呂 轉，劉瑞東，蘇凱奇，阮曉迪，齊士魁，余明月，顧一鳴，高 靜，劉 啟，房 璐，馮曉東＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學 鄭州 450000）

癌因性疲乏（Cancer-related fatigue，CRF）是一種由癌癥或癌癥治療引起的，持續(xù)存在的主觀感覺，并能擾亂機體正常功能，嚴重影響患者的生活質量[1]。在所有癌癥患者中，CRF 在乳腺癌患者中最為常見[2-5]，60%的乳腺癌患者在診斷治療后12個月內會發(fā)生中度到重度的疲乏癥狀，21%-52%的癌癥患者在診斷治療后的5-15年內仍存在一定的疲乏癥狀，接受化療治療后的患者CRF 發(fā)生率為70%-100%[6-7]。據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020 年全球最新癌癥數據顯示乳腺癌發(fā)病率高居全球第一，同時隨著各種檢測和治療技術的進步，乳腺癌患者的生存期也越來越長[8-9]。因此，乳腺癌患者的CRF 亟待得到重視與解決。目前，針對CRF 的治療多屬對癥處理，總體療效并不理想。多項研究表明，針刺治療能有效改善CRF 的疲乏癥狀、抑郁情緒和睡眠障礙，提高患者免疫力，并在提高CRF 患者的生存質量方面具有良好的安全性[10-11]。

CRF 的發(fā)生機制尚不完全清晰，近年來相關研究發(fā)現腸道菌群在腫瘤發(fā)生進展及腫瘤治療引起的不良反應中均起著重要作用[12-14]，并且腸道菌群變化參與了CRF 的發(fā)生過程，可能與其影響體內免疫功能進而影響中樞神經系統(tǒng)有相關性[15-17]。關于針刺對CRF的治療作用機制，既往研究較少涉及腸道菌群的影響變化。本實驗采用16S rDNA技術，探討針刺對乳腺癌化療后疲乏模型小鼠腸道菌群的調節(jié)作用，以期從腸道菌群角度探討針刺干預乳腺癌化療后CRF 的效應機制，為中醫(yī)傳統(tǒng)針刺法在腫瘤康復中的更廣泛應用提供一定的實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF 級BALB/c 小鼠50 只，6-8 周齡，體質量15-18 g，由鄭州市華興實驗動物中心提供，動物合格證編號：410981211100010031，經過河南中醫(yī)藥第一附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理審查委員會批準，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗室，動物倫理批準編號為：YFYDW2021012?？刂剖覝乇３衷?2-25℃，相對濕度在40%-60%，12 h/12 h晝夜節(jié)律交替，自由進食、飲水，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 細胞

4T1-Luciferase 小鼠乳腺癌細胞來源于美國國立癌癥研究所，由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室提供。細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2-3 天傳代1 次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 藥物、試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺（CTX）0.2 g（安道生 ENDOXAN公司，批號：H20160467）；0.2 mm×13 mm 一次性華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；TruSeq DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒（美國Illumina 公司）；Phusion 高保真PCR Master Mix with GC Buffer（美國Thermo Scientific 公司）；磁珠法糞便基因組DNA 提取試劑盒（DP712）（北京天根生化科技有限公司）；CTAB試劑盒（北京酷來搏科技有限公司）；16S V4 區(qū)引物341F-806R（上海百趣生物醫(yī)學科技有限公司）；Qubit@ 2.0熒光儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.4 分組和造模方法

首先將20 只小鼠采用隨機數字表法分為空白組10 只，荷瘤加化療組（模型組）10 只。將4T1 細胞調整濃度為2×106/mL，在模型組每只小鼠的第四乳墊區(qū)皮下接種0.1 mL細胞，接種7-10天，當腫瘤體積約0.5 cm3時，給予模型組腹腔注射CTX100 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3 天。以模型組小鼠體質量降低及一般情況較差、強迫游泳不動時間增加、曠場實驗水平和垂直運動時間降低作為造模成功標準。然后其余30 只小鼠造模成功后，按照隨機數字表法分為針刺組10 只、假針刺組10只、模型組10只。

1.5 干預方法

造模成功后次日，針刺組小鼠參考《實驗針灸學》，選取位于小鼠膝關節(jié)下方，腓骨頭下0.3 cm 處的肌溝中的“足三里”，后肢內踝尖上0.5 cm 處的“三陰交”，臍后方1 cm 處的“關元”，臍后方0.5 cm 處的“氣?！焙晚敼钦械摹鞍贂?。在穴位處消毒后，足三里直刺3 mm，三陰交直刺1.5 mm，關元斜刺1.5 mm，氣海斜刺1.5 mm，百會平刺1 mm，留針30 min，6 min 行針1 次，每日治療1 次，每周治療6 天，連續(xù)治療2 周；假針刺組每日陪同抓取，固定，不治療。

1.6 取材

糞便樣本：治療結束后，每組10只小鼠處死后，分別解剖腹部，無菌狀態(tài)下取出整個腸道，用無菌PBS沖洗腸道外壁后，切取結腸段，輕柔擠出內容物置于無菌的凍存管中，并迅速放入液氮速凍后置于-80℃保存。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 體質量及一般情況

觀察各組小鼠的體質量大小、精神狀態(tài)、活動度、飲食情況、毛發(fā)情況以及大便性狀等一般情況。

1.7.2 強迫游泳

在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放入直徑10 cm，高度25 cm 的圓柱形透明水桶中，保持桶中的水深10-15 cm，水溫在23-25℃，用攝像系統(tǒng)記錄6 min 小鼠游泳時間，統(tǒng)計后4 min 小鼠的不動時間，以此評估小鼠的體力和疲勞情況。

1.7.3 曠場實驗

在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放置在敞箱底面的中心方格內，箱上方安置攝像系統(tǒng)，記錄分析小鼠在箱內3 min 的水平運動得分（小鼠穿越底面塊數，穿越1塊記1分）和垂直運動得分（小鼠后腿直立次數，每次記1 分），以此評估小鼠在陌生環(huán)境中的自發(fā)運動能力。

1.7.4 糞便DNA提取及PCR擴增、建庫和測序

采用CTAB/SDS 法提取糞便樣本中全基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA濃度和純度，并根據DNA 濃度，用無菌水稀釋樣本濃度至1 ng·μL-1。擴增子使用特異性引物16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)引物擴增，上下游引物分別是341F：5’-CCTAYGGGRBGCASC AG-3’, 806R: 5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。所有PCR反應均使用15 μL Phusion high fidelity PCR Master Mix 進行，引物正向和反向分子量均為0.2 μmol·L-1，模板DNA 約為10 ng。擴增反應參數是初始變性溫度98℃ 1 min，變性溫度98℃ 10 s，退火溫度50℃ 30 s，延伸溫度72℃ 30 s，共30個循環(huán)。最后延伸溫度72℃ 1 min，10℃保存。混合PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，Germany）純化。然后使用TruSeq DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒生成測序庫，利用Qubit 和安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)對其進行評估，文庫檢測合格后，使用Illumina NovaSeq進行16S rDNA V4測序。

1.7.5 數據處理及生物信息學分析

測序完成后，將原始數據進行拼接并過濾后，得到有效數據。采用Uparse 軟件，默認以97%的一致性，對所有樣品的有效數據進行聚類，并將序列聚類為OTUs，基于Mothur 算法的Silva Database 進行物種注釋分析，研究不同樣本中優(yōu)勢種屬的差異、群落組成。利用QIIME 軟件計算Beta 多樣性，主要選用主坐標分析（PCoA）,用于說明所測樣本的相似性或差異性。通過MetaStat 和LEfSe 分析比較分析組間的物種組成和群落結構差異，篩選各水平中具有顯著差異的物種。

1.8 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用SAS 9.4 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，測定的數據均以均數±標準差（xˉ±s）表示，檢驗水準：α=0.05，當P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。組間比較，若符合正態(tài)檢驗與方差齊性檢驗，采用兩獨立樣本t檢驗；若符合正態(tài)檢驗但不符合方差齊性檢驗，采用兩獨立樣本校正t檢驗；若不符合正態(tài)檢驗，采用兩樣本比較的Wilcoxon Man-Whitney U 秩和檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量及一般情況觀察

造模后，與空白組比較，模型組體質量增加不明顯，小鼠毛發(fā)稀疏、攝食飲水減少、活動度減低、行動遲緩、精神萎靡、不活潑、大便稀粘。干預后，與模型組比較，針刺組體質量有所升高，小鼠攝食飲水、精神狀態(tài)、活動度、毛發(fā)情況等均有明顯改善，而假針刺組與其比較無明顯差異。

2.2 各組小鼠強迫游泳實驗比較

造模后，與空白組比較，模型組、假針刺組和針刺組小鼠強迫游泳不動時間明顯延長（P<0.001），提示乳腺癌CRF 小鼠模型構建成功。干預后，與模型組、假針刺組比較，針刺組小鼠強迫游泳不動時間均明顯縮短（P<0.001）；模型組和假針刺組強迫游泳不動時間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠強迫游泳實驗比較（±s，n=10）

2.3 各組小鼠曠場實驗比較

造模后，與空白組比較，模型組在曠場內的水平運動得分明顯降低（P<0.001），垂直運動得分也有所下降（P<0.01）（見表1），提示乳腺癌CRF 小鼠模型構建成功；干預后，與模型組、假針刺組比較，針刺組在曠場內的水平運動得分均有所升高（P<0.05），垂直運動得分也均明顯升高（P<0.01）；模型組與假針刺組比較差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見表2。

表1 造模前后小鼠曠場水平和垂直運動得分比較（±s，n=10）

表1 造模前后小鼠曠場水平和垂直運動得分比較（±s，n=10）

注：與空白組比較，***P<0.001。

組別空白組模型組P值水平運動得分造模前109.15±6.29 108.17±7.01 0.82造模后45.94±9.72 107.46±5.68***<0.001垂直運動得分造模前22.87±7.76 22.19±8.36 0.90造模后11.18±7.35 24.60±7.34***0.004

表2 針刺干預前后小鼠曠場水平和垂直運動得分比較（±s，n=10）

表2 針刺干預前后小鼠曠場水平和垂直運動得分比較（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假針刺組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別模型組假針刺組針刺組P值水平運動得分干預前42.10±9.15 43.93±9.74 45.32±9.93 0.87干預后6.72±1.82 7.79±3.29 12.24±2.97**##0.004干預后30.30±4.28 30.34±5.89 41.36±8.03*#0.02垂直運動得分干預前12.07±2.74 11.88±3.44 12.43±3.48 0.96

2.4 測序質量評估及物種注釋分析

優(yōu)化后的有效序列，進行OUT聚類，稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，可直接反映測序數據量的合理性，由圖2A可知，各組樣本平均得到48526條有效序列，各組樣本共獲得OUT數量為1428個，其中針刺組有415個，模型組有531個，假針刺組有482個，圖中顯示曲線趨向平坦，說明了測序數據量合理。Rank Abundance 曲線可反映樣物種的豐富度和均勻度，由圖2B 顯示得出曲線越來越平緩，則表示物種分布均勻。

圖2 物種多樣性曲線圖

2.5 針刺對模型小鼠腸道菌群結構組成的影響

根據物種注釋結果，統(tǒng)計針刺組、假針刺組、模型組3 組在門水平豐度排名前10 的物種，并繪制按樣本和按組分類的豐度柱形圖（見圖3）；同時統(tǒng)計3組屬水平的熱圖，以及繪制按樣本和按組分類的豐度柱形圖（見圖4）。運用MetaStat 方法找出組間差異顯著（P<0.05）的物種（見圖5）。針刺組與模型組比較，在門水平上，變形菌門豐度降低，放線菌門豐度升高；在屬水平上，鏈球菌屬、葡萄球菌屬豐度降低，擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和小球菌屬豐度升高。針刺組與假針刺組比較，在門水平上，變形菌門、彎曲桿菌門豐度降低，厚壁菌門、放線菌門豐度升高；在屬水平上，擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和小球菌屬豐度升高；葡萄球菌屬豐度降低。而由圖3A 顯示在門水平上針刺組脫硫弧菌門水平只在針刺組某一個樣本中豐度較高，而剩余樣本中豐度較低，圖4 顯示在屬水平上針刺組乳酸桿菌屬在3 組中豐度水平較高，針刺組大部分樣本乳酸桿菌屬豐度均較其他兩組高，有個別樣本豐度較低，這些情況均可能是存在個體差異的緣故。

圖3 門水平上的物種相對豐度柱狀圖

圖4 屬水平上的物種豐度聚類熱圖和豐度柱狀圖

圖5 MetaStat方法對組間的物種差異分析

2.6 LEfSe差異分析

進一步用LEfSe 分析軟件來挖掘各組間顯著差異的物種和微生物群落，結果顯示（見圖6）：3 組共得到23個豐度較高的差異物種，針刺組的差異物種為脫硫弧菌屬、放線菌門、瘤胃球屬，差異微生物群落為脫硫弧菌科、放線菌門；假針刺組的差異物種為脫硫弧菌屬、厭氧棍狀菌屬、副薩特菌屬，差異微生物群落為脫硫弧菌科、Marinifilaceae；模型組的差異物種為Muribacter、腸桿菌科、顫桿菌科，差異微生物群落為腸桿菌科、顫桿菌科。

圖6 組間差異顯著物種篩選結果

2.7 Beta多樣性分析

各組小鼠腸道菌群差異可通過PCoA 分析歸類，由圖7 結果顯示PC1 貢獻度為23.91%，PC2 貢獻度為10.8%。3 組小鼠的數據密度、空間距離均不相同，各組分布范圍均較大，雖然3組聚類有重疊部分，但由圖顯示各組樣品均能聚類，說明3 組的樣品菌群結構主成分具有顯著差異。結合Anosim 組間差異分析結果顯示（見表3），針刺組與模型組比較R 值為0.04185，假針刺組與針刺組比較R值為0.05612，模型組與假針刺組比較R 值為0.06633。如果R 值大于0，說明組間有差異，而3 組兩兩比較，其P值均大于0.05，由此提示3組組間腸道微生物群落有差異，但差異不顯著。

表3 各組小鼠腸道菌群群落結構Anosim分析

圖7 PCoA分析圖

3 討論

CRF 屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，主要病機為臟腑氣血陰陽的虧虛。化療如“藥毒”，耗傷機體脾胃氣陰，脾胃虛弱則氣血生化無源，故有疲勞、乏力、納差、腹瀉、嘔吐等癥狀，因此CRF 基本病機為“虛”，以脾腎受損為主[18-19]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在改善CRF 方面發(fā)揮重要作用，包括單味的中草藥、方劑、中成藥制品、中草藥提取物制成的水劑等[20-21]，但針刺在治療CRF 有其獨特優(yōu)勢，針刺通過毫針刺激穴位，并施以補瀉手法，激發(fā)經氣，能起到疏通經絡、調節(jié)臟腑、運行氣血、扶正祛邪的作用。研究發(fā)現運用針刺在改善腫瘤并發(fā)癥上具有一定的治療效果，如疼痛、失眠、抑郁、惡心、嘔吐、骨髓抑制、疲乏等[22]。同時，針刺治療CRF 也以調理脾腎二臟為主，臨床取穴以脾胃經和腎經為主，同時選取補益正氣相關穴位。足三里為足陽明胃經合穴，具有補益氣血，提高機體免疫力功效；三陰交屬足太陰脾經，有健脾益血，調補肝腎功能；百會為諸陽之會，是人體陽氣最強盛的地方；另外，任督二脈可溝通陰陽，激發(fā)正氣，如關元可培補元氣，氣海連命門，可補益中氣。一項臨床實驗研究發(fā)現針刺足三里、氣海、三陰交、關元能改善肺癌患者疲乏程度及生活質量[23]；另有研究者證實針刺百會、氣海、足三里、三陰交治療后，乳腺癌康復期患者的疲乏程度明顯低于假穴淺刺組[24]；同時一項Meta 分析結果發(fā)現針刺治療CRF穴位使用頻次較多的為足三里、關元、氣海、三陰交、百會[25]。因此，本實驗選用針刺足三里、三陰交、關元、氣海、百會五個穴位。相關研究發(fā)現針刺疲勞組穴可明顯改善癌因性疲乏患者化療后的疲勞癥狀，改善患者氣血兩虛型相關的中醫(yī)證候，提高患者生活質量[26]。Molassiotis 等[27]開展的一項多中心、大樣本臨床研究，302 例乳腺癌患者分為針刺聯合護理宣教組與常規(guī)護理組，結果證實治療組患者的疲乏、情緒以及生活質量評分均優(yōu)于對照組，提示針刺可能緩解CRF 并提高患者的生活質量。

本研究通過構建荷瘤乳腺癌小鼠模型，進而給予環(huán)磷酰胺化療后，建立乳腺癌化療后CRF 小鼠模型。結合小鼠的一般情況、體質量情況和行為學檢測，發(fā)現乳腺癌化療后CRF 小鼠毛發(fā)稀疏、攝食飲水減少、活動度減低、行動遲緩、精神萎靡、不活潑、大便稀粘、體質量明顯下降以及強迫游泳不動時間增加，提示模型小鼠有疲乏癥狀，造模成功。針刺干預后，相較于假針刺組和模型組，小鼠攝食飲水、精神狀態(tài)、活動度、毛發(fā)等一般情況明顯改善，體質量雖有升高，但與其他兩組相比無統(tǒng)計學意義；同時通過強迫游泳實驗檢測后，針刺組相較于假針刺組和模型組，小鼠疲乏程度有所減輕。結果證實針刺治療可以改善乳腺癌化療后CRF小鼠的疲乏癥狀以及一般情況。

腸道菌群是人體內種類繁多、參與多種生理代謝活動的微生態(tài)系統(tǒng)，其可在腸道內形成一個動態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng)，維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)，調控代謝、炎癥和免疫[28-30]。腸道菌群既可預防腫瘤發(fā)生，又可促進腫瘤發(fā)生，其中腸道內的益生菌發(fā)揮著抗腫瘤作用，致病菌則促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失調是指益生菌減少，致病菌數量增多，菌群比例失調，長期菌群失調即可引起腫瘤等疾病的發(fā)生[31-34]。研究發(fā)現腸道菌可通過去甲基化和去糖基化反應而抑制乳腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[35]。短鏈脂肪酸受體GPR109A 在乳腺癌中呈低表達水平，敲除GPR109A基因可導致小鼠自發(fā)形成乳腺癌以及早期的肺轉移[36]。

化療可能會打破腸道菌群穩(wěn)態(tài)，引起雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌明顯減少，葡萄球菌、大腸桿菌等機會致病菌增加。菌群失調會導致如疲勞、厭食、腹瀉、便秘、疼痛、骨髓抑制等，顯著降低了患者的生活質量。Brain Behavior and Immunity上的一項最新研究發(fā)現，將化療后的雌性小鼠糞菌移植給無菌雌性小鼠，可導致后者體質量下降、焦慮及神經炎癥，進而證實腸道菌群的失調可能促進了化療相關副作用的發(fā)生發(fā)展[37]。環(huán)磷酰胺能夠縮短腸道絨毛，促進局部炎癥細胞積累，破壞腸道屏障，導致腹瀉、機體免疫力下降等[38]。研究發(fā)現乳酸菌具有抗腫瘤、抗細菌、調節(jié)免疫等功效，如乳酸桿菌可激活B淋巴細胞，刺激各種免疫細胞因子如TNF-α、INF-γ等的產生，增強機體內抗腫瘤作用的體液免疫反應[39]。一項研究證實口服凍干乳酸桿菌和雙歧桿菌的益生菌組合，可預防順鉑的腸道毒性[40]；另一項研究發(fā)現乳酸菌可預防順鉑引起的心臟毒性[41]。本研究發(fā)現排除可能的個體差異外，針刺組大部分樣本的乳酸桿菌屬豐度水平高于其他兩組，說明針刺治療可會增強腸道內益生菌的水平，可提高乳腺癌化療后CRF 小鼠的免疫力，可能會減輕化療的不良反應，增強體內的抗腫瘤作用。變形菌門為革蘭陰性菌，作為致病菌，過度增殖會導致腸道缺氧，腸上皮功能障礙，抑制有益菌增殖，破壞菌群結構，干擾正?？寡讬C制和免疫抑制機制，阻礙腫瘤治療進程和破壞腫瘤免疫監(jiān)視[42]。本研究發(fā)現針刺組的變形菌門豐度和葡萄球菌屬豐度水平均明顯低于模型組和假針刺組，結果提示針刺治療可抑制腸道內致病菌的水平，改善腸道微環(huán)境，調節(jié)菌群失調。另外，LEfS 差異分析發(fā)現模型組差異物種為腸桿菌科，已知腸道內的腸桿菌科是變形菌門的菌科，進一步證實其可能導致模型組菌群失調。同時我們發(fā)現針刺組的差異物種包括放線菌門，而已知腸道可產生丁酸鹽的雙歧桿菌屬是放線菌門的菌屬，其可通過提高腸道屏障功能防御病原體，作為一種益生菌起到增加機體免疫力、減少化療不良反應，抑制腫瘤生長的作用。相關研究發(fā)現，擬桿菌屬的主要代謝產物之一的神經酰胺能調控細胞增殖、分化、凋亡，抑制腫瘤進展[43]。本研究發(fā)現在屬水平上，針刺組的擬桿菌屬水平明顯高于模型組和假針刺組，結果證實針刺可能通過提高腸道內擬桿菌屬的水平，起到抑制腫瘤進展的作用。同時本研究發(fā)現在門水平上針刺組脫硫弧菌門水平只在針刺組某一個樣本中豐度較高，而剩余樣本中豐度較低，因此其差異分析結果可能會存在個體差異引起的緣故。

綜上所述，針刺可以顯著改善乳腺癌化療后CRF小鼠的疲乏癥狀及一般情況，并可能通過增加腸道有益菌、降低致病菌、改善腸道菌群而發(fā)揮治療CRF 的作用。然而可能由于各組樣本的個體差異，在差異分析上可能存在一些不足之處，下一步我們將具體分析可能存在的問題，并同時分析腸道菌群調控的通路機制，以其為發(fā)現針刺治療CRF 的機制研究及臨床應用提供更明確的依據，為中醫(yī)傳統(tǒng)針刺法在腫瘤康復中的更廣泛應用提供一定的實驗基礎和理論依據。