詹 錚，潘彥宏，姜勁峰

（南京中醫(yī)藥大學針藥結(jié)合教育部重點實驗室 南京 210023）

迷走/副交感神經(jīng)支配范圍廣泛，亦參與調(diào)節(jié)人類記憶、認知、情感和情緒功能[1-4]，其活性高低甚至可作為預測和評價人類生理和心理健康的重要指標[5-6]，因此，調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)張力具有治療疾病的潛力。迷走神經(jīng)體表唯一分支（迷走神經(jīng)耳支）支配的耳甲作為直接調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)的體表接口[7]，其迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)已被用于癲癇[8]、抑郁癥[9]、胃腸動力障礙[10]、膿毒血癥[11]和糖尿病[12]等疾病的治療。機體是否還存在調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)張力的其它腧穴（部位）？

自迷走神經(jīng)參與電針足三里拮抗膿毒血癥全身性炎癥反應(yīng)的機制[13]發(fā)現(xiàn)以來，足三里已被視為除耳甲外調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)的另一重要體表接口。最新研究顯示，四肢腧穴（足三里和手三里）的迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)依賴于腧穴深部筋膜組織中PROKR2 神經(jīng)元分布和電流刺激強度[14-15]。換言之，臨床上能否準確地把握針刺（電針）足三里的深度、組織解剖層次和刺激強度，可能會影響其迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)的發(fā)揮，甚至可能因刺激強度的差異而產(chǎn)生效應(yīng)方向迥異的交感神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)。此外，在迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)（例如胃內(nèi)壓）的腧穴配伍研究[16]中，單獨電針下肢腧穴上巨虛或上肢腧穴曲池均升高胃內(nèi)壓，但兩者聯(lián)合電針卻并未出現(xiàn)1+1>1的協(xié)同增效作用。四肢腧穴在臨床應(yīng)用上是否均存在這些問題呢？

基于針灸臨床觀察，本團隊于前期理論研究中提出“八髎與外耳均可作為刺激迷走神經(jīng)的體表接口”的觀點[17]。隨后的實驗研究亦表明，迷走神經(jīng)參與了電針次髎拮抗內(nèi)毒素血癥的全身性炎癥反應(yīng)[18]。結(jié)合“骶神經(jīng)傳入-迷走神經(jīng)傳出”的神經(jīng)通路介導骶神經(jīng)刺激（SNS）顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎癥狀[19]的研究前沿，以及電針中髎、會陽改善尿失禁[20]、慢性前列腺炎/盆腔疼痛綜合征[21]等局部內(nèi)臟功能的臨床研究，提示以次髎為代表的八髎穴區(qū)域很可能是靶向迷走/副交感神經(jīng)的另一重要體表部位，能否作為迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)腧穴配伍領(lǐng)域除四肢腧穴外新的腧穴配伍選擇和補充呢？

基于此，本研究選取耳甲電針作為參照，以胃內(nèi)壓和心率變異性（Heart rate variability，HRV）作為指標，進一步明確電針次髎調(diào)控迷走神經(jīng)的效應(yīng)方向，并擬以兩者聯(lián)合電針是否具有協(xié)同增效作用來進一步闡述次髎調(diào)控迷走神經(jīng)的效應(yīng)方向，以期為臨床迷走神經(jīng)調(diào)控提供新的腧穴配伍選擇。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取健康成年雄性SD 大鼠24 只（體質(zhì)量220-250 g），由浙江省醫(yī)學科學院提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（浙）2020-0002，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，保持室溫25℃，相對濕度50%-70%，自由獲取飼料和水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將24 只雄性SD 大鼠按體質(zhì)量由高到低依次編號1-24，再配以隨機數(shù)字表，隨機分為耳甲組、次髎組和“耳甲+次髎”組，每組8 只。實驗過程嚴格遵循“3R”原則和科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。本實驗通過了南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的倫理審查（批號：012071001617）。具體實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程示意圖

1.2 主要試劑和儀器

烏拉坦（氨基甲酸乙酯，上海麥克林生化科技有限公司）；韓氏電針儀（HANS-200A，南京濟生醫(yī)療科技有限公司）；多道生理信號采集系統(tǒng)（RM6240，成都儀器廠）；壓力換能器（YPJ01，成都儀器廠）；恒溫板（ST-1 型，成都儀器廠）；生物信號采集分析系統(tǒng)（Microl401-3，CED，英國）；無菌針灸針（0.35 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；自制胃內(nèi)置球囊測壓探頭。

1.3 實驗方法

實驗前大鼠禁食12 h，允許自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦（0.5 mL·100 g-1）麻醉后，剃凈其上腹部毛并常規(guī)消毒，再將其仰臥位放于恒溫板（37±1）℃上。

1.3.1 胃內(nèi)壓檢測

采用囊內(nèi)壓實驗法檢測胃內(nèi)壓[22]：①于大鼠劍突下1 cm、腹部正中線左側(cè)肋緣處，作長0.5 cm 左右的切口。用玻璃分針小心地挑起十二指腸，在其距幽門0.5-1 cm 處用手術(shù)剪刀對十二指腸作約0.2 cm 長的縱向切口；②把連接多道生理信號采集系統(tǒng)的壓力換能器前端的球囊從切口處緩緩置入，并沿十二指腸向上輕推，直到球囊準確置入胃竇區(qū)，再縫合手術(shù)切口、固定導管，并用無菌紗布覆蓋切口；③將約0.1 mL 的水注入球囊，緩慢調(diào)節(jié)囊內(nèi)水容量使其基礎(chǔ)壓力保持在0.8 kPa 左右。當胃內(nèi)壓波形圖維持穩(wěn)定狀態(tài)30 min以上時，記錄囊內(nèi)1 min 的壓力值作為胃內(nèi)壓基線值。穩(wěn)定狀態(tài)下的胃內(nèi)壓波形圖見圖2。

圖2 正常大鼠穩(wěn)定狀態(tài)下的胃內(nèi)壓波形圖

1.3.2 HRV檢測

采用Ⅱ?qū)?lián)心電圖模式檢測HRV[23]：①無菌針灸針分別刺入大鼠的右上肢、右下肢和左下肢皮下，并依次連接NEG、EARTH 和POS 電極；②打開生物信號采集分析系統(tǒng)，在Lab Chart 計算機軟件上輸入?yún)?shù)[濾波：2 k·s-1，量程：5 mV，低通道：500 Hz；高頻（HF）：0.75-2.5 Hz，低頻（LF）：0.2-0.75 Hz，極低頻（VLF）：0-0.2 Hz]，在記錄胃內(nèi)壓的同時，同步記錄HRV（HF、LF、VLF、LF/HF）。

1.4 干預方法

于大鼠左側(cè)耳甲腔和耳甲艇的中心區(qū)域，針灸針分別沿皮刺入約6 mm[24]；大鼠只有3對骶后孔，其次髎穴/中髎穴位于S2-S3 棘突間隙正中偏上旁開5-10 mm（第2 骶后孔）處，針灸針直刺約15-20 mm[25]，左右各一針。因大鼠需在仰臥位行球囊置入術(shù)以檢測胃內(nèi)壓，故預先將針灸針刺入次髎[26]。連接韓氏電針儀，30 Hz，2 mA，波寬0.2 ms±30%，連續(xù)波[23]，電針2 min。具體電針操作見圖3。

圖3 耳甲、次髎定位及電針操作示意圖

1.5 數(shù)據(jù)采集和分析

以30 s為一個觀察單位導出數(shù)據(jù)并分析電針干預前和干預時胃內(nèi)壓和HRV 的變化，用變化倍率（變化倍率=電針干預時數(shù)值/干預前基線值×100%）分析不同干預方式效應(yīng)的差異[27]。

1.6 統(tǒng)計與作圖

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。計量資料以均數(shù)±標準誤（xˉ±SEM）表示，數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布檢驗。組內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，若服從正態(tài)分布，則采用配對t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗；組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，若服從正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，否則采用非參數(shù)檢驗。P≤0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電針各穴位對大鼠胃內(nèi)壓的影響

與電針前相比，各組胃內(nèi)壓在電針干預期間均顯著升高（見圖4）。耳甲組：電針干預可顯著升高胃內(nèi)壓，尤其在干預的30-60 s（P<0.05）、60-90 s 期間（P<0.05）（見圖4A）。次髎組：電針干預可顯著升高胃內(nèi)壓，尤其在干預的60-90 s 期間（P<0.05）（見圖4A）?！岸?次髎”組：電針干預可顯著升高胃內(nèi)壓，尤其在干預的60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.05）（見圖4A）。

圖4 電針各穴位對大鼠胃內(nèi)壓的影響（xˉ±SEM，n=8）

胃內(nèi)壓變化倍率：“耳甲+次髎”組的胃內(nèi)壓變化倍率，在電針干預的30-60 s 期間開始高于同期耳甲組、次髎組，并在干預的60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.01）顯著高于同期耳甲組，在干預的60-90 s（P<0.05）、90-120 s 期間（P<0.05）顯著高于同期次髎組。耳甲電針干預升高胃內(nèi)壓起效更快，但在電針后期，“耳甲+次髎”電針干預的胃內(nèi)壓比耳甲電針、次髎電針的胃內(nèi)壓更高，且“耳甲+次髎”電針干預的胃內(nèi)壓增幅更高、增加更快（見圖4A、4C）。

2.2 電針各穴位對大鼠HRV的影響

耳甲組：與電針前相比，耳甲電針干預的HF 在干預全程均顯著升高（P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.05）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。耳甲電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的0-30 s（P<0.01）、30-60 s（P<0.05）、60-90 s期間（P<0.05）（見圖5A、5B、5C、5D）。

圖5 電針各穴位對大鼠HRV的影響（xˉ±SEM，n=8）

次髎組：與電針前相比，次髎電針干預的HF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。次髎電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的0-30 s 期間（P<0.05）（見圖5A、5B、5C、5D）。

“耳甲+次髎”組：與電針前相比，“耳甲+次髎”電針干預的HF在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.001，P<0.05，P<0.01，P<0.01）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05）。“耳甲+次髎”電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的30-60 s（P<0.05）、60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.01）（見圖5A、5B、5C、5D）。

LF/HF變化倍率：“耳甲+次髎”組的LF/HF變化倍率，在電針干預的30-60 s 期間開始低于同期耳甲組、次髎組，并在干預的90-120 s 期間（P<0.05）顯著低于同期耳甲組，在干預的60-90 s（P<0.05）、90-120 s 期間（P<0.05）顯著低于同期次髎組。在電針后期，耳甲組、次髎組的LF/HF 略有升高，但仍明顯低于電針干預前，而“耳甲+次髎”組的LF/HF 則持續(xù)降低，且降幅更高、降低更快（見圖5D、5E）。

3 討論

自主神經(jīng)系統(tǒng)（Autonomic nervous system，ANS）在針刺（電針）調(diào)節(jié)機體功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。研究表明，特異性地調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)，能獲得對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)可靠而又穩(wěn)定的調(diào)節(jié)能力[29]。目前，侵入式迷走神經(jīng)刺激術(shù)（VNS）因存在創(chuàng)傷和副作用以及高成本等弊端，導致其在臨床廣泛開展受到限制。針刺（電針）作為一種操作簡便且安全的ANS 調(diào)節(jié)手段[30]，可輕易避免VNS 的諸多弊端，具有天然優(yōu)勢。由于針刺（電針）調(diào)節(jié)ANS 的效應(yīng)方向與其所刺激的腧穴密切相關(guān)，即存在迷走效應(yīng)和交感效應(yīng)兩種效應(yīng)方向。因此，明確腧穴的具體效應(yīng)方向顯得尤為重要。

HRV 常用于定量評估人和動物的ANS 功能，其中，HF 反映迷走神經(jīng)張力，LF 和VLF 代表交感神經(jīng)活性，LF/HF 則反映交感-迷走神經(jīng)平衡移動[31-32]。鑒于迷走神經(jīng)分支在胃部分布豐富且胃運動由其主導[33-34]，胃內(nèi)壓的增減可具體量化和反映迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)的強弱，故選擇胃內(nèi)壓和HRV作為評估迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)的指標。

本研究中，電針次髎或耳甲，HF 升高，提示迷走神經(jīng)張力增加。由于胃運動主要由迷走神經(jīng)支配，因此，胃內(nèi)壓的升高亦印證了迷走神經(jīng)張力增加的結(jié)果。這表明，次髎和耳甲均可作為激活迷走神經(jīng)（副交感神經(jīng)）的體表接口。此外，與部分研究[10]未將交感神經(jīng)活性納入針刺（電針）對ANS 影響的觀察指標不同，本研究中LF 和VLF 升高，提示電針次髎或耳甲亦提高了交感神經(jīng)活性。然而，LF/HF比值卻降低，表明交感-迷走神經(jīng)平衡向迷走神經(jīng)方向移動，提示電針次髎或耳甲對ANS 的調(diào)節(jié)是以大幅度地提高迷走神經(jīng)張力、同時小幅度地提高交感神經(jīng)活性的方式進行。換言之，電針次髎或耳甲以迷走神經(jīng)作為調(diào)控ANS 的入口，通過上調(diào)調(diào)定點（Set point）水平來重建交感-迷走神經(jīng)平衡，而非通過單純地削弱一方或增強一方來實現(xiàn)，表明該調(diào)控效應(yīng)是一種基于整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)。

迷走效應(yīng)主要由耳甲（迷走神經(jīng)耳支）和以足三里（坐骨神經(jīng)）為代表的下肢腧穴先將感覺信息上傳至中樞NTS 整合，再由迷走神經(jīng)背核（DMV）下行傳遞調(diào)節(jié)信息，最后由增強的傳出迷走神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿，Ach）作用于相應(yīng)靶器官（胃腸等）而觸發(fā)（膽堿能抗炎通路或胃腸動力調(diào)節(jié)效應(yīng)）[35]。解剖學研究表明，骶內(nèi)臟神經(jīng)、骶前神經(jīng)和盆內(nèi)臟神經(jīng)共同構(gòu)成盆叢[36-37]。其中，由S2-S4副交感纖維在骶孔構(gòu)成的盆內(nèi)臟神經(jīng)具有副交感屬性；由于部分S2-S3 軀體纖維常伴行盆內(nèi)臟神經(jīng)，因此，骶叢神經(jīng)的傳出屬性尚存在爭議[38-39]，但后續(xù)一系列研究仍傾向于骶叢具有副交感屬性[40]。從八髎穴的臨床應(yīng)用來看，針刺（電針）八髎穴常用于包括潰瘍性結(jié)腸炎[41-42]、盆腔炎[43-44]等多種炎癥性疾病以及女性圍絕經(jīng)期潮熱、汗出[17]等疾病的治療，提示臨近骶叢的八髎穴區(qū)可能具有副交感屬性。離斷迷走神經(jīng)，電針次髎拮抗內(nèi)毒素血癥的抗炎效應(yīng)明顯減弱，全身炎癥因子水平顯著上升，說明迷走神經(jīng)參與了電針次髎的全身性抗炎效應(yīng)[18]；另一項研究顯示，SNS 導致潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NTS中c-fos表達增加，并顯著降低了全身炎癥因子水平，但離斷迷走神經(jīng)后，SNS 抗炎效應(yīng)消失[19]。故與VNS 作用途徑相似，電針次髎可能亦通過“脊髓上行傳入——中樞整合——迷走神經(jīng)傳出——增強的迷走效應(yīng)輸出”途徑，產(chǎn)生全身性迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)[18-19]。本研究中，由于骶神經(jīng)并不支配上消化道[45]，但迷走神經(jīng)張力（HF）增加，而胃運動由迷走神經(jīng)主導，故胃內(nèi)壓增高可能是通過脊髓上中樞通路激動迷走神經(jīng)導致，這也是對上述次髎的全身性迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)實驗的進一步補充。不過，電針次髎在升高胃內(nèi)壓的時效性上要遲于電針耳甲，即次髎電針60 s 后胃內(nèi)壓才明顯升高。其原因可能是：電針次髎需通過脊髓上中樞才可以激活迷走神經(jīng)，而電針耳甲具有直接作用于脊髓上中樞的“捷徑”優(yōu)勢[17]。

此外，本研究顯示，在聯(lián)合電針的后期，與單獨電針次髎或耳甲相比：胃內(nèi)壓變化倍率增加，提示胃內(nèi)壓持續(xù)增高且增幅更大；LF/HF 變化倍率降低，提示LF/HF持續(xù)降低且降幅更大。這表明在迷走神經(jīng)調(diào)控方面，次髎與耳甲聯(lián)合電針具有顯著的協(xié)同增效作用，即1+1>1。兩穴同用的協(xié)同增效作用，也從側(cè)面進一步驗證了次髎與耳甲調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)（副交感神經(jīng)）效應(yīng)方向基本一致的結(jié)論。

迷走神經(jīng)張力降低、交感神經(jīng)活性增加所致的ANS 失衡是眾多疾病的核心病理環(huán)節(jié)[46]，明確腧穴調(diào)節(jié)ANS 的具體效應(yīng)方向?qū)τ诩膊〉闹委燂@得格外重要。目前，重建ANS 平衡取穴多以腹部腧穴、耳甲和四肢腧穴為主。腹部腧穴以天樞穴為代表，只能激活交感效應(yīng)，且只有高強度而非低強度電針才能將其激活，體現(xiàn)出一定的強度依賴性[15]。耳甲迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)雖顯著，但其效應(yīng)可能受到迷走神經(jīng)耳支分布區(qū)域狹小的限制。四肢腧穴中，觸發(fā)交感效應(yīng)，腧穴取穴上肢多于下肢，以內(nèi)關(guān)穴（正中神經(jīng)）為代表，可抑制交感神經(jīng)異常放電；觸發(fā)迷走效應(yīng)，腧穴取穴下肢多于上肢，以足三里（坐骨神經(jīng)）為代表[35]。最新研究顯示，足三里的迷走效應(yīng)受到腧穴深層筋膜組織中PROKR2 神經(jīng)元分布的影響，亦具有明顯的刺激強度依賴性，即不同電流強度分別激活交感、迷走神經(jīng)環(huán)路，這對針刺（電針）的深度、組織解剖層次和刺激強度提出了較高的要求[14-15]。

八髎穴受解剖位置影響，其主治病種多集中于泌尿生殖系統(tǒng)和肛腸系統(tǒng)疾病[47]。本研究通過進一步明確次髎的全身性迷走神經(jīng)調(diào)控效應(yīng)，為八髎穴廣泛地用于特異性迷走神經(jīng)調(diào)控提供了新的實驗證據(jù)，從而在一定程度上拓寬了八髎穴的適用病種。此外，在迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)的腧穴配伍研究[16]中，上肢腧穴（曲池）與下肢腧穴（上巨虛）配伍，在升高胃內(nèi)壓方面并未出現(xiàn)1+1>1 的協(xié)同增效作用。而次髎和耳甲聯(lián)合電針產(chǎn)生1+1>1 的協(xié)同增效作用，為針刺（電針）介入相關(guān)疾病提供了除四肢腧穴外新的腧穴配伍選擇。

本研究亦有不足之處，比如只研究了單一電流強度下電針次髎對ANS 的影響，那么其是否也存在強度依賴性呢？此外，本研究于生理狀態(tài)下的大鼠身上進行，其調(diào)控效應(yīng)能否適用于病理狀態(tài)下的大鼠呢？都需要進一步探索和明確。