陳胤臣，任晗歸，席志超＊＊，徐宏喜＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 上海 201203；2. 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心 上海 201203）

根據(jù)GLOBOCAN 2020 年發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)的癌癥發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)占全球的23.7%和30.2%，且發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)[1]。研發(fā)安全有效的抗腫瘤藥物一直以來(lái)都是癌癥研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。天然藥物是發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物的寶庫(kù)，為藥物創(chuàng)新提供寶貴資源[2]，其中不乏結(jié)構(gòu)新穎，低毒高效的天然藥效物質(zhì)，值得更深入地研究。

人參（Panax ginsengC. A. Meyer）為五加科人參屬植物人參的根和根莖，被譽(yù)稱(chēng)為“中藥百草之王”。中醫(yī)認(rèn)為其具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智等功效[3]。20 世紀(jì)60 年代，F(xiàn)ujita 等[4]日本天然藥物化學(xué)家首次分離出了多種人參皂苷，并鑒別出化學(xué)結(jié)構(gòu)。隨后越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始著眼于人參皂苷的藥理活性研究，如Rb1 被證明對(duì)心血管疾病和代謝類(lèi)疾病等均具有一定的治療作用[5]。其中，CK被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病和神經(jīng)保護(hù)等作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[6]。1997 年，Wakabayashi 等[7]首次發(fā)現(xiàn)CK 可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，從此開(kāi)啟了研究CK 抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究的熱潮。迄今，CK 已經(jīng)被證實(shí)對(duì)肝癌、肺癌和胃癌等多種癌癥具有顯著的抑制作用[8]，并且與順鉑（Cisplatin，DDP）[9]、環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）[10]等常用化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，可以有效地提高治療效果。進(jìn)一步深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，CK 具有多重抗腫瘤作用機(jī)制，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯等。

作為一種腸道代謝產(chǎn)物，CK 不能從人參中直接提取獲得，需要由Rb1 等天然人參皂苷經(jīng)腸道轉(zhuǎn)化而成[11]。盡管Akao 等[12]的實(shí)驗(yàn)證明，CK 比Rb1 具有更高的生物利用度，但是代謝動(dòng)力學(xué)研究表明，CK 在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化速率有限，并且一些腸道細(xì)菌會(huì)影響CK的生物轉(zhuǎn)化效率[13]。因此，實(shí)現(xiàn)CK 的體外人工制備，提升CK 的產(chǎn)量，將對(duì)降低CK 價(jià)格和促進(jìn)CK 開(kāi)發(fā)成有潛力的臨床藥物具有重要意義。目前，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化或生物合成是獲得CK 的主要途徑。多種酶和微生物已被用于提高CK 的生物轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)了多種天然人參皂苷向CK 的轉(zhuǎn)化的過(guò)程。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了生物合成CK 的多種途徑及關(guān)鍵酶和基因，可將結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單化合物合成為CK，這大大加快了制備CK的研究進(jìn)展。

近年來(lái)，徐宏喜教授團(tuán)隊(duì)一直致力于人參的化學(xué)、作用機(jī)制和臨床應(yīng)用的研究。在化學(xué)研究方面，課題組利用包括UPLC-QTOF-MS/MS 在內(nèi)的多種方法，成功發(fā)現(xiàn)用于區(qū)分生曬參與紅參的9 種人參皂苷標(biāo)志物和特征性組分，進(jìn)一步完善了生曬參與紅參的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。為了促進(jìn)林下山參年份鑒定檢測(cè)方法的發(fā)展，課題組基于UPLC-Q-TOF/MS 的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，鑒定出可用于區(qū)分4-10 年、11-15 年、16-20 年林下參的指標(biāo)成分群，為山參的年份鑒定提供了新方法?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，課題組進(jìn)一步改進(jìn)了人參皂苷的提取方法以及檢測(cè)條件，優(yōu)化了野山參提取液的制備工藝并實(shí)現(xiàn)了野山參口服液的成果轉(zhuǎn)讓。此外，還開(kāi)展了一系列人參臨床應(yīng)用的研究，發(fā)現(xiàn)紅參復(fù)方提取物具有降血脂的功效，對(duì)于“虛證”的患者具有抗疲勞的功效，且沒(méi)有明顯“上火”副作用和其他不良事件[16]。這些研究為規(guī)范人參質(zhì)量，促進(jìn)人參從傳統(tǒng)中草藥向現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)?；谏鲜鯟K 的重要藥理活性，課題組著重開(kāi)展了CK的藥理藥效研究，發(fā)現(xiàn)CK 可以有效緩解缺血性腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，緩解腦損傷后導(dǎo)致的身體機(jī)能障礙；CK 還可以特異性殺傷休眠期癌細(xì)胞，從而抑制腫瘤的增殖和復(fù)發(fā)。以上研究成果將進(jìn)一步闡明“百草之王”人參藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示CK 的藥效作用機(jī)制，促進(jìn)以CK為主要成分的新型藥物研發(fā)及應(yīng)用。

本篇綜述系統(tǒng)梳理并總結(jié)了CK 的生物制備及抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展。按照不同生物制備方法，對(duì)近10 年來(lái)CK 生物制備的最新研究成果進(jìn)行了歸類(lèi)，整理了各方法的反應(yīng)條件和效率產(chǎn)量，同時(shí)對(duì)不同方法的優(yōu)勢(shì)和不足進(jìn)行了探討。在CK 抗腫瘤研究方面，本文根據(jù)CK 的作用機(jī)制進(jìn)行歸納分類(lèi)，分別從CK 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬等方面進(jìn)行闡述，并對(duì)其成藥潛力進(jìn)行了分析與評(píng)價(jià)。

1 CK生物制備的研究進(jìn)展

CK 的生產(chǎn)制備方法主要為化學(xué)合成法、生物轉(zhuǎn)化法以及生物合成法（圖1）[17]。通過(guò)化學(xué)合成法合成CK 具有反應(yīng)速度快和成本低廉的特點(diǎn)，但該方法步驟繁瑣、產(chǎn)率較低且副產(chǎn)物多，因此相關(guān)的研究及報(bào)道較少[18]。相較而言，采用生物轉(zhuǎn)化法和生物合成法制備CK 是更常用的方法。生物轉(zhuǎn)化法主要通過(guò)酶解其他二醇型人參皂苷C-3 和C-20 位上的多余糖基得到CK，所用的生物催化劑多為酶和微生物。生物轉(zhuǎn)化法具有專(zhuān)屬性高、制備流程簡(jiǎn)便和產(chǎn)率高的特點(diǎn)，但通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法制備CK 的成本較高且對(duì)轉(zhuǎn)化前體的純度有一定要求。生物合成法則是通過(guò)將結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉的化合物合成為CK，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到CK 的從頭生物合成。這大大縮減了生產(chǎn)成本，使CK 可以由價(jià)格低廉的原料合成獲得，但是生產(chǎn)周期仍然較長(zhǎng)[19]。

圖1 CK的生物制備示意圖

1.1 CK的生物轉(zhuǎn)化法

根據(jù)使用的生物催化劑種類(lèi)，CK 的生物轉(zhuǎn)化法可以分為酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法是利用不同種類(lèi)和來(lái)源的酶，酶解其他人參皂苷或人參皂苷結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，從而獲得CK 的方法。主要使用的酶包括單一糖苷酶（如β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等）和混合酶（黑曲霉胞外酶、蝸牛酶等）（表1）。

表1 CK的生物轉(zhuǎn)化

β-葡萄糖苷酶是一類(lèi)最常用的單一糖苷酶，它能將多種人參皂苷或人參皂苷類(lèi)似物轉(zhuǎn)化為CK。Zhong等[20]通過(guò)在大腸桿菌BL21 中克隆表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因（bgy1）來(lái)獲得β-葡萄糖苷酶，發(fā)現(xiàn)其能將絞股藍(lán)苷XVII 轉(zhuǎn)化成為CK。Zhang 等[21]從短雙岐桿菌ATCC 15700（BbBg1）中獲得的新型β-葡萄糖苷酶，可以將人參皂苷Rd 轉(zhuǎn)化為CK，其12 小時(shí)內(nèi)的摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)96%。此外，Shin 等[22]從嗜熱厭氧菌中獲得了一種能夠水解人參皂苷多位點(diǎn)上糖基團(tuán)的β-葡萄糖苷酶，該酶可以將Rb1、Rb2 和Rc 轉(zhuǎn)化為CK，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。Choi 等[23]通過(guò)改造β-葡萄糖苷酶得到L213A變異型酶，該酶能更高效地將Rc轉(zhuǎn)化為CK，轉(zhuǎn)化效率是自然酶的1.5倍。

除使用單一生物酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化外，一些復(fù)合酶也被用于制備CK。如Zheng 等[24]發(fā)現(xiàn)柚皮苷酶（鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的混合物）可以酶解二醇型絞股藍(lán)苷，將其轉(zhuǎn)化成CK。Li等[25]通過(guò)蝸牛酶（纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖醛酸酶的復(fù)合物）將二醇型人參皂苷水解為CK。Jiang 等[26]和Jeong 等[27]發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外酶對(duì)于人參皂苷有很強(qiáng)的生物催化活性，能將含量較大的人參皂苷如Rb1 等轉(zhuǎn)化為CK。Shin 等[28]將α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶同β-葡萄糖苷酶聯(lián)合使用，大大增強(qiáng)了紅參提取物中Rb1、Rb2 和Rc 轉(zhuǎn)化為CK 的效率，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)率為348 mg·L-1·h-1。

微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列生物酶，對(duì)含量較高的人參皂苷進(jìn)行有目的的結(jié)構(gòu)改造與修飾，從而得到稀有人參皂苷的方法（表1）。如LH4 是從韓國(guó)泡菜中分離得到的類(lèi)食品乳桿菌，其可以在30℃、pH 6.0 的條件下將Rb1 水解成CK，摩爾轉(zhuǎn)化率為88%[29]。類(lèi)似地，Yoo 等[30]用從泡菜中分離得到的短乳桿菌發(fā)酵人參細(xì)根，能高效地制備CK。Wang 等[31]利用冬蟲(chóng)夏草菌將Rb1 轉(zhuǎn)化為CK，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)82%。

1.2 CK的生物合成法

CK 的生物合成法是利用合成生物學(xué)在微生物中構(gòu)建異源途徑生產(chǎn)CK[32]，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本和提升產(chǎn)量的目的的方法（表2）[33]。CK的生物合成首先通過(guò)對(duì)CK 的生物合成酶基因等進(jìn)行表征與鑒定，精確控制CK 的生物合成途徑。其次需選取適合實(shí)現(xiàn)生物合成途徑的細(xì)胞工廠，多項(xiàng)CK 的生物合成研究已證實(shí)，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的人參酵母，其安全性高和遺傳背景較為明確，已被公認(rèn)為是常用來(lái)生產(chǎn)CK 的細(xì)胞工廠[34]。

表2 CK的生物合成

CK 生物合成的主要難點(diǎn)在于對(duì)專(zhuān)一生產(chǎn)CK 的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)（Uridine diphosphate glucosyltransferase，UGTs）的篩選，因各二醇型人參皂苷結(jié)構(gòu)相近，基本母核均為四環(huán)三萜，CK 的特異性主要體現(xiàn)在C-20 位的糖苷鍵。而各類(lèi)UGTs 能夠通過(guò)催化不同種原人參二醇，將不同糖苷鍵連在特定位點(diǎn)，最終生產(chǎn)出各類(lèi)人參皂苷[35]。因而，從各類(lèi)UGTs中篩選出能將葡萄糖特異地修飾在原人參二醇的C-3及C-20位點(diǎn)的UGTs對(duì)CK的生物合成至關(guān)重要。

2014 年，Yan 等[36]成功鑒定出UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶——UGTPg1，這是首個(gè)用于植物四環(huán)三萜類(lèi)底物糖基化的UGT，成功實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到CK 的生物從頭合成。在此基礎(chǔ)上，Li 等[37]利用解脂耶氏酵母構(gòu)建了一條制備CK 的生物合成途徑，通過(guò)增加天然甲羥戊酸途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素P450氧化還原酶生成，進(jìn)而提升了CK 的合成產(chǎn)量。Wang 等[38]通過(guò)增強(qiáng)酵母中UDP-葡萄糖合成基因的表達(dá)，構(gòu)建了能特異性生產(chǎn)CK 的菌株—YS01-CK，使CK 的產(chǎn)量達(dá)到了1.17 g·L-1。Nan等[39]在釀酒酵母菌株WLT-MVA5中誘導(dǎo)PGM2、UGP1和UGTT基因表達(dá)，獲得了能高效合成CK 的菌株WLN1。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中甘油提供的碳含量達(dá)到20%時(shí)，CK的產(chǎn)量最高（1.7 g·L-1），摩爾轉(zhuǎn)化率為77.37%。

CK 的生物制備（包括生物轉(zhuǎn)化和生物合成）在近年來(lái)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，使CK 的制備更為簡(jiǎn)便和高效，為其大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。在CK 的生物轉(zhuǎn)化方面，其發(fā)展主要體現(xiàn)在：拓寬轉(zhuǎn)化途徑、提升摩爾轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量和簡(jiǎn)化反應(yīng)步驟等[40]。例如，引入黑曲霉胞外酶拓寬了轉(zhuǎn)化底物譜，不但可以轉(zhuǎn)化Rb1，還可以轉(zhuǎn)化Rc、Compound Y 和Compound O[26-27]。在生物合成CK 方面，其進(jìn)步主要體現(xiàn)在CK 細(xì)胞工廠及生物合成酶方面的優(yōu)化，尤其是對(duì)UGTs 研究的深入，使葡萄糖修飾能特異性地定位在原人參二醇的C-20 位點(diǎn)，提升了CK 合成的特異性。此外，多種生物合成新技術(shù)的應(yīng)用如基因組工程和代謝工程等，也使CK 的合成更加高效。例如，采用基因干擾手段提高菌株中特定基因的表達(dá)，使改造過(guò)的菌株成為特異性生產(chǎn)CK 的菌株，可顯著提升CK合成的專(zhuān)屬性和產(chǎn)量[39]。

2 CK抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展

研究證實(shí)，CK 對(duì)于多種腫瘤都具有顯著地抑制作用，并通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮療效（圖2），在癌癥治療中有一定的臨床應(yīng)用前景。本文從腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、自噬及耐藥等方面，對(duì)CK 的抗腫瘤藥理活性進(jìn)行了系統(tǒng)地總結(jié)與闡述。

圖2 抗腫瘤活性及作用機(jī)制

2.1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯

細(xì)胞周期異常引起的細(xì)胞增殖失控是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一[41]，因此阻滯腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，CK 對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞的周期均具有調(diào)控作用。例如，CK 可通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄因子1（Bcl2-associated transcription factor 1，Bclaf1）和抑制低氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）介導(dǎo)的糖酵解代謝途徑，誘導(dǎo)肝癌Bel-7404 細(xì)胞和Huh7 細(xì)胞發(fā)生G0/G1期周期阻滯，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明CK 可呈劑量依賴(lài)地抑制腫瘤生長(zhǎng)，并顯著降低了腫瘤組織中Bclaf1及糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)[42]。Wang 等[43]發(fā)現(xiàn)CK 能顯著抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞和腫瘤抑制因子p53 突變型SW480 細(xì)胞的增殖，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期。此外，腎癌RCC細(xì)胞中的睪丸相關(guān)的高度保守的致癌性長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Testisassociated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR）與非癌細(xì)胞相比表達(dá)異常升高。Chen等[44]發(fā)現(xiàn)CK 能顯著抑制THOR 的表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)地阻滯RCC細(xì)胞從G2向M期的轉(zhuǎn)化。

2.2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主而有序的程序性死亡，細(xì)胞增殖與凋亡的失衡是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一[45]。研究表明，CK 可通過(guò)調(diào)控多種蛋白及分子通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。如CK 可呈劑量依賴(lài)地誘導(dǎo)卵巢癌CAOV3 細(xì)胞發(fā)生含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）Caspase-8 介導(dǎo)的外源性途徑以及Caspase-9調(diào)控的內(nèi)源性凋亡，進(jìn)一步激活Caspase-3 蛋白，誘導(dǎo)多聚（ADP-核糖）聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]的剪切，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[46]。CK 通過(guò)激活肝癌SMMC-7721 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路，引起Caspase-3 蛋白剪切，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[47]。此外，在鼻咽癌HK-1 細(xì)胞中，CK 可同時(shí)激活Caspase 蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing factor，AIF）易位和線粒體功能損傷，并在體內(nèi)證實(shí)了CK 對(duì)HK-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用[48]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CK還可通過(guò)誘發(fā)持續(xù)且高強(qiáng)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。如Yin 等[49]證實(shí)CK 可以增加宮頸癌Hela細(xì)胞中的鈣離子濃度，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子紊亂，降低蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇必需酶1α（Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）蛋白，增加磷酸化α 亞基的真核起始因子2（Phosphorylated α subunit of eukaryotic initiation factor 2，p-eIF2α）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（Enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）和Caspase-12 蛋白的表達(dá)水平，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.3 抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征[50]，其主要標(biāo)志物有基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）MMP-2 與MMP-9、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和E-鈣粘蛋白（E-cadherin）等。研究發(fā)現(xiàn)，CK 可以通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移來(lái)抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如Lee等[51]發(fā)現(xiàn)CK減少了膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞和U373MG 細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、同源盒轉(zhuǎn)錄因子Nanog、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Octamer binding protein 4，OCT4）和性別決定區(qū)Y 框蛋白2（Sex determining region Y-box 2，SOX2）的表達(dá)，同時(shí)降低MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞表型獲得間質(zhì)細(xì)胞特征的過(guò)程，其中當(dāng)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cadherin）表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin）表達(dá)增加，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)[52]。研究發(fā)現(xiàn)，CK可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的EMT 轉(zhuǎn)化，顯著上調(diào)E-cadherin 的mRNA 表達(dá)水平，減少N-cadherin 和波形蛋白（Vimentin）的mRNA 表達(dá)。其作用機(jī)制可能與CK 抑制磷脂酰肌醇三激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱(chēng)Akt）信號(hào)通路有關(guān)[53]。類(lèi)似地，彭等發(fā)現(xiàn)CK 顯著下調(diào)人肝癌HepG2 細(xì)胞中磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化Akt蛋白以及N-cadherin蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平，通過(guò)抑制EMT 過(guò)程降低HepG2 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[54]。此外，在裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，CK 通過(guò)降低信息沉默調(diào)節(jié)因子2 同源物蛋白1（Silent information regulator 2 homologue 1，SIRT1）的表達(dá)抑制了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[55]。

2.4 調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，能將受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器等在溶酶體中降解以供細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)利用[56]。大量研究表明，自噬對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有雙重調(diào)控作用[57]。有趣的是，CK 對(duì)于腫瘤細(xì)胞的自噬也具有雙重調(diào)控作用。一方面，CK 可通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤細(xì)胞增殖，例如CK 通過(guò)激活A(yù)549 細(xì)胞和肺腺癌H1975 細(xì)胞中的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’ -monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路，增強(qiáng)c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)生，抑制肺癌細(xì)胞的增殖[58]。另一方面，Oh 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，CK 可以通過(guò)阻斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-BE 和SH-SY5Y 細(xì)胞中自噬過(guò)程晚期的自噬體和溶酶體融合，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.5 增加抗腫瘤藥物敏感性

鑒于CK 在多種腫瘤中被證實(shí)具有潛在的治療作用，越來(lái)越多的研究著眼于將CK 與臨床抗腫瘤藥物進(jìn)行聯(lián)合使用。研究發(fā)現(xiàn)，CK 與化療藥物聯(lián)用不僅可以增強(qiáng)化療藥物的敏感性還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。例如，CK 與5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）聯(lián)用可顯著增強(qiáng)對(duì)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞的增殖抑制作用，減少EMT 轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[60]。將CK 與治療乳腺癌的常用藥物順鉑聯(lián)用，可增強(qiáng)順鉑對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖抑制作用[9]。此外，CK 還可增加對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Recombinant tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）藥物耐受的結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的敏感性，聯(lián)用導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞存活的蛋白表達(dá)下降，促凋亡蛋白的表達(dá)上升，進(jìn)而誘導(dǎo)死亡受體5（Death receptor 5，DR5）在細(xì)胞表面的表達(dá)增加[61]。值得注意的是，在使用CK作為聯(lián)用藥物時(shí)需考慮常規(guī)抗腫瘤藥物的使用劑量，避免產(chǎn)生拮抗作用。例如在CK 同順鉑聯(lián)合治療A549 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，較大劑量順鉑與CK 聯(lián)用（50 μg·mL-1CK+20 μg·mL-1順鉑）可協(xié)同誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡，而當(dāng)使用較小劑量順鉑同CK 聯(lián)用（1.5625 μg·mL-1CK+0.625 μg·mL-1順鉑）時(shí)會(huì)產(chǎn)生拮抗[62]。

以上研究表明，CK 在癌癥治療中通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮療效，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬和增加抗腫瘤藥物敏感性等，具有顯著的抗腫瘤作用。盡管現(xiàn)有研究已證實(shí)CK 對(duì)于多個(gè)蛋白和信號(hào)通路具有調(diào)控作用，但其直接作用的靶蛋白仍不明確，需對(duì)其抗癌作用機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。例如CK 可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但具體影響了自噬過(guò)程中的哪一環(huán)節(jié)尚未闡明；CK 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是否和自噬存在信號(hào)通路間的調(diào)控；線粒體是否為CK 作用的關(guān)鍵細(xì)胞器等問(wèn)題仍有待研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)CK在免疫性疾病中能夠抑制T細(xì)胞及免疫趨化因子的表達(dá)[63]，減輕自身免疫性關(guān)節(jié)炎。隨著近年來(lái)腫瘤免疫治療的發(fā)展，其在免疫應(yīng)答中的作用值得更詳細(xì)的研究。綜上所述，通過(guò)對(duì)CK 抗腫瘤作用機(jī)理的系統(tǒng)闡述進(jìn)一步提升了CK 的藥用價(jià)值，為其日后的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有積極意義。

3 討論與展望

CK 是二醇型人參皂苷在腸道內(nèi)的主要代謝物，具有較好的抗腫瘤活性，對(duì)治療結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[11]。隨著近年來(lái)對(duì)CK 抗腫瘤機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)CK 不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯[42-44]和細(xì)胞凋亡[46-49]，還具有調(diào)控細(xì)胞自噬[58-59]和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[51,53-55]等作用。此外，CK 作為輔助用藥在與臨床常規(guī)抗腫瘤藥物如順鉑[9]和環(huán)磷酰胺[10]等聯(lián)用時(shí)展現(xiàn)出了良好的協(xié)同抗腫瘤作用，具有增強(qiáng)常規(guī)抗腫瘤藥物療效和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性等作用。有研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，CK 的有效治療劑量往往小于其他人參皂苷[64]，且CK表現(xiàn)出更好的生物利用度。盡管目前尚無(wú)證據(jù)表明CK 發(fā)揮抗腫瘤作用的效應(yīng)基團(tuán)是什么，但相對(duì)于其他二醇型人參皂苷，CK含有的糖基較少，僅在C-20上連有一個(gè)葡萄糖基。這使得CK 比其他人參皂苷的分子量更小和極性較小[65]，更易透過(guò)細(xì)胞膜[65]，這可能是CK 對(duì)于具有較高抗腫瘤生物活性的潛在原因。

由于CK 不能從人參中直接提取獲得，研發(fā)高效制備CK 的方法十分必要。目前通過(guò)化學(xué)合成法制備CK 的產(chǎn)率較低、步驟繁瑣，因此優(yōu)化CK 的化學(xué)合成路線、工藝條件和提高合成產(chǎn)率非常重要。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法和生物合成法發(fā)展迅速，且各有優(yōu)勢(shì)。其中，生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化流程簡(jiǎn)便、中間產(chǎn)物少、選擇性好。除了使用β-葡萄糖苷酶等單一酶外，一些復(fù)合酶以及微生物也可以將不同類(lèi)型人參皂苷轉(zhuǎn)化為CK，不僅提高了CK 的產(chǎn)量還增加了轉(zhuǎn)化途徑，未來(lái)如何進(jìn)一步開(kāi)發(fā)能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化多種二醇型皂苷的酶和微生物，或許是CK 生物制備法實(shí)現(xiàn)突破的關(guān)鍵點(diǎn)。另外，生物合成法所用原料（葡萄糖、甘油等）廉價(jià)易得，大大降低了CK 的生產(chǎn)成本，為CK 的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)仍可進(jìn)一步降低生產(chǎn)周期與生產(chǎn)步驟的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

盡管目前對(duì)CK 的生物制備到抗腫瘤活性已有了較為全面的認(rèn)知，但尚存在一系列科學(xué)問(wèn)題需要更加深入和系統(tǒng)的研究，如提高CK 抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的精確性、進(jìn)一步明確CK 抗腫瘤的作用靶點(diǎn)、進(jìn)行系統(tǒng)的毒理評(píng)價(jià)及臨床療效研究等。在今后的CK 抗腫瘤活性研究中可采用更精準(zhǔn)的細(xì)胞和動(dòng)物腫瘤模型對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)，如建立臨床來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤自發(fā)模型和原位轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)模型等。關(guān)于CK 的抗腫瘤作用靶點(diǎn)研究，現(xiàn)有研究往往限定于經(jīng)典通路如PI3K/Akt[53]、AMPK/mTOR[54]等，沒(méi)有對(duì)其特異性靶點(diǎn)深度挖掘，后續(xù)研究應(yīng)著重探究其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，為臨床藥物開(kāi)發(fā)提供支持。此外，還可通過(guò)CK 的構(gòu)效關(guān)系研究，明確其抗腫瘤的活性基團(tuán)，進(jìn)一步優(yōu)化CK 的結(jié)構(gòu)。目前CK 抗腫瘤研究大多停留于藥效研究，應(yīng)加強(qiáng)系統(tǒng)的動(dòng)物毒理學(xué)研究及臨床研究，為后續(xù)CK 開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物提供科學(xué)權(quán)威的藥效學(xué)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)。并且，還可探究人體CK 轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要作用的腸道菌群，研究這些腸道菌群是否會(huì)影響CK 的生物活性進(jìn)而影響其抗腫瘤的效果。在藥劑學(xué)方面，或可通過(guò)納米載藥及抗體偶聯(lián)藥物等靶向劑型的開(kāi)發(fā)，可幫助CK 實(shí)現(xiàn)增效減毒的作用，促進(jìn)其藥物的研發(fā)與轉(zhuǎn)化。

綜上所述，在癌癥高發(fā)病率及抗腫瘤藥物研發(fā)成本居高不下的大背景下[66]，需要積極開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物。CK 在抗腫瘤活性方面已經(jīng)積累了較好的前期研究基礎(chǔ)，未來(lái)值得進(jìn)行更深入和系統(tǒng)的研究，最終服務(wù)于不幸罹患癌癥的患者。