呂 娟，戴恩來，張云霞，白俊嫄，蒲曉薇

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 蘭州 730000；2. 甘肅省中醫(yī)院 蘭州 730050）

SRNS 定義為腎病綜合征采用1 mg·kg-1·d-1劑量的潑尼松龍治療8 周后仍未緩解，其在腎病綜合征病例中所占比例較?。?%-15%）。但SRNS 患者已被證明更難治療，可導致急性腎功能衰竭、繼發(fā)嚴重感染等急性并發(fā)癥，若未得到有效控制，繼而向腎功能慢性化發(fā)展，造成了嚴重的社會和經(jīng)濟負擔[1-3]。潑尼松作為糖皮質激素的代表藥物，是治療原發(fā)性腎病綜合征最重要和首選的藥物，除了具有一般的免疫抑制和抗炎作用外，還對足細胞有直接作用，增加肌動蛋白絲的穩(wěn)定性[4]，對激素抵抗型腎病綜合征患者治療后未達到緩解，常與免疫抑制劑聯(lián)合使用，但臨床效果依舊欠佳，而且毒副作用大。中西醫(yī)結合治療SRNS，在減輕癥狀、縮短病程、改善預后等方面具有一定的優(yōu)勢。

戴恩來教授經(jīng)過多年的臨床經(jīng)驗認為，SRNS 的中醫(yī)病因病機主要是腎陽虛，陽不化陰，故而水濕痰濁血瘀有形之邪為患。研究證實補腎溫陽可以增加SRNS的治療效果，增加激素的敏感性[5]。

淫羊藿作為溫陽藥的代表藥物，主要功效為溫陽利水。淫羊藿苷是淫羊藿的主要提取成分之一。研究表明，淫羊藿苷具有抑制腎纖維化、保護腎臟的功能[6]，對腎陽虛大鼠具有保護作用[7]，在糖尿病腎病中降低了足細胞凋亡、維持線粒體膜的完整性[8]。淫羊藿苷可以通過上調雄激素受體、下調磷酸化雄激素受體及磷酸化AKT，抑制腎陽虧虛以及雙酚A 染毒引起的雄激素受體和AKT 磷酸化，為此可減少睪丸組織細胞的凋亡，進一步改善結構[9]。本研究在網(wǎng)絡藥理學研究的基礎上將淫羊藿苷與核心靶點的分子，以及與核心靶點相關的蛋白進行對接分析，并通過動物實驗驗證，進一步揭示淫羊藿苷治療SRNS 的分子機制，為臨床治療SRNS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學分析使用的數(shù)據(jù)庫和軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺：TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫：GeneCards（https://www. genecards. org）；CTD（http://ctdbase.org）；Uniprot（https://www.uniprot.org/）；OMIM（http://www. omim. org）；DRUGBANK（https://www.drugbank.ca）；Venn2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；String（https://string-db.org/）；DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/）；RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）；軟件：AutoDockTools 1.5.6；PyMOL。

1.2 材料、儀器及設備

實驗動物：從甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心購買7-8周齡雄性Wistar大鼠50只，體質量（210±10）g。動物合格證號：6200100000025，動物使用許可證號：SCXK（甘）2015-0002。阿霉素（Adriamycin，ADR）北京索萊寶科技有限公司；醋酸潑尼松片（Prednisone Acetate Tablets，PAT）浙江仙琚制藥股份有限公司；淫羊藿苷（Icariin，ICA）陜西博林生物技術有限公司；山羊抗兔IgG、Ant-LC3-Ⅱ、Ant-PI3k、Ant-Akt、Ant-GAPDH 均購自美國Abcam 公司；RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。尿白蛋白檢測試劑盒購自Roche Diagnostics GmbH 公司，HE 染色試劑盒購自碧云天生物技術公司。切片機、熒光顯微鏡購自Leica公司，電子天平購自賽多利斯科學儀器公司，全自動生化儀購自上?？迫A卓越生物工程股份有限公司，轉膜儀、電泳儀、Western blot 電源購自北京六一生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 淫羊藿苷作用靶點的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)平臺，GeneCards 數(shù)據(jù)庫及CTD數(shù)據(jù)庫將“淫羊藿苷”作為檢索對象，獲取藥物淫羊藿苷作用靶點，去重并整合。

1.3.2 SRNS相關靶蛋白預測

挖掘GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、CTD 數(shù)據(jù)庫中“steroid resistant nephrotic syndrome（SRNS）”的潛在靶點，查詢西醫(yī)臨床治療SRNS 的一線用藥，進入DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫獲得該藥對應作用靶點，進一步完善補充。Genecards數(shù)據(jù)庫中，疾病與靶點的聯(lián)系是否密切，取決于Score 值的大小。根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多則設定Score 大于中位數(shù)的目標靶點為SRNS 的潛在靶點，合并4個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復值得到SRNS靶點。

1.3.3 藥物靶點-基因靶點的構建

將淫羊藿苷活性成分對應的靶點基因與SRNS 靶點基因進行相互映射，繪制Venn圖，獲取交集基因，并以此作為后續(xù)分析基礎。

1.3.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建

為研究靶點蛋白的相互作用，將交集基因上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins，物種限定為“Homo sapiens”，借助Cyscape（3.7.2）繪制淫羊藿苷靶蛋白-SRNS 靶蛋白PPI（Protein-protein interactions）網(wǎng)絡互作圖并依據(jù)Degree值獲取關鍵基因。

1.3.5 GO功能富集分析和KEGG富集通路分析

將1.3.3 獲得的共有基因上傳至DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫，將輸出數(shù)據(jù)進行GO（Gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of gene and genomes）通路分析，取P<0.05，探究淫羊藿苷治療SRNS 的相關作用機制。

1.3.6 藥物成分-核心靶點分子對接驗證

為進一步驗證核心活性成分潛在治療作用的可靠性，將從“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡中篩選出的核心活性成分與PPI網(wǎng)絡中確定的關鍵靶蛋白進行分子對接。本課題還選擇了與關鍵靶蛋白相關的蛋白進行了分子對接，以明確其潛在治療作用。

首先在TCMS 平臺中下載淫羊藿苷的結構文件。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫下載獲取靶蛋白的晶體結構：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的蛋白結構（PDB ID：1E8X）、蛋白激酶B（Akt）的蛋白結構（PDB ID：3QKL）、微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）水解酶的蛋白結構（PDB ID：5GMV）。用AutoDockTools 1.5.6 軟件將淫羊藿苷與3 個蛋白進行半柔性對接，結合能最低的結合模式被認為是最優(yōu)結合模式，因此選擇對接結合能最低的最優(yōu)構象，然后用PyMOL 軟件對結合能最低的成分-靶蛋白結合模式進行可視化處理。通過微生信在線工具將分子對接結果繪制成熱圖。對接評分為評價對接的匹配情況的依據(jù)。

1.3.7 動物造模、分組及給藥

購買的實驗大鼠在SPF 級實驗室適應性喂養(yǎng)7 天，按照隨機數(shù)字化表隨機分為5 組：空白組、模型組、潑尼松組、淫羊藿苷組、潑尼松+淫羊藿苷組，每組10只。根據(jù)課題組前期造模方法，采用一次性尾靜脈注射劑量為6 mg·kg-1的阿霉素建立SRNS 模型[10]。驗證模型成功后，分別給藥連續(xù)處理42 天，潑尼松組按6.3 mg·kg-1·d-1潑尼松配制溶液灌胃，淫羊藿苷組按50 mg·kg-1·d-1淫羊藿苷配制溶液灌胃，潑尼松+淫羊藿苷組按上述劑量潑尼松加淫羊藿苷配制溶液灌胃[10-11]，對照組和模型組給予等體積飲用水灌胃。

1.3.8 大鼠體質量的測量

分別于造模前、造模后2 周末和聯(lián)合給藥42 天后對各組大鼠稱量體質量并記錄。

1.3.9 尿蛋白定量的測定

采用金屬籠子收集24 h 大鼠尿液，每只籠子放置1 只大鼠，收集各組大鼠造模前、造模后第2 周末及聯(lián)合給藥42 天后大鼠24 h 總尿液。每次收集尿液后離心15 min，收集上清，-20℃保存，避免反復凍融。全自動生化分析儀用免疫比濁法檢測各組大鼠造模前、造模后第2周末及聯(lián)合給藥42天后的24 h尿蛋白總量。

1.3.10 HE染色觀察各大鼠腎組織病理形態(tài)

按照上述實驗分組，大鼠給藥處理42 天后，切除大鼠左側腎臟，切片加4%的戊二醛溶液固定24 h，全自動脫水機脫水后浸蠟處理，切超薄片，用二甲苯進行脫蠟，梯度酒精洗脫二甲苯，進行蘇木精染色，將玻片在鹽酸乙醇溶液中提插數(shù)下，自來水中浸泡15 min，之后伊紅水溶液染色，75%、85%、95%乙醇依次脫水，最后無水乙醇脫水，中性樹脂封片光學顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)。

1.3.11 Western Blot 檢測SRNS 大鼠腎組織LC3-II 及PI3K、Akt的表達水平

將各組大鼠頸椎脫臼處死，分離腎組織，添加RIPA裂解液提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。之后進行SDS-PAGE 電泳，將膠塊上的蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶室溫封閉1 h，將封閉好的PVDF 膜置于LC3-II、PI3K、Akt 和GAPDH 一抗溶液中4℃孵育過夜孵，漂洗3 次后將PVDF 膜置于二抗溶液中，室溫孵育1.5 h，添加超敏發(fā)光液于PVDF 膜上，置于化學發(fā)光成像儀分析。

1.3.12 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件處理，數(shù)據(jù)采用均值±標準差（±s）表示。組間比較，符合正態(tài)性要求，采用單因素方差分析組間差異；兩組間比較，方差齊時，采用LSD法，除有特殊說明，數(shù)據(jù)統(tǒng)計中P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用Image J 進行灰度檢測分析。

2 結果

2.1 淫羊藿苷活性成分對應靶點的篩選

分別在TCMSP，GeneCards 及CTD 數(shù)據(jù)庫中對淫羊藿苷靶點進行檢索，并進行整合、刪除重復值，最終得到淫羊藿苷活性成分對應的靶點蛋白共計139個。

2.2 激素抵抗性腎病綜合征靶點預測

利用Pubmed 中“ 醫(yī)學主題詞表”（Medical subjectheadings，MeSH）功能，確定SRNS的主題詞。將從Pubmed 查詢到的SRNS 的主題詞作為關鍵詞，使用GeneCards、OMIM、CTD數(shù)據(jù)庫篩選出與SRNS相關的靶點。并與DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫尋找SRNS治療藥物的作用靶點進行合并，去重并整合，從而得到與SRNS相關的所有疾病靶點共計1476 個。圖1 中粉色代表來源于GeneCards 中SRNS 疾病靶點，藍色代表來源于CTD 中SRNS 疾病靶點，紫色代表來源于DRUGBANK 中SRNS疾病靶點，綠色代表來源于OMIM中SRNS疾病靶點。

圖1 SRNS疾病靶點交集圖

2.3 藥物靶點-基因靶點的構建

將淫羊藿苷活性成分對應的139個靶蛋白基因與SRNS 的1476 個靶點基因進行匹配，繪制Venn 圖獲取共有基因58個（見圖2）。圖中藍色代表中藥單體淫羊藿苷成分靶點，紅色代表SRNS 疾病靶點，紫色代表淫羊藿苷-SRNS共有靶點，共58個。

圖2 淫羊藿苷活性成分-SRNS靶點交集圖

2.4 淫羊藿活性成分靶蛋白-SRNS 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡

將58 個共有基因導入STRING 中，獲得淫羊藿苷治療SRNS 的靶蛋白PPI 網(wǎng)絡互作圖（見圖3）。該網(wǎng)絡包括57 個節(jié)點，658 條邊。借助于Cytoscape 軟件作圖并依據(jù)插件CytoNCA 計算度中心性（Degree），以Degree 值大小對各靶點進行排序，其中字體大小與Degree 值成正相關，取排名前10 的靶點為核心靶點（見圖3）。其中，RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）（degree=50）、1 號染色體基因（JUN）（degree=45）、白介素-6（IL6）（degree=44）等可視為核心靶點。表明上述靶點在淫羊藿苷治療SRNS 中的重要性，可作為研究淫羊藿苷治療SRNS的關鍵靶點。

圖3 淫羊藿苷活性成分靶蛋白-SRNS靶蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

2.5 GO和KEGG功能富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

使用DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫對58 個共有基因進行分析，設定P<0.05，共富集到58 個生物過程及功能。根據(jù)P值大小排序后，篩選出前20 個核心功能繪制柱狀圖（見圖4）。說明淫羊藿苷治療SRNS 可能與以下生物學機制有關。

圖4 淫羊藿苷治療SRNS的GO功能柱狀圖

2.5.2 KEGG功能富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析，共富集到144條與淫羊藿苷治療SRNS相關的通路，根據(jù)P<0.05篩選出與淫羊藿苷治療SRNS 相關的通路。根據(jù)P值將篩選到排名前30 條KEGG 代謝通路，根據(jù)P值繪制氣泡圖，氣泡的大小代表富集到相應通路上的基因數(shù)目的多少，顏色的深淺代表顯著性，可直觀地觀察到顯著性富集信息（見圖5）。從圖中可以發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷主要通過調控PI3K/AKT 通路發(fā)揮對SRNS 的治療作用。

圖5 淫羊藿苷治療SRNS的KEGG功能柱狀圖

2.6 藥物成分-核心靶點分子對接驗證

用AutoDockTools 1.5.6 軟件將淫羊藿苷與PI3K、Akt、LC3 進行半柔性對接，選擇對接結合能最低的最優(yōu)構象，用PyMOL軟件進行可視化。對接評分為評價對接的匹配情況的依據(jù)，結果見表1。

表1 分子對接結果表

分子對接的對接結合能負值代表化合物易與靶蛋白結合，正值則表明二者不易結合。對于負值來說，負值的絕對值越大，則認為化合物與靶點有較強的親和力，構象越穩(wěn)定。當對接結合能的絕對值大于4.25 k·mol-1時，表示具有一定的結合活性；大于5.0 k·mol-1為具有較好的結合活性；大于7.0 k·mol-1為具有強烈的結合活性。由結果可知，Akt 和PI3K 與淫羊藿苷有較好的結合活性，LC3 與淫羊藿苷亦有一定的結合活性（圖6-8）。

圖6 PI3K與淫羊藿苷對接模式圖

圖7 Akt與淫羊藿苷對接模式圖

圖8 LC3與淫羊藿苷對接模式圖

2.7 各組大鼠體質量的變化

如表2 和圖9 所示：造模前各組大鼠體質量基本控制在200～220 g，比較無統(tǒng)計學意義。與空白組相比，模型組大鼠體質量明顯減少，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，給藥治療42 天后潑尼松組淫以及羊藿苷組大鼠體質量變化無統(tǒng)計學意義，淫羊藿聯(lián)合潑尼松組大鼠體質量顯著增加，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松治療阿霉素大鼠，能改善模型組大鼠體質量。

表2 各組大鼠體質量變化（g）（±s，n=3，g）

表2 各組大鼠體質量變化（g）（±s，n=3，g）

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

給藥42天382.00±7.26 236.00±6.98**260.67±8.22 264.33±4.50 290.67±3.86#組別空白組模型組潑尼松組淫羊藿苷組潑尼松+淫羊藿苷組造模前205.00±12.25 204.67±7.41 210.00±10.80 211.00±7.26 206.00±6.16造模后2周253.33±8.50 219.67±7.41*222.67±7.13 224.33±6.65 224.33±3.68

圖9 各組大鼠體質量變化

2.8 各組大鼠24 h尿蛋白定量的變化

如表3 和圖10 所示：空白組大鼠在實驗過程中尿蛋白含量正常，無統(tǒng)計學意義。與空白組相比，模型組大鼠尿液中24 h 蛋白總量明顯增多，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，潑尼松組大鼠經(jīng)潑尼松治療42 天后，24 h 尿蛋白總量未緩解，提示模型大鼠對潑尼松具有抵抗性。與模型組相比，淫羊藿苷組24 h尿蛋白總量變化也無統(tǒng)計學意義。淫羊藿聯(lián)合潑尼松治療阿霉素大鼠42天后，24 h 尿液中總蛋白含量顯著減少，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。提示SRNS 大鼠模型成功，淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松治療阿霉素大鼠，有效的降低了尿液中蛋白含量，具有治療作用。

表3 24 h尿蛋白定量（mg·24 h-1）（±s，n=3）

表3 24 h尿蛋白定量（mg·24 h-1）（±s，n=3）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

給藥42天4.80±0.82 174.65±2.83**166.09±1.57 163.94±4.79 90.72±2.59##組別空白組模型組潑尼松組淫羊藿苷組潑尼松+淫羊藿苷組造模前4.65±0.57 4.91±0.78 4.93±0.17 4.66±0.07 4.99±0.72造模后2周4.69±0.55 119.38±2.93**119.42±0.85 118.86±1.36 119.23±1.07

圖10 SRNS大鼠尿液中24小時尿蛋白定量的變化

2.9 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的變化

如圖11 所示：空白組大鼠腎組織形態(tài)正常，腎小球結構完整，輪廓清晰，球內血管分布均勻，排列整齊。與空白組相比，模型組大鼠腎組織結構紊亂，腎小球變形，部分萎縮，球內毛細血管成團分布，腎小囊輪廓不清晰，濾過膜結構模糊，腎小管部分萎縮、部分擴張，結構不一，排列紊亂，可見局灶性炎性細胞浸潤。與模型組相比，潑尼松+淫羊藿苷組大鼠經(jīng)淫羊藿苷協(xié)同潑尼松治療后，腎組織結構形態(tài)改善明顯，腎小球結構較清晰，輪廓清除，球內毛細血管分布均勻，腎小管分布均勻，排列整齊，無萎縮或擴張現(xiàn)象。單純的潑尼松組和淫羊藿苷組大鼠腎組織結構形態(tài)較模型組無明顯改變。提示淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松治療改善了阿霉素大鼠腎小球的形態(tài)學變化。

圖11 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的變化

2.10 Western blot檢測LC3-II、PI3K、Akt的表達

如表4和圖12所示：與空白組相比，模型組LC3-Ⅱ的表達減少、PI3K、Akt的表達增加（P<0.01），潑尼松組和淫羊藿苷組與模型組相比LC3-Ⅱ、PI3K、Akt的表達無明顯變化。與模型組相比，潑尼松+淫羊藿苷組LC3-Ⅱ的表達增加、PI3K、Akt的表達明顯減少（P<0.01）。

表4 淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松對SRNS大鼠腎組織LC3-II、PI3K、Akt的表達水平（±s，n=3）

表4 淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松對SRNS大鼠腎組織LC3-II、PI3K、Akt的表達水平（±s，n=3）

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

分組空白組模型組潑尼松組淫羊藿苷組潑尼松+淫羊藿苷組LC3-II 1.00±0.04 0.71±0.03##0.74±0.06 0.94±0.04 0.83±0.13**PI3K 1.00±0.04 1.61±0.07##1.53±0.05 1.59±0.05 1.39±0.05**Akt 1.00±0.07 1.41±0.06##1.39±0.06 1.40±0.05 1.16±0.06**

圖12 淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松對SRNS大鼠腎組織自噬蛋白LC3-II、PI3K/Akt表達的影響

3 討論

SRNS 對藥物治療反應差，腎損害進行性加重，在臨床上，F(xiàn)SGS 是導致SRNS 這一事件發(fā)生最常見的因素，其特點是在5-10年的診斷期內迅速發(fā)展為終末期腎病[12-14]。西醫(yī)治療以環(huán)孢素、他克莫司等免疫抑制劑為主，但在用藥之前，首先要排除患者是否有腫瘤病史及感染指征，而且臨床效果不佳，不良反應重，臨床治療出現(xiàn)部分緩解也是令人滿意的[15]。中西醫(yī)結合治療SRNS 有一定的療效和前景，中醫(yī)藥對激素可以起到減毒增效的作用。表明中西醫(yī)結合干預靶點的治療，有助于提高SRNS 療效、減少藥物不良反應及改善預后[16]。循證醫(yī)學研究結果表明，溫陽法結合西醫(yī)常規(guī)治療SRNS 在提高臨床綜合療效及安全性方面顯著優(yōu)于單純的西醫(yī)治療方案[17]。網(wǎng)絡藥理學打破了傳統(tǒng)單向路徑式的研究理念，成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化的有力工具[18]。它結合基因組學、蛋白質組學和中藥化學物質，通過先進的計算算法和網(wǎng)絡模型，連接疾病、治療、中藥配藥，并分析活性成分，將一個靶點、一種藥物的范式轉變?yōu)榫W(wǎng)絡靶點、多成分療法，在研究靶點、藥物、疾病和途徑之間復雜多樣的關系有獨特的優(yōu)勢[19-20]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學的方法，從分子生物學角度更深層次地揭示淫羊藿苷干預SRNS 大鼠的作用機制。

淫羊藿苷治療SRNS 的網(wǎng)絡藥理學分析結果為：淫羊藿苷活性成分對應的139 個靶蛋白基因與SRNS的1476 個靶點基因進行匹配藥物靶點-基因靶點，得出交集基因共58 個。淫羊藿苷治療SRNS 排在前3 位的標靶蛋白是：RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）（degree=50）、1 號染色體基因（JUN）（degree=45）、白介素-6（IL6）（degree=44），可作為研究淫羊藿苷治療SRNS的關鍵靶點。KEGG富集分析結果提示，淫羊藿苷主要通過調控PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮對SRNS 的治療作用。而PI3K/AKT 信號通路與腫瘤生長、血管生成、患者預后及治療密切相關[21]，PI3K/Akt級聯(lián)通路在控制足細胞肌動蛋白細胞骨架重塑具有重要作用，肌動蛋白細胞骨架在足細胞損傷中的解體與PI3K 相關[22]。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，通過調控PI3K-Akt 信號通路，恢復自噬，可以緩解腎臟纖維化[23]。研究表明活化的PI3K/Akt通路可損傷足細胞參與蛋白尿形成[24]。Akt 蛋白位于信號通路mTOR上游、PI3K 下游，在外界環(huán)境刺激下，活化的PI3K 進一步激活Akt，導致Akt 磷酸化，磷酸化的Akt 可以直接激活mTOR，從而抑制自噬，說明活化的PI3K/AKT信號通路可負向調控自噬水平[25]。自噬在細胞內穩(wěn)態(tài)中起重要的生理作用，自噬的失調可能參與各種疾病狀態(tài)，如炎癥、衰老、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥及腎臟疾病[26-27]。文獻表明，自噬與腎小球足細胞的穩(wěn)態(tài)有關[28]。Hartleben 等[29]發(fā)現(xiàn)足細胞在基礎條件下具有高水平的自噬，且足細胞自噬體形成能力的喪失導致了小鼠足細胞功能受損和腎小球疾病的發(fā)生。

基于以上網(wǎng)絡藥理學研究結果，本研究選取KEGG 富集到的主要信號通路PI3K/AKT 蛋白進行分子對接驗證。以上文獻研究表明，可以通過調控PI3K/AKT信號通路調節(jié)細胞自噬水平，達到保護腎臟的目的。本實驗選擇能夠反應細胞自噬水平的相關蛋白LC3 進行分子對接驗證，進一步從自噬角度闡明淫羊藿苷治療SRNS 的機制。結果表明，Akt 和PI3K與淫羊藿苷有較好的結合活性，LC3 與淫羊藿苷亦有一定的結合活性，進一步提示淫羊藿苷可能通過Akt、PI3K和LC3-II蛋白靶點起關鍵作用。

動物實驗中可以看到，淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松可以明顯增加SRNS 大鼠體質量，減少24 h 尿蛋白定量，改善腎小球的形態(tài)學變化。上調了大鼠腎組織中自噬相關蛋白LC3-II 的表達，抑制了自噬信號通路蛋白PI3K、Akt 的表達。說明淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松治療SRNS 大鼠，可以保護腎組織，延緩疾病進展，其作用可能與抑制PI3K/Akt/信號通路和激活腎臟自噬有關。

參照《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》[30-31]，本研究中淫羊藿苷活性成分靶點、SRNS相關靶點均通過網(wǎng)絡藥理學研究的權威數(shù)據(jù)庫篩選獲得，網(wǎng)絡藥理學分析所使用的軟件及方法為網(wǎng)絡藥理學研究廣泛使用。并進一步通過動物體內研究對結果進行驗證，實驗設計合理，結果具有可重復性。本研究對淫羊藿苷治療SRNS 大鼠的可能作用機制進行整體地預測和分析，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷治療SRNS 大鼠是通過多靶點和多通路的共同協(xié)調來實現(xiàn)的。體內動物實驗進一步證實了淫羊藿苷對SRNS 大鼠的治療具有一定的改善作用。本研究為后續(xù)淫羊藿苷治療SRNS 的相關研究提供一定的線索和提示，為臨床治療SRNS提供理論基礎。但本研究僅基于目前現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫與已有數(shù)據(jù)進行建模，預測結果可能存在偏差，中藥成分組成復雜，目前獲取的藥物活性成分和作用靶點有限，不能完全揭示其作用機制，且需要更多的動物實驗給予驗證其真實性。