張 娟，董建欣，李水仙，趙 巖，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·山東省仿制藥一致性評價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

藥物的臨床前安全性評價(jià)是決定藥物研發(fā)成敗的關(guān)鍵步驟及用藥安全評估的重要內(nèi)容。隨著上市新藥的增多，尤其是注射途徑藥物的廣泛應(yīng)用，藥物過敏反應(yīng)發(fā)生率大幅提升，因此，臨床前過敏反應(yīng)評價(jià)已成為新藥研發(fā)中安全性評價(jià)的重要組成部分［1-2］。被動皮膚過敏（PCA）試驗(yàn)是利用與同種或異種動物組織有結(jié)合性的抗體所引起的局部過敏反應(yīng)，來檢驗(yàn)抗體或抗原的高敏感度方法［3-4］。國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心在《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定了PCA 試驗(yàn)可選的動物、致敏陽性物質(zhì)、致敏給藥方法及時(shí)間。但由于不同種屬動物接受免疫球蛋白E（IgE）抗體血清后直至應(yīng)答抗原攻擊產(chǎn)生過敏反應(yīng)的時(shí)間不同，需注意激發(fā)時(shí)間選擇的合理性。目前存在的問題是過敏指導(dǎo)原則均為原則性描述，缺乏具體操作。大鼠在PCA 中反應(yīng)性差，常需用佐劑配合試驗(yàn)。有研究表明，即使在不加佐劑的情況下，豚鼠也是一種PCA 試驗(yàn)效果較好的模型動物［5-6］。因此，也常選用豚鼠進(jìn)行PCA 試驗(yàn)，但豚鼠的反應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn)強(qiáng)于大鼠，如何選擇合適的觀察時(shí)間測量藍(lán)斑大小是影響試驗(yàn)質(zhì)量的重要因素。本試驗(yàn)中采用目前常用的卵白蛋白（ova）和牛血清白蛋白（BSA）作為PCA 試驗(yàn)抗原，研究不同激發(fā)時(shí)間對不同廠家豚鼠PCA 中ova 和BSA 2 種陽性對照物發(fā)生過敏反應(yīng)程度的影響，從而尋找最適宜的評價(jià)時(shí)間。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：XSR-205DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為±0.01 g）；BS400S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，精度為±0.01 g）。

試藥：ova（批號為SLBB5992V）、BSA（批號為WXBD2626V），均購自美國Sigma Aldrich 公司；（0.9%）氯化鈉注射液（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號為1161104101）；依文思蘭（上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝，批號為82-11-02）。

動物：普通級Hartley 健康成年白化豚鼠，抗體血清制備9 只（雌5 只、雄4 只），被動致敏36 只（雌雄各半），均購自濰坊圣諾實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司（簡稱圣諾），動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2018 0002。SPF 級Hartley健康成年白化豚鼠，抗體血清制備9 只（雌5 只、雄4只），被動致敏36 只（雌雄各半），均購自青島康大生物科技有限公司（簡稱康大），動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2021 0003。普通級Hartley健康成年白化豚鼠，抗體血清制備9只（雌5 只、雄4 只），被動致敏36 只（雌雄各半），均購自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動物有限公司（簡稱金豐），動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2018 0006。豚鼠體質(zhì)量均為300～400 g，喂飼豚鼠生長繁殖飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料生產(chǎn)許可證號：京飼征2018 06073），置普通級動物室［試驗(yàn)許可證號：SYXK（魯）2021 0037］。溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照每天12 h，自由飲水。本試驗(yàn)方案經(jīng)研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分組：檢疫合格后，抗體血清制備階段，取各廠家豚鼠，分別隨機(jī)分為3組，各3只，即為圣諾陰性對照（NC）組、圣諾ova組、圣諾BSA 組，康大NC 組、康大ova組、康大BSA 組，金豐NC 組、金豐ova 組、金豐BSA 組。被動致敏階段，取各廠家豚鼠，分別隨機(jī)分為3 組，各6 只，即為圣諾NC組（4 h）、圣諾ova組（4 h）、圣諾BSA組（4 h）、圣諾NC組（24 h）、圣諾ova組（24 h）、圣諾BSA組（24 h），康大NC組（4 h）、康大ova組（4 h）、康大BSA組（4 h）、康大NC 組（24 h）、康大ova 組（24 h）、康大BSA 組（24 h），金豐NC組（4 h）、金豐ova組（4 h）、金豐BSA組（4 h）、金豐NC組（24 h）、金豐ova組（24 h）、金豐BSA組（24 h）。

抗體血清制備：NC 組、ova 組、BSA 組豚鼠分別予腹腔注射0.9% 氯化鈉注射液、0.4% ova 溶液、1%BSA 溶液（均為0.5 mL），隔日給藥，每日1 次，連續(xù)3次。末次致敏后第10天，腹腔注射4.5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）后腹主動脈取血，2 000 r/min 離心10 min，分離，得血清，組內(nèi)各動物血清合并備用；-20 ℃貯藏，2周內(nèi)使用。

被動致敏：在豚鼠背中線兩側(cè)距脊柱1.5 cm 處去毛，每側(cè)可剪2 點(diǎn)，點(diǎn)間間隔2～3 cm，備4 塊去毛區(qū)（見圖1），每塊面積約為3 cm × 3 cm。取各組相應(yīng)抗體血清，用0.9%氯化鈉注射液稀釋不同的倍數(shù)（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16，V/V），各組豚鼠按抗體血清濃度由大到小依次在去毛區(qū)1，2，3，4皮內(nèi)注射抗體血清0.1 mL。

圖1 豚鼠皮膚去毛區(qū)位置示意圖Fig.1 Location diagram of skin hair removal area in guinea pigs

激發(fā)：分別于被動致敏4 h 或24 h 時(shí)，各組豚鼠右后肢小隱靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的1%依文思蘭染料共1.0 mL，進(jìn)行激發(fā)。激發(fā)30 min后，以二氧化碳吸入法處死豚鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層的斑點(diǎn)大小，直徑>5 mm判定為陽性。不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長徑與短徑之和除以2［5，7-8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ova 致敏下的豚鼠過敏反應(yīng)程度

試驗(yàn)期，各組豚鼠一般狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)明顯異常狀況。3 個生產(chǎn)廠家的ova 組（4 h）抗體血清各稀釋倍數(shù)下形成的藍(lán)斑分界清晰且直徑均大于5.0 mm；3 個生產(chǎn)廠家的ova組（24 h）抗體血清各稀釋倍數(shù)下形成的藍(lán)斑已混在一起、分界不清，無法測量，但藍(lán)斑直徑均大于5.0 mm，被動皮膚過敏反應(yīng)發(fā)生率均為100%；3個廠家ova 組藍(lán)斑直徑無顯著差異。各NC 組（4 h 和24 h）豚鼠激發(fā)后均未見明顯藍(lán)斑，過敏反應(yīng)均呈陰性。詳見表1。

表1 豚鼠ova血清致敏的藍(lán)斑直徑（，mm，n=6）Tab.1 Diameter of blue spots sensitized by ova serum in guinea pigs（，mm，n = 6）

表1 豚鼠ova血清致敏的藍(lán)斑直徑（，mm，n=6）Tab.1 Diameter of blue spots sensitized by ova serum in guinea pigs（，mm，n = 6）

注：與同一稀釋倍數(shù)、同一廠家的NC 組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。- 為無法測量，表2同。Note：Compared with those in the NC group sensitized by the same dilution ratio of serum containing antibodies and from the same manufacturer，*P < 0.05，**P < 0.01. - indicates that the diameter cannot be measured（for Tab.1 - 2）.

1∶16 0.0±0.0 8.7±2.0**0.0±0.0-0.0±0.0 9.2±1.9**0.0±0.0-0.0±0.0 9.0±2.2**0.0±0.0-組別圣諾NC組（4 h）圣諾ova組（4 h）圣諾NC組（24 h）圣諾ova組（24 h）康大NC組（4 h）康大ova組（4 h）康大NC組（24 h）康大ova組（24 h）金豐NC組（4 h）金豐ova組（4 h）金豐NC組（24 h）金豐ova組（24 h）抗體血清比例（V/V）1∶2 0.0±0.0 24.8±3.7**0.0±0.0-0.0±0.0 25.0±3.7**0.0±0.0-0.0±0.0 21.7±5.3**0.0±0.0-1∶4 0.0±0.0 18.0±4.2**0.0±0.0-0.0±0.0 18.3±3.0**0.0±0.0-0.0±0.0 17.8±2.8**0.0±0.0-1∶8 0.0±0.0 13.5±2.2**0.0±0.0-0.0±0.0 13.0±1.8**0.0±0.0-0.0±0.0 12.7±1.6**0.0±0.0-

2.2 BSA 致敏下的豚鼠過敏反應(yīng)程度

圣諾和康大的BSA 組（4 h）抗體血清各稀釋倍數(shù)下形成的藍(lán)斑分界清晰且直徑均大于5.0 mm，被動皮膚過敏反應(yīng)發(fā)生率均為100.00%；與圣諾BSA 組（4 h）比較，金豐BSA 組（4 h）抗體血清4 個稀釋倍數(shù)的藍(lán)斑直徑顯著減?。≒<0.05），且該組僅含抗體血清1∶2、1∶4（V/V）的藍(lán)斑直徑大于5.0 mm。圣諾和康大的BSA 組（24 h）抗體血清各稀釋倍數(shù)形成的藍(lán)斑已混在一起、分界不清，無法測量，但藍(lán)斑直徑均大于5.0 mm，被動皮膚過敏反應(yīng)發(fā)生率均為100.00%；各NC 組（4 h和24 h）豚鼠激發(fā)后均未見明顯藍(lán)斑，過敏反應(yīng)呈陰性。詳見表2。相同條件（稀釋倍數(shù)和生產(chǎn)廠家）下，與BSA組比較，ova組的藍(lán)斑直徑明顯更大。

表2 豚鼠BSA血清致敏的藍(lán)斑直徑（，mm，n=6）Tab.2 Diameter of blue spots sensitized by BSA serum in guinea pigs（，mm，n = 6）

表2 豚鼠BSA血清致敏的藍(lán)斑直徑（，mm，n=6）Tab.2 Diameter of blue spots sensitized by BSA serum in guinea pigs（，mm，n = 6）

注：與圣諾BSA組（4 h）比較，#P < 0.05，##P < 0.01。Note：Compared with those in the Shengnuo BSA group （4 h），#P < 0.05，##P < 0.01.

抗體血清比例（V/V）1∶16 0.0±0.0 5.5±1.4 0.0±0.0-0.0±0.0 5.3±1.2 0.0±0.0-0.0±0.0 2.5±1.4##0.0±0.0 9.5±1.5組別圣諾NC組（4 h）圣諾BSA組（4 h）圣諾NC組（24 h）圣諾BSA組（24 h）康大NC組（4 h）康大BSA組（4 h）康大NC組（24 h）康大BSA組（24 h）金豐NC組（4 h）金豐BSA組（4 h）金豐NC組（24 h）金豐BSA組（24 h）1∶2 0.0±0.0 11.3±1.6 0.0±0.0-0.0±0.0 10.5±1.9 0.0±0.0-0.0±0.0 8.7±1.6#0.0±0.0 18.2±2.5 1∶4 0.0±0.0 9.3±1.6 0.0±0.0-0.0±0.0 8.5±1.9 0.0±0.0-0.0±0.0 6.7±1.6#0.0±0.0 15.8±2.0 1∶8 0.0±0.0 7.3±1.6 0.0±0.0-0.0±0.0 7.2±1.5 0.0±0.0-0.0±0.0 4.5±1.4##0.0±0.0 12.5±1.4

3 討論

PCA是一個錯綜復(fù)雜的試驗(yàn)過程［7］，其結(jié)果受動物種屬、致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、抗體血清制備時(shí)間、是否添加佐劑等多種因素的影響［8］。有文獻(xiàn)報(bào)道，豚鼠對蛋白類抗原的免疫應(yīng)答明顯強(qiáng)于大鼠［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，抗體制備階段致敏效果與致敏次數(shù)無相關(guān)性，末次致敏后第10天制備抗體血清的陽性反應(yīng)優(yōu)于末次致敏后第14 天制備抗體血清的陽性反應(yīng)［8，10］。由于指導(dǎo)原則中相關(guān)規(guī)定不夠具體，國內(nèi)雖已有學(xué)者對PCA 動物種屬、佐劑、假陰性試驗(yàn)結(jié)果等影響因素進(jìn)行了探討［9-15］，但目前關(guān)于PCA 被動致敏的評價(jià)時(shí)間及使用不同廠家的豚鼠的影響因素未見報(bào)道，值得進(jìn)一步探討。本研究中選取3 個廠家的豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行PCA 試驗(yàn)條件的研究，以便在預(yù)測受試物（主要是注射劑）的免疫原性時(shí)，采用更敏感的試驗(yàn)條件，從而取得更好的結(jié)果。

本研究中，ova 被動致敏適宜的激發(fā)時(shí)間為4 h，不同廠家豚鼠產(chǎn)生的藍(lán)斑直徑未見明顯差異；BSA被動致敏激發(fā)時(shí)間與豚鼠的生產(chǎn)廠家有關(guān)，不同來源的豚鼠PCA 試驗(yàn)的激發(fā)時(shí)間不同，提示應(yīng)用BSA 作為試驗(yàn)抗原時(shí)應(yīng)根據(jù)不同廠家的豚鼠選擇合適的激發(fā)時(shí)間；同時(shí)發(fā)現(xiàn)相同條件下ova 比BSA 更易產(chǎn)生被動皮膚過敏反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室已將所建立的方法應(yīng)用到苯甲醇注射液等品種的非臨床安全性評價(jià)的被動皮膚過敏試驗(yàn)中。

綜上所述，0.4% ova 溶液與前期主動全身過敏試驗(yàn)研究中能產(chǎn)生典型陽性癥狀的ova 劑量相同［2］，在進(jìn)行新藥PCA 的安全性評價(jià)時(shí)，首選ova 作為試驗(yàn)抗原，并確定了豚鼠PCA 中ova 適宜的激發(fā)時(shí)間為4 h，該研究為提高試驗(yàn)穩(wěn)定性和更好地評價(jià)新藥奠定了基礎(chǔ)。