經鑒定質量符合國家藥典標準。將以上藥物冷凍干燥后分別使用粉碎機粉碎30 s，過80目篩后按4∶1∶1∶1∶1比例混合。生姜購自當地農貿市場，經鑒定質量符合國家藥典標準，清洗后在攪拌機中磨碎，3000 r·min-1離心20 min，取上清。將獲得的生姜汁加入前述混合物中，85℃下以300 r·min-1轉速攪拌20 min，常溫下繼續(xù)攪拌至冷卻得到膏劑，濃度為1 g·mL-1

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（Cat. No. 20022）購自美國Chondrex公司；完全/不完全弗氏佐劑（Cat. No. F5881、F5506）購自美國Sigma 公司；腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）和干擾素-γ（Interferon- γ，IFN- γ）ELISA 試劑盒（Cat. No.E02T0008, E02I0006, E02I0309, E02I0345）購自上海藍基生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（Cat. No.9108）、反轉錄試劑盒（Cat. No. RR047A）和熒光定量試劑盒（Cat. No. 639676）購自寶生物工程（大連）有限公司；Notch2 抗體（Cat. No. bs-21664R）、核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）抗體（Cat.No. Bioss bs-0465R）購自北京博奧森生物技術有限公司，Delta-like 配體蛋白1（delta-like ligand protein-1，DLL1）抗體（Cat. No. A14277）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，GAPDH 抗體（Cat. No. ab181602）購自Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（Cat. No. SE134）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Cat. No.PC0020）、ECL 顯色液（Cat. No. PE0010）購自北京索萊寶科技有限公司。天冬氨酸轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（Creatinine，Cr）測定試劑盒（Cat. No.C010-2-1、C009-2-1、C013-2-1、C011-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

正置顯微鏡購自德國徠卡公司，酶標儀購自美國賽默飛公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf股份公司，熒光定量PCR 儀購自新加坡Life Technologie 公司；化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 CIA大鼠模型構建、分組和給藥

采用隨機數字表法將36 只大鼠隨機分為正常組10 只和造模組26 只。CIA 大鼠模型構建參考已有方法進行[7]，簡而言之，按1∶1 將牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑混合并乳化，按每只5 mL在大鼠尾跟和背部進行多點皮下注射。第7 天，將弗氏完全佐劑替換成不完全弗氏佐劑，按每只0.3 mL 腹腔注射進行加強免疫。第14天，對造模組大鼠進行關節(jié)炎指數評分[8]，評分≥4分則判定為造模成功用于后續(xù)實驗[9]。將造模成功的20 只大鼠按隨機數字表法平均分為模型組和傅山風濕外治方組各10 只。第14 天，將0.4 mL（根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算）傅山風濕外治方藥膏均勻涂抹于大鼠踝關節(jié)，覆蓋紗布并使用塑料薄膜固定以防止被大鼠舔食。正常組和模型組給予等體積生理鹽水局部涂抹。每天更新2次，連續(xù)使用42天。

1.5 標本采集

第56天，大鼠禁食過夜，3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，3000 r·min-1離心10 min，收集血清。取左踝關節(jié)滑膜組織液氮凍存，右踝關節(jié)、肝和腎組織4%多聚甲醛固定，取脾臟凍存。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 關節(jié)炎指數評分

2.4 王屋鎮(zhèn)各樹種的保護級別 王屋鎮(zhèn)古樹名木一級古樹21株，所占比例為22.3%；二級古樹48株，所占比例為51.1%；三級古樹25株，所占比例為26.6%(表4)。

第14天開始每周進行關節(jié)炎指數評分，評分于給藥前實施。由非實驗參與人員通過視覺檢查大鼠四肢關節(jié)的腫脹程度評估關節(jié)炎的嚴重程度。評分標準[8]為：0分：無關節(jié)紅腫；1分：踝關節(jié)或足趾的輕度紅腫；2 分：踝關節(jié)的中度紅腫；3 分：包括趾關節(jié)在內的全足明顯紅腫；4 分：全足明顯紅腫伴關節(jié)變形、功能障礙。評分最高為16分。

1.6.2 HE 染色檢測大鼠踝關節(jié)、肝和腎組織病理學變化

4%多聚甲醛固定大鼠踝關節(jié)（10% EDTA 脫鈣5 周）、肝和腎組織，脫水透明后石蠟包埋，切成4 μm薄片，將切片進行HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察病理學變化。采用盲法對踝關節(jié)H&E 染色進行病理學評分，評分標準[10]為：0 分：正常踝關節(jié)；1 分：正常滑膜，偶見單核細胞；2分：明確關節(jié)炎，滑膜襯里細胞幾層扁圓形，單個核細胞散在分布，單核細胞密集浸潤；3分：滑膜明顯增生，3層以上內襯細胞層排列松散，單核細胞密集浸潤；4分：嚴重滑膜炎伴血管增生，關節(jié)軟骨及軟骨下骨質侵蝕。

1.6.3 ELISA 檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ水平變化

分別設置空白對照孔、標準孔和待測樣本孔，分別加入100 μL樣品。在各孔中加入酶標記溶液50 μL，密封后37℃孵育反應1 h。各孔依次加入顯色劑A、B 50 μL，25℃避光反應10 min，加入終止液50 μL，使用酶標儀檢測450 nm 波長處光密度值，根據標準曲線計算大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 濃度。實驗重復3次，取平均值。

1.6.4 qRT-PCR 檢測大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平變化

使用Primer Premier 5.0 軟件分別設計Notch2、DLL1、NF-κBp65和β-actin基因引物并合成（表1）。提取大鼠踝關節(jié)滑膜組織和脾臟總RNA 并檢測其濃度和純度，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄條件37℃ 15 min，85℃ 5 s。qRT-PCR 檢測Notch2、DLL1、NF-κBp65mRNA 水平，20 μL 反應體系包括qPCR 預混液Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.0 μL，反應程序：95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 25 s，45 個循環(huán)。將基因表達水平標準化為肌動蛋白基因，并使用2－△△Ct分析方法進行計算。實驗重復3次，取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blot 檢測大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達水平變化

提取大鼠踝關節(jié)滑膜組織和脾臟組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳，半干轉膜法將蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Notch2（1∶1000）、DLL1（1∶1000）、NF-κBp65（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）一抗4℃孵育過夜。加入二抗（1∶3000）室溫孵育1 h，ECL 顯色液顯色并曝光拍照。使用Gelpro32軟件測定目標條帶灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.6.6 免疫組織化學檢測大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白陽性表達變化

將固定的踝關節(jié)修剪、脫鈣、脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm 薄片。切片烘干并脫蠟脫水處理后，在高溫高壓下使用枸櫞酸緩沖液抗原修復3 min。室溫下山羊血清封閉液封閉20 min 后，加入Notch2（1∶100）、DLL1（1∶100）、NF-κBp65（1:200）一抗，濕盒內4℃孵育過夜。滴加二抗，37℃恒溫20 min。滴加DAB顯色液進行顯色。使用蘇木精復染細胞核1 min，脫水透明，使用中性樹膠封片。使用顯微鏡觀察并拍照。Image J 軟件統(tǒng)計免疫組化陽性區(qū)域比例。實驗重復3次，取平均值。

1.6.7 大鼠肝腎功能水平變化檢測

按照試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清肝功能ALT、AST水平變化情況及腎功能BUN、Cr水平變化情況。實驗重復3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計方法

使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據以均值±標準差（±s）表示，如果符合正態(tài)分布，采用雙因素方差分析統(tǒng)計關節(jié)炎指數評分，其他實驗數據采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD 法進行多重比較，方差不齊時則采用Tamhance’s T2 法進行多重比較。如果不符合正態(tài)分布，則采用非參數檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節(jié)炎指數評分變化

大鼠關節(jié)炎指數評分結果顯示（表2），第14天，模型組和傅山風濕外治方大鼠關節(jié)炎指數評分顯著高于正常組，評分均大于4 分，表明CIA 大鼠模型構建成功。第14-42 天，傅山風濕外治方組大鼠關節(jié)炎指數評分與模型組相比無顯著差異（P>0.05）。第49-56天，傅山風濕外治方組大鼠關節(jié)炎指數評分顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）。

表2 各組大鼠關節(jié)炎指數評分變化（±s，n=10）

表2 各組大鼠關節(jié)炎指數評分變化（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組第14天0.00±0.00 5.50±2.66##8.17±1.47第21天0.00±0.00 6.50±2.88##6.83±2.14第28天0.00±0.00 7.33±3.20##6.67±2.94第35天0.00±0.00 8.33±3.72##7.33±2.73第42天0.00±0.00 8.17±2.86##6.33±2.42第49天0.00±0.00 10.17±1.94##6.50±3.83*第56天0.00±0.00 9.67±2.94##5.17±5.17**

2.2 各組大鼠踝關節(jié)病理學變化

通過HE 染色對各組大鼠踝關節(jié)病理學的評估表明，與正常組相比，模型組大鼠踝關節(jié)結構破壞增加，滑膜細胞增生，關節(jié)軟骨被侵蝕且炎性細胞浸潤。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠異常明顯減輕（圖1）。病理學評分結果表明（表3），與正常組相比，模型組大鼠踝關節(jié)病理學評分顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方大鼠大鼠踝關節(jié)病理學評分顯著降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠踝關節(jié)病理學評分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

表3 各組大鼠踝關節(jié)病理學評分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

注：與正常組相比， ##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組滑膜病理學評分0.00±0.00 2.80±0.52##1.35±0.28**TNF-α 1.61±0.11 6.18±0.25##2.68±0.14**IL-6 1.15±0.05 81.40±4.54##18.82±0.74**IL-17 2.50±0.13 8.82±0.60##5.14±0.15**IFN-γ 1.41±0.11 10.64±0.36##3.38±0.12**

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ 表達水平變化

ELISA 檢測結果顯示（表3），與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達水平顯著降低（P<0.01）。

2.4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NF-κBp65 mRNA表達水平變化

qRT-PCR 結果顯示（表4），與正常相比，模型組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA的表達顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65mRNA的表達顯著降低（P<0.01）。

表4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平（±s，n=10）

表4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組關節(jié)脾臟NF-κBp65 1.00±0.00 4.26±0.03##0.84±0.06**Notch2 1.00±0.00 4.17±0.06##1.51±0.19**DLL1 1.00±0.00 2.35±0.11##1.40±0.07**NF-κBp65 1.00±0.00 3.52±0.37##1.85±0.14**Notch2 1.00±0.00 4.22±0.30##1.02±0.08**DLL1 1.00±0.00 2.43±0.04##0.87±0.04**

2.5 各大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NFκBp65蛋白表達水平變化

Western blot 檢測結果顯示（圖2 和表5），與正常組相比，模型組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 蛋白的表達顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝滑膜關節(jié)和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 表達顯著降低（P<0.01）。

圖2 各大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達水平

表5 各組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達水平（±s，n=10）

表5 各組大鼠踝關節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組關節(jié)脾臟NF-κBp65 0.77±0.24 1.21±0.18##0.16±0.05**Notch2 0.58±0.30 2.31±0.59##0.80±0.06**DLL1 0.98±0.21 3.87±0.27##2.00±0.06**NF-κBp65 0.83±0.22 1.26±0.28##0.24±0.09**Notch2 0.82±0.19 2.74±0.06##1.20±0.06**DLL1 0.67±0.61 1.79±0.04##0.28±0.01**

2.6 各組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組織化學分析

免疫組織化學檢測顯示（圖3 和表6），正常組、模型組、傅山風濕外治方組大鼠踝關節(jié)成纖維滑膜細胞和巨噬細胞等均有不同程度的Notch2、DLL1 和NFκBp65 陽性表達。與正常組相比，模型組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1 和NF-κBp65 陽性表達增多（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65陽性表達減少（P<0.01）。

圖3 各組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65 免疫組化代表性圖像（×100）

表6 各組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

表6 各組大鼠踝關節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

NF-κBp65 3.59±0.49 40.82±2.12 ##28.13±3.20**組別正常組模型組傅山風濕外治方組Notch2 1.39±0.16 31.26±1.91##13.77±1.60**DLL1 3.14±0.66 41.60±2.10 ##19.38±1.10**

2.7 各組大鼠肝腎組織病理學和血清AST、ALT、BUN、Cr水平

肝腎組織病理學結果表明（圖4），模型組和傅山風濕外治方組大鼠的肝腎組織均未見明顯的病理損傷。血清AST、ALT、BUN和Cr水平檢測結果表明（表7），傅山風濕外治方組大鼠血清AST、ALT、BUN和Cr無顯著變化（P>0.05）。

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

組別正常組模型組傅山風濕外治方組AST（U·L-1）43.74±3.06 42.90±3.56 43.84±3.97 ALT（U·L-1）186.75±18.10 181.81±23.83 187.14±29.25 BUN（mmol·L-1）5.44±0.69 5.60±0.64 5.56±0.72 Cr（mmol·L-1）0.12±0.02 0.11±0.05 0.12±0.05

3 討論

傅山風濕外治方包括牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥等藥味，具有祛風勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效。牛皮膠屬于皮膠類藥物，主要偏于外用，主要成分為明膠[11]。明膠作為一種變性膠原蛋白，已被證明是一種有吸引力的藥物載體材料[12]。膠原蛋白經酶水解后被吸收并分布到關節(jié)組織，具有鎮(zhèn)痛和抗炎特性[13]。天南星含有類黃酮成分，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[14]。生姜及其主要成分酚類化合物具有抗氧化和抗炎活性[15]。羌活被廣泛用于RA 治療，主要含有香豆素和酚酸類化合物，具有鎮(zhèn)痛和抗炎活性[16]。乳香和沒藥作為經典藥對，具有協(xié)同抗炎、鎮(zhèn)痛及促進透皮等作用[17]。本研究表明，傅山風濕外治方降低了CIA 大鼠的關節(jié)炎指數評分和病理學評分，減少了關節(jié)損傷，緩解了CIA大鼠的關節(jié)炎嚴重程度，說明傅山風濕外治方各味藥共同發(fā)揮了對關節(jié)炎的治療作用。

慢性炎癥是RA 的重要病理特征，炎性細胞因子在RA 中的表達水平與RA 患者慢性滑膜炎的嚴重程度呈正相關[18]。TNF-α、IL-6 和IFN-γ 炎性細胞因子滲入滑膜中將促進炎癥反應的產生，導致關節(jié)破壞[19]。而IL-17 會刺激RA 滑膜成纖維細胞產生炎性細胞因子，引發(fā)RA 的骨侵蝕和組織破壞[20]。因此，抑制炎性細胞因子將有助于改善RA 的炎癥反應和關節(jié)破壞。本研究對血清炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)傅山風濕外治方降低了炎性細胞因子的表達，表明傅山風濕外治方對RA的治療作用可能與其抗炎作用有關。

RA 的關節(jié)損傷往往和破骨細胞活性增強密切相關，Notch2 被認為是RA 破骨細胞活化的重要效應分子，Notch2/DLL1 軸對破骨細胞生成的調節(jié)可能是改善RA患者骨侵蝕的重要靶點[21]。同時，炎性細胞因子促進了Notch2 的表達和信號轉導，這種炎性細胞因子介導的Notch2激活依賴于NF-κBp65與啟動子之間的直接相互作用[22]。在炎癥環(huán)境中，Notch2 與NF-κB 和炎性細胞因子形成正反饋，增強破骨細胞活性、促進骨侵蝕、導致骨破壞[23]。因此，本研究重點從Notch2信號通路對傅山風濕外治方的治療機制進行了探討。本研究中，CIA 大鼠Notch2/DLL1 軸異常激活，NFκBp65 表達升高，而傅山風濕外治方治療降低了Notch2、DLL1和NF-κBp65在mRNA 和蛋白水平的表達，表明傅山風濕外治方可能通過抑制Notch2/DLL1軸在RA 中的激活，阻斷Notch2 與NF-κB 和炎性細胞因子的正反饋，發(fā)揮了對關節(jié)炎的治療作用。此外，傅山風濕外治方的安全性缺乏客觀證據，因此本研究主要通過檢測對肝腎功能的影響進一步探討了其安全性，結果表明對肝腎無毒副作用。

綜上，傅山風濕外治方可緩解CIA 大鼠的關節(jié)炎癥狀，減輕關節(jié)損傷，且對肝腎無毒副作用，其機制可能與降低炎性細胞因子，下調Notch2、DLL1 和NFκBp65的表達有關。但由于目前尚無公認的用于類風濕關節(jié)炎治療的外用藥物，本研究未設置陽性對照組。此外，本研究未能完全闡明傅山風濕外治方對炎性細胞因子的調節(jié)是否與Notch2/DLL2 軸以及NFκBp65 的協(xié)同作用有關，其相互作用和具體機制有待進一步探討。本研究為傅山風濕外治方治療RA 提供了研究基礎和思路，也為RA 外用藥物的發(fā)掘提供了參考，然而傅山風濕外治方作為一種治療RA 的外用藥物在臨床的應用和推廣仍然需要更深入的基礎和臨床研究。