黃路梅,陳 晨

牙本質(zhì)是由膠原基質(zhì)和分級排列的磷灰石納米晶體組成的膠原礦化組織。礦化物質(zhì)支撐牙本質(zhì)膠原,共同實現(xiàn)牙本質(zhì)的機(jī)械性能和維持生物學(xué)特性。當(dāng)前牙本質(zhì)粘接技術(shù)條件仍無法做到使樹脂單體在混合層底部實現(xiàn)膠原纖維的完全包裹,這就造成了混合層中膠原纖維被降解、進(jìn)而出現(xiàn)納米滲漏[1-2],也是當(dāng)前牙本質(zhì)粘接耐久性問題的根源所在。這種情況下,通過牙本質(zhì)仿生再礦化以改善膠原基質(zhì)生物力學(xué)性能和有效抑制膠原纖維的生物降解則被認(rèn)為是提高樹脂-牙本質(zhì)粘結(jié)耐久性的替代解決辦法[3-5]。天然多酚陸續(xù)被嘗試用于牙本質(zhì)再礦化[6-10],其中白藜蘆醇被證實具有較好的再礦化促進(jìn)作用[6],這種活性作用具有濃度依賴性[11],然而另有研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇在局部高濃度(10～40 μg/mL)時會表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。因此,尋找方法使白藜蘆醇適當(dāng)富集而又避免局部高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性無疑對增強(qiáng)其再礦化促進(jìn)效果及潛在的臨床應(yīng)用是有益的。當(dāng)前研究的目的即通過環(huán)糊精包嵌白藜蘆醇以使在不具細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上提升其再礦化活性并實現(xiàn)一定的緩釋。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇-環(huán)糊精包合物的合成及表征

稱取白藜蘆醇(MO,美國),加入乙醇(沃凱,中國上海),使其充分溶解;稱取環(huán)糊精,加入水?dāng)嚢枋蛊淙芙獬蔀轱柡腿芤?置于恒溫磁力攪拌器(國華,中國上海)上攪拌;再將白藜蘆醇的乙醇溶液逐滴加入到環(huán)糊精溶液中,繼續(xù)攪拌24 h,冷卻,靜置60 min,抽濾,-80 ℃過夜,結(jié)冰后真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器,中國北京)制成蓬松的塊狀物質(zhì),研碎,獲得白藜蘆醇-環(huán)糊精包合物。

分別取微量包合物粉末,以純白藜蘆醇粉末對照,采用KBr壓片法,測試紅外光譜(Nicolet 6700,Thermo Scientific公司,美國),衰減全反射設(shè)置為4 cm-1分辨率和32次掃描。測試范圍:4 000～400 cm-1。

稱取少量的白藜蘆醇和包合物,放入綜合熱重分析儀內(nèi)(TGA-4000,PerkinElmer公司,美國)對其進(jìn)行熱重測定,測定條件:溫度范圍為0～800 ℃,升溫速度為10 ℃/min,N2流速為40 mL/min。

1.2 細(xì)胞毒性評價

以單純乙醇溶劑作為對照組,測試1、5、10 μg/mL 4種濃度的白藜蘆醇組/包合物的細(xì)胞毒性。測試方法如下:人牙髓干細(xì)胞(北納生物,BNCC354453,中國蘇州)在37 ℃下,在DMEM培養(yǎng)基(Gibco,中國北京)中加入10%胎牛血清(麥克林,A801320,中國上海)和雙抗后培養(yǎng)。96孔板每孔加入約5 000個細(xì)胞,每組設(shè)置3個復(fù)孔,然后將細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后按組別加藥,加藥后分別孵育1、3、5、7 d。加入配制好的CCK8液(新賽美,C6005,中國蘇州)觀察OD值。

1.3 體外釋放度的測定

將相當(dāng)于3 mg的白藜蘆醇、包合物分別置于(37±0.5)℃、體積為900 mL的水中,分別在預(yù)定的時間點取樣1 mL(同時補(bǔ)充1 mL水),使用紫外-可見8 452A二極管陣列分光光度計(美國加州帕洛阿爾托惠普公司)在307 nm波長處測定白藜蘆醇吸光度,計算累積釋放度(Q)。釋放度=溶液中釋放的白藜蘆醇容量/投入白藜蘆醇總質(zhì)量×100%。

1.4 白藜蘆醇-環(huán)糊精包合物對牙本質(zhì)表面再礦化的作用

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號(2019)277),于2023年4月—5月在口腔頜面外科門診收集新鮮拔除、無齲壞的第三磨牙,去除牙周軟組織,使用低速切割機(jī)切割出0.5 mm×2.0 mm×2.0 mm牙頸部的牙本質(zhì)片,使用前浸泡在4 ℃ 0.1%的麝香草酚溶液中。

制備10 mg/mL白藜蘆醇-乙醇溶液,10 mg/mL包合物/乙醇溶液,并在使用前在4 ℃下儲存。將牙本質(zhì)切片浸入37%磷酸中以進(jìn)行完全脫礦(使用口腔內(nèi)牙科X射線設(shè)備(Focus 50540-IMG,KAVO,美國)進(jìn)行檢查),用雙蒸餾水完全沖洗,并吸干。然后,將切片分為4組,并進(jìn)行預(yù)處理30 min(n=1):純酸蝕作為空白對照組;純再礦化溶液處理組;白藜蘆醇組;環(huán)糊精-白藜蘆醇包合物組。

室溫下,將所有樣品在pH=7.2的0.1 mol/L PBS中的3%GD中固定4 h,并用0.1 mol/L PBS沖洗。在上升乙醇系列(25%、50%、75%、90%、95%和100%)中脫水后干燥。用金(E-1045日立,日本)濺射涂覆處理過的樣品,并用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM,日立S-4800,日本)檢查脫鈣膠原基質(zhì)的形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 FTIR分析

包合物、白藜蘆醇及環(huán)糊精的FTIR譜圖如圖1所示,在環(huán)糊精和環(huán)糊精-白藜蘆醇包合物的FTIR光譜中,羥基O—H的價鍵振蕩呈寬頻帶形式,環(huán)糊精和環(huán)糊精-白藜蘆醇包合物最大值分別在3 405.92 cm-1和3 363.59 cm-1處。環(huán)糊精的特征峰為3 405.92-1,2 927.54-1,1 028.55-1,這些值反映了O—H和CH2的對稱和非對稱伸縮振動以及O—H的彎曲振動。在1 700～450 cm-1范圍內(nèi),白藜蘆醇的紅外吸收在1 610.29、1 587.24和1 385.06 cm-1處顯示出3個特征強(qiáng)波段,分別對應(yīng)于芳香C—C雙鍵的吸收、烯烴C—C鍵的吸收和C—O的吸收。典型的反式烯烴帶為962.88 cm-1。包合物的FTIR光譜顯示“客體”分子的光譜特征發(fā)生了變化,1 385.06 cm-1和962.88 cm-1處的譜帶強(qiáng)度下降,而1 610.29 cm-1、1 587.24 cm-1處的譜帶消失。這些變化驗證了包合物的形成。

圖1 白藜蘆醇、環(huán)糊精及包合物紅外圖Fig.1 FTIR spectra of cyclodextrin, resveratrol and inclusion complex

2.2 熱重分析(thermogravimetry analysis)

包合物、白藜蘆醇、環(huán)糊精的熱重譜圖如圖2所示。白藜蘆醇在345 ℃時迅速發(fā)生質(zhì)量損失,環(huán)糊精-白藜蘆醇包合物組在342 ℃時迅速發(fā)生質(zhì)量損失。并且圖中顯示環(huán)糊精與包合物的3個區(qū)域的質(zhì)量損失。第1個區(qū)域在140 ℃左右,質(zhì)量損失約15%,可能是由于與環(huán)糊精相關(guān)的表層水蒸發(fā)所致。第2階段約為200 ℃,質(zhì)量損失為2%,可能是由于內(nèi)部水分蒸發(fā)所致。第3個階段約為350 ℃時,質(zhì)量損失為80%,可能與化合物降解有關(guān)。樣品之間差別較明顯階段在第1和第3階段,包合物顯示出更高的熱穩(wěn)定性。

a:環(huán)糊精、白藜蘆醇、包合物TG曲線;b:白藜蘆醇TG-DTG圖;c:環(huán)糊精TG-DTG圖;d:包合物TG-DTG圖;dw/dt是W對t的微分,代表樣本質(zhì)量對溫度的變化速率

2.3 細(xì)胞毒性評價

將制得的包合物與白藜蘆醇進(jìn)行CCK8實驗分析,如圖3所示。白藜蘆醇組在濃度為5 μg/mL時已經(jīng)表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性,環(huán)糊精-白藜蘆醇復(fù)合物組在10 μg/mL時才表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。白藜蘆醇經(jīng)環(huán)糊精包合后,細(xì)胞毒性顯著降低。

***:P<0.001,****:P<0.000 1

2.4 白藜蘆醇釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線及釋放度

用無水乙醇溶液為空白,在307 nm處測定吸光度值,以白藜蘆醇濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為:y=0.131x-0.004 7,R2=0.999 6,結(jié)果表明白藜蘆醇在0～6 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。白藜蘆醇7 d內(nèi)總釋放度為25.85%。

圖4 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of resveratrol

2.5 SEM分析

圖5A顯示了脫礦牙本質(zhì)表面的典型SEM圖像,牙本質(zhì)小管保持完全開放,管壁和牙本質(zhì)小管之間的膠原纖維形態(tài)可見。純再礦化液組(B)的牙本質(zhì)小管保持開放,但在膠原纖維之間和牙本質(zhì)小管內(nèi)形成少量晶體,膠原形態(tài)模糊。白藜蘆醇組(C)和包合物組(D)的晶體形成顯著增加,膠原形態(tài)被其完全覆蓋。

A:無預(yù)處理組;B:無預(yù)處理+再礦化液組;C:白藜蘆醇預(yù)處理組;D:包合物預(yù)處理組

3 討 論

白藜蘆醇是多種植物受到刺激時產(chǎn)生的一種抗毒素,近年來被發(fā)現(xiàn)有多種藥理活性,在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。白藜蘆醇為天然多酚類化合物,具有抗氧化和抗炎的特性,目前已有少量研究證明白藜蘆醇與膠原有交聯(lián)作用,能夠維持甚至增強(qiáng)膠原纖維的強(qiáng)度,從而保護(hù)混合層的完整性[2]。這些作用主要來源于多酚中的酚羥基。白藜蘆醇分子中含有3個酚羥基,因此白藜蘆醇能夠通過氫鍵對膠原纖維進(jìn)行生物修飾[9]。白藜蘆醇還被證實能通過抑制混合層底部基質(zhì)金屬蛋白酶活性,促進(jìn)混合層底部仿生再礦化,提高樹脂-牙本質(zhì)的結(jié)合耐久性,且不會造成牙本質(zhì)的染色[12]。仿生再礦化作為一種富水、樹脂稀疏的膠原基質(zhì)的遞進(jìn)脫水機(jī)制[13-15],使樹脂-牙本質(zhì)粘接界面能夠長時間抵抗降解[6,16]。白藜蘆醇的疏水性有助于在長期的水環(huán)境中排斥水分子對混合層的侵入[10]。白藜蘆醇發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于劑量依賴性,低劑量(0.5 μg)時呈現(xiàn)有益生物活性,而在高劑量時則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[11]。本實驗運用分子包合技術(shù),使用環(huán)糊精包合白藜蘆醇,根據(jù)CCK8實驗測試結(jié)果,經(jīng)環(huán)糊精包合后,白藜蘆醇毒性顯著下降,這對于應(yīng)用時可以通過增加局部濃度進(jìn)一步提升白藜蘆醇的生物活性是有意義的。

環(huán)糊精是在主客體化學(xué)中應(yīng)用較多的主體分子,其具有疏水性空腔,并且其對藥物的緩釋能力已被證實[15]。包合作用可以看成是客分子取代已被包合的水分子的過程,白藜蘆醇等疏水性藥物容易被主體分子包合。本研究采用冷凍干燥法,按照包合比1∶1制備得到白藜蘆醇-環(huán)糊精包合物,將該包合物使用傅里葉紅外光譜(FTIR)、熱重實驗(TG)來驗證包合物的形成。傅里葉紅外光譜圖顯示,包合物的各譜峰強(qiáng)度明顯降低或消失,物質(zhì)特征峰的變化證明了包合物的形成。熱重圖各物質(zhì)不同的溫度下降區(qū)間也表明了包合物的形成。

環(huán)糊精包合白藜蘆醇的目的是解決局部白藜蘆醇溶解度低,生物活性不穩(wěn)定[17-19]的問題,最終是期望用于牙本質(zhì)再礦化的促進(jìn)。通過環(huán)糊精的包裹,使得白藜蘆醇能夠被緩慢釋放,長時間作用于脫礦牙本質(zhì),在不引起細(xì)胞毒性的情況下促進(jìn)牙本質(zhì)再礦化。為直觀評價包合對牙本質(zhì)再礦化的價值,本實驗采用掃描電鏡觀察包合物預(yù)處理后脫礦膠原再礦化的情況,根據(jù)觀察結(jié)果,對比酸蝕組及單純再礦化組,白藜蘆醇組和包合物組晶體形成顯著增加,膠原形態(tài)被其完全覆蓋。環(huán)糊精包合白藜蘆醇后,包合物在牙本質(zhì)表層緩慢釋放白藜蘆醇,白藜蘆醇得以進(jìn)入脫礦膠原的深部,促進(jìn)深部膠原的再礦化。白藜蘆醇是單分子、低分子量、高滲透性的化合物,可以順利到達(dá)牙本質(zhì)更深層,并利用—OH基團(tuán)有效地結(jié)合到膠原纖維表面,發(fā)揮自下而上的再礦物質(zhì)化作用[20-22]。