龍斐斐，張清安，張志華,2

加工工序對苦杏仁球蛋白免疫反應性及消化穩(wěn)定性的影響

1陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119；2內蒙古高原杏仁露有限公司，內蒙古準格爾旗 017100

【背景】近年來，過敏已經成為全球關注的健康問題，過敏人群數(shù)量持續(xù)上升。堅果是常見的過敏誘因之一，苦杏仁為常見的堅果，因其含有致敏的苦杏仁球蛋白（amandin），成為最易引起過敏的堅果之一，因此，脫敏已成為其研究熱點?？嘈尤始庸ひ话阋涍^去皮、脫苦和干制等工序，而在這些加工過程中，其致敏性是否會受到影響尚未見到相關報道?！灸康摹刻骄考庸すば驅嘈尤手旅粜缘挠绊?，并以苦杏仁致敏性、品質和營養(yǎng)特性為評價指標，優(yōu)化加工工序使苦杏仁產品致敏性最低，為低致敏性苦杏仁產品加工提供理論依據(jù)和技術支撐?！痉椒ā坎捎肳estern blotting和ELISA試驗研究不同去皮、脫苦和干制方法對苦杏仁中amandin免疫反應性的影響；采用圓二色光譜、外源熒光光譜、表面疏水性和zeta電位測定以研究各加工工序對amandin結構和表面性質的影響，分析致敏蛋白免疫反應性變化的機理；最后采用體外模擬消化試驗探究加工前后苦杏仁中amandin的消化穩(wěn)定性，并對消化產物進行Western blotting分析，進一步探究苦杏仁潛在致敏性的變化情況?！窘Y果】就致敏性而言，苦杏仁經飽和熱空氣去皮和熱燙去皮后的amandin免疫反應性分別降低了8.41%和13.15%，再經超聲快速脫苦后amandin的免疫反應性又降低6.79%，熱水脫苦對其免疫反應性無顯著影響；脫苦杏仁經自然干燥和熱風干燥后amandin的免疫反應性分別顯著上升4.58%和2.81%（＜0.05）。結合加工工序對苦杏仁品質和營養(yǎng)特性的影響，最終優(yōu)化得到低致敏性苦杏仁的加工工序為飽和熱空氣去皮、超聲快速脫苦和熱風干制，經此工序加工后苦杏仁免疫反應性降低15.03%。就致敏蛋白結構而言，致敏蛋白的二級結構組成、三級結構、表面疏水性以及zeta電位在加工過程中都發(fā)生了一定程度變化，其中超聲快速脫苦顯著改變了amandin的三級結構并使其表面疏水性顯著增強（＜0.05），從而使其免疫反應性降低最顯著。就消化穩(wěn)定性而言，加工后的amandin消化穩(wěn)定性明顯降低，致敏蛋白中與特異性抗原抗體反應相關結構降解速度加快，導致苦杏仁的潛在致敏性進一步降低?！窘Y論】不同加工工序處理可通過改變amandin的結構而對苦杏仁致敏性產生影響，生產中可以通過合理的加工方式來降低苦杏仁的致敏性。

苦杏仁；苦杏仁球蛋白；加工；免疫反應性；消化穩(wěn)定性

0 引言

【研究意義】苦杏仁作為常見的堅果，除含有大量的功能性成分，如酚類化合物、黑色素、膳食纖維和苦杏仁苷等外；還含有很高的營養(yǎng)成分，含油量約為45%—50%、粗纖維9.4%、蛋白質23.6%—26.2%、總糖9%，因此，苦杏仁常用作藥食兩用資源[1-3]。但由于苦杏仁含有致敏的苦杏仁球蛋白（amandin），也讓其成為最易引發(fā)過敏反應的堅果之一[4]，易引發(fā)食品安全問題。脫敏已成為該領域的研究熱點，目前對苦杏仁致敏性在加工過程中的變化及機制研究少有報道，有必要探究加工方法對苦杏仁致敏蛋白的影響，以便為低致敏性苦杏仁及其相關產品的開發(fā)提供參考?！厩叭搜芯窟M展】苦杏仁含有與美國大扁杏仁（almond）相同的主要過敏原苦杏仁球蛋白（amandin）[5]。amandin是一種11S球蛋白，分子量約360 kDa，由6個單體聚合而成，每個單體由一個酸性亞基（42—46 kDa）和一個堿性亞基（20—22 kDa）通過二硫鍵連接[6]。其具有高度水溶性，是主要的儲藏蛋白，約占almond水溶性蛋白的60%[7]，包含過敏患者血清IgE識別的主要反應多肽[8]，與攝入杏仁引發(fā)的過敏反應有關[9]。Willison等[10]用小鼠單克隆抗體（mAb）4C10對amandin的構象表位進行了研究，并對amandin亞基進行測序、克隆和篩選，從而用于對杏仁過敏患者血清中IgE的結合研究。結果顯示，相較于構象表位，amandin亞基上的線性表位對其免疫反應性起著更為重要的作用[11]。amandin還具有一定的熱穩(wěn)定性，無論是燙漂、烘烤或高壓滅菌處理都不能顯著降低其在苦杏仁中的含量[9]。Venkatachalam等[12]研究了焙烤、燙漂、高壓滅菌和微波處理對amandin免疫反應性的影響，結果顯示amandin的免疫活性相對穩(wěn)定。ALBILLOS等[6]對amandin及其酸性和堿性多肽的熱穩(wěn)定性進行了分析，并對尿素處理后amandin的化學變性狀態(tài)進行研究，結果顯示，amandin在還原劑作用下發(fā)生不可逆變形，且由熱和化學變性產生的堿性和酸性多肽的熱穩(wěn)定性低于多聚體蛋白。Kshirsagar等[13]研究發(fā)現(xiàn)SDS、-巰基乙醇使amandin的免疫反應性顯著降低。由此可見，關于amandin的研究大多都是甜杏仁，缺乏苦杏仁免疫反應性尤其加工對免疫反應性影響的研究，因此有必要結合苦杏仁加工過程中不同工序及技術，來探究苦杏仁免疫反應性變化?！颈狙芯壳腥朦c】由于苦杏仁含有苦杏仁苷，其加工一般要經過去皮、脫苦和干制等過程，而這些加工工序對苦杏仁致敏蛋白免疫特性影響及機制有待研究?！緮M解決的關鍵問題】通過Western blotting和ELISA分析，研究不同去皮、脫苦和干制方法處理對苦杏仁amandin免疫反應性的影響；采用圓二色譜、外源熒光光譜、表面疏水性測定和zata電位測定探究加工方法對amandin結構的影響進而明確變化機制；采用體外模擬消化試驗，分析加工對amandin消化穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁，陜西省思源藥材行；8-苯胺-1-萘磺酸，上海麥克林生化科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及電泳液、蛋白上樣緩沖液（5×）、彩色預染蛋白分子量標準、轉印濾紙、PVDF摸QuickBlockTMWestern溶液套裝、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgE、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、Tween-20、QuickBlock封閉液（PBS）、TMB顯色液和TMB顯色終止液，上海碧云天生物技術有限公司；兔源amandin多克隆抗體，武漢優(yōu)越達生物科技有限公司；麗春紅染液，陜西中輝赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；96孔不可拆酶標板（高結合力），北京蘭杰柯科技有限公司；人工模擬唾液、人工模擬胃消化液、人工模擬十二指腸液和人工模擬膽汁，北京雷根生物技術有限公司。

1.2 苦杏仁加工工序

1.2.1 苦杏仁去皮方法 飽和熱空氣去皮[14]：準確稱取300.00 g苦杏仁，按料液比1﹕2（g·mL-1）加入去離子水600 mL浸漬23 min，撈出苦杏仁后平鋪于烤盤，放入蒸汽烤箱中，設置蒸汽溫度65 ℃，時間6 min。處理完成后取出苦杏仁揉搓去皮。去皮后樣品置于-20 ℃，用于后續(xù)提取amandin和脫苦加工。

熱燙去皮[15]：準確稱取300.00 g苦杏仁，加入1 200 mL沸水熱燙4 min后撈出，揉搓去皮。去皮后樣品用于后續(xù)提取amandin和脫苦加工。

1.2.2 苦杏仁脫苦方法 超聲快速脫苦[16]：將去皮后的苦杏仁與去離子水按照料液比1﹕12（g·mL-1）裝入燒杯中，放入超聲池內，設置超聲參數(shù)為溫度55 ℃、功率300 W、頻率59 kHz，時間60 min。脫苦后樣品用于后續(xù)提取amandin和干制加工。

熱水脫苦[17]：將去皮苦杏仁按料液比1﹕12（g·mL-1）浸泡于70 ℃熱水中，每2 h換一次熱水，經8 h即可完成脫苦。脫苦后的樣品用于后續(xù)提取amandin和干制加工。

1.2.3 苦杏仁干制方法 熱風干燥[18]：去除脫苦杏仁表面水分，均勻平鋪于烘盤并放入烘箱，設置烘箱溫度為80 ℃，3 h后取出，得到干燥的苦杏仁，用于后續(xù)提取amandin。

自然干燥[18]：去除脫苦杏仁表面水分，均勻平鋪于烘盤中，放在通風處自然晾干，36 h后得到干燥的苦杏仁，用于后續(xù)提取amandin。

1.3 amandin的提取

制備脫脂苦杏仁粉：將上述加工后的苦杏仁用高速粉碎機打磨成粉?？嘈尤史叟c正己烷以1﹕10（w/v）的比例混合進行脫脂。脫脂苦杏仁粉與去離子水以1﹕30（w/v）的比例混合，磁力攪拌提取1 h后6 000 ×離心20 min，收集上清液，重復提取兩次，合并兩次浸提液，經0.45 μm纖維素濾膜過濾，收集濾液置于4 ℃過夜，在4 ℃ 12 000 ×條件下離心40 min，收集沉淀，其主要物質即為致敏蛋白amandin（約65%）。將收集的沉淀溶于PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4）緩沖液中，用去離子水透析9 h，每3 h更換一次去離子水，最后凍干得到蛋白粉末于-20 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

1.4 amandin免疫反應性測定

1.4.1 BCA蛋白含量測定 將標準品BSA用PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4）溶液稀釋至0.5 mg?mL-1。根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按照體積比A﹕B=50﹕1配置適量BCA工作液，充分混勻。再將0.5 mg?mL-1的標準品按0、1、2、4、8、16和20 μL加到96孔板的樣品孔中，再加PBS補足至20 μL，即得到0—0.5 mg?mL-1的標準品溶液。取苦杏仁致敏蛋白凍干粉0.2 mg溶解于1 mL PBS中，再分別稀釋2倍、4倍、8倍加到樣品孔中。然后在各樣品孔中加入200 μL BCA工作液，37 ℃孵育30 min，用酶標儀測定562 nm的OD值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.4.2 SDS-PAGE 取0.2 mg?mL-1蛋白溶液40 μL與10 μL 5×上樣緩沖液混合均勻，沸水浴10 min，得到還原性蛋白樣品；取0.2 mg?mL-1蛋白溶液40 μL與10 μL 5×非還原上樣緩沖液（不含DDT或-巰基乙醇）混合均勻，得到非還原性蛋白樣品。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。上樣后，設置電泳程序為80 V、35 min后120 V、50 min。電泳完成后，取出膠板在考馬斯亮藍R-250染色液中浸泡2 h，然后在脫色液中浸泡，每30 min換一次脫色液，直至呈現(xiàn)清晰的蛋白條帶[6]。

1.4.3 Western blotting 通過SDS-PAGE分離的致敏蛋白，通過濕法轉印至0.2 μm PVDF膜上，用洗滌液洗去蛋白膜表面的轉膜液后，在4 ℃下用封閉液將膜封閉過夜，用洗滌液清洗3次，每次清洗5 min。然后，將膜放入裝有適量一抗（1﹕1 500體積比稀釋的兔抗amandin）的孵育盒中，在4 ℃下孵育1 h后，用洗滌液清洗3次，每次清洗5 min。再將其放入裝有適量二抗（1﹕1 000體積比稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG）的孵育盒中，在室溫下孵育2 h，用洗滌液清洗3次，每次清洗5 min。將超敏ECL化學發(fā)光試劑盒中顯色液A和顯色液B等體積混合，立即滴在PVDF膜上，通過化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集圖片[20]。

1.4.4 間接競爭ELISA 用包被液配制濃度為50 μg?mL-1的amandin溶液，按100 μL/孔加至96孔板，4 ℃孵育過夜。棄去板內包被液，按200 μL/孔加入PBST清洗96孔板，清洗3次，每次3 min。按200 μL/孔加入QuickBlock封閉液，37 ℃封閉30 min。封閉完成后洗板3次，每次3 min，將抗amandin抗體（anti-amandin antibody）以1﹕5 000（v/v）比例稀釋，按100 μL/孔加入96孔板，37 ℃孵育一抗60 min。再次洗板，每次3 min，將辣根標記山羊抗兔IgE以1﹕8 000（v/v）比例稀釋，按100 μL/孔加入96孔板，37 ℃孵育二抗60 min。洗板3次，每次3 min，按100 μL/孔加入TMB顯色液，室溫避光孵育10 min，加入100 μL/孔TMB顯色終止液終止反應；用酶標儀在450 nm波長下測定OD值[21]。

1.5 amandin結構特性測定

1.5.1 圓二色譜分析 圓二色光譜是用于分析推斷非對稱分子構型和構象的一種旋光光譜，被廣泛用于測定蛋白質的二級結構[22]。將從不同加工處理后苦杏仁中提取的致敏蛋白凍干粉溶解于PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4）溶液中制得1 mg?mL-1樣品溶液，再稀釋溶液至0.1 mg?mL-1，并于1 mm石英比色皿中進行圓二色光譜測定。掃描波長范圍為190—260 nm，采集時間為1 s，帶寬為2 nm，平行測定3次取平均值并扣除空氣與PBS的背景值[6]。二級結構組成通過圓二色光譜在線分析軟件Dichroweb進行分析。

1.5.2 外源熒光分析 將從不同加工處理后苦杏仁中提取的致敏蛋白凍干粉溶解于PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4），得到0.2 mg?mL-1樣品溶液，加入40 μL 8 mmol?L-1的ANS溶液于4 mL樣品溶液中并混合均勻，避光靜置30 min。用熒光分光光度計在發(fā)射波長385—720 nm，激發(fā)波長372 nm，狹縫5 nm條件下掃描熒光光譜[23]。

1.5.3 表面疏水性測定 將從不同加工處理后苦杏仁中提取的致敏蛋白凍干粉溶解于PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4），得到0.2 mg?mL-1的樣品溶液，再分別稀釋至0.005、0.01、0.02、0.1和0.2 mg?mL-1。分別加入40 μL 8 mmol?mL-1ANS于4 mL樣品溶液中并混合均勻，避光靜置30 min。使用熒光分光光度計在激發(fā)波長372 nm，發(fā)射波長385—720 nm，狹縫5 nm條件下掃描熒光光譜，通過線性回歸分析最大熒光強度對蛋白濃度的初始斜率，即為表面疏水性系數(shù)H0[24]。

1.5.4 Zeta電位測定 用PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4）溶液配置1 mg?mL-1的苦杏仁致敏蛋白溶液，用激光粒度Zeta電位儀測量電位。將約1.3 mL的蛋白溶液裝入樣品池，插入干凈電極片，使溶液完全浸沒電極片，連接電極線，放入樣品槽進行測定。

1.6 amandin消化穩(wěn)定性測定

1.6.1 Tricine-SDS-PAGE 將消化產物稀釋3倍后，與上樣緩沖液（5×）按4﹕1比例混合均勻。配置16.5%的分離膠、10%的夾層膠和4%的濃縮膠。上樣后，設置電泳條件為：程序一為30 V、1 h，程序二為100 V、2 h，待溴酚藍指示劑到達玻璃板底部時結束電泳。電泳完成后，取出膠板在考馬斯亮藍R-250染色液中浸泡2 h，再在脫色液中浸泡，每30 min換一次脫色液，直至呈現(xiàn)清晰的蛋白條帶。

1.6.2 體外靜態(tài)模擬消化 按照胡雪潔[25]的方法并稍作修改。分別制備兩份致敏蛋白溶液，標記為A和B，每份取90 mg致敏蛋白凍干粉與2.5 mL蒸餾水混合均勻。將致敏蛋白溶液與其他體外模擬消化所需的各種溶液預熱至37 ℃。

模擬口腔消化：分別在裝有致敏蛋白溶液的錐形瓶A、B中加入2.5 mL口腔消化液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中，60 r/min消化 2 min。

模擬胃消化：口腔消化結束后，分別向A、B中加入4 mL胃消化液，用1 mol?L-1HCl調節(jié)pH至2.5，最后用去離子水補充體積至10 mL，再放入37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中，60 r/min消化60 min。分別在消化0、5、10、30和60 min后，從A中取出1.5 mL消化產物，并用1 mol?L-1NaHCO3調節(jié)pH至中性，并在沸水浴中滅酶活5 min。

模擬腸消化：胃消化過程結束后，分別向B中依次加入5 mL人工模擬十二指腸消化液，2 mL人工模擬膽汁，用1 mol?L-1NaOH調節(jié)pH至7，最后用去離子水補充體積至20 mL。在37 ℃下分別在消化0、5、15、30、60、90和120 min后取出2 mL消化產物，在沸水浴中滅酶5 min。

將得到的消化產物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件（16.0版）比較不同加工處理后蛋白質結構特性的統(tǒng)計學差異，差異分析采用Duncan多重比較，＜0.05視為樣品間差異顯著。數(shù)據(jù)分析及處理主要采用SPSS（16.0版）和Origin 2018。

2 結果

2.1 苦杏仁加工工序對amandin免疫反應性的影響

2.1.1 不同去皮方法對amandin免疫反應性的影響

還原條件和非還原條件下，amandin的特征條帶均沒發(fā)生顯著變化。在非還原條件下，amandin主要由61—63 kDa的多肽條帶組成；而還原條件下，主要由分子量大小為35—41 kDa及23—28 kDa的條帶組成。與未處理苦杏仁中提取的amandin（UA）相比，非還原條件下，經飽和熱空氣去皮苦杏仁中提取的amandin（SHAP）和經熱燙去皮苦杏仁中提取的amandin（BIBW）低分子量條帶均增強，且BIBW的增強更為明顯。還原條件下，BIBW的蛋白條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象（圖1-A）。

免疫反應性是指抗原與相應免疫應答產物抗體在體內或體外發(fā)生特異性結合，引起免疫反應性的能力，是評價食品致敏性的重要指標。Western blotting和間接ELISA用于檢測評估不同處理amandin的IgG/IgE結合能力，以兔源anti-amandin antibody為一抗，識別3種amandin溶液的免疫條帶變化。如圖1-B所示，飽和熱空氣去皮和熱燙去皮未改變amandin免疫條帶的分子量。還原條件下，識別出免疫條帶分子量為35—41 kDa；非還原條件下識別出分子量為61—63 kDa的免疫條帶。但免疫圖譜上可以觀察到amandin的免疫條帶強度發(fā)生了改變，因此對Western blotting圖譜進行灰度分析。一般來說，相對灰度值越大，表明蛋白質的免疫反應性越強。還原條件下，SHAP的免疫條帶灰度值降低了20.68%，BIBW的免疫條帶灰度值降低了8.37%；非還原條件下，SHAP的免疫條帶灰度值降低了2.75%，BIBW的免疫條帶灰度值降低了36.47%，兩種去皮方法都在一定程度上降低了amandin的免疫反應性（圖1-B）。

Western blotting可以反映致敏條帶的分子量信息，但其定量效果具有相對性，因此采用間接ELISA進一步準確測定UA、SHAP和BIBW之間免疫反應性的差異。圖1-C顯示，SHAP的免疫反應性顯著降低了8.41%（＜0.05），而BIBW的顯著降低13.15%（＜0.05），表明飽和熱空氣去皮和熱燙去皮都顯著降低了苦杏仁中amandin的免疫反應性，與Western blotting檢測結果一致。

2.1.2 不同脫苦方法對amandin免疫反應性的影響 苦杏仁經飽和熱空氣去皮后分別采用超聲快速脫苦和熱水脫苦兩種方法進行加工，探究兩種脫苦方法對苦杏仁中amandin免疫反應性的影響。在還原和非還原條件下，經熱水脫苦的苦杏仁中提取的amandin（HWD）和超聲快速脫苦的苦杏仁中提取的amandin（UAD）主要特征條帶都沒有明顯變化。非還原條件下，可以明顯觀察到HWD和UAD在52—66 kDa間的條帶都明顯增強（圖2-A）；HWD和UAD在37—52 kDa間的條帶明顯增強（圖2-C）。

UAD：超聲快速脫苦；HWD：熱水脫苦。下同

致敏蛋白條帶的分子量仍沒有明顯變化，但在還原和非還原條件下，都可以明顯觀察從UA到UAD，特異性抗原抗體反應呈現(xiàn)減弱趨勢。非還原條件下SHAP的免疫條帶灰度降低32.40%，熱水脫苦和超聲快速脫苦后又分別使amandin的免疫條帶灰度降低了16.31%和21.84%（圖2-B）；SHAP的免疫條帶灰度降低了45.55%，HWD和UAD的相對灰度值在SHAP的基礎上又分別降低16.79%和25.01%（圖2-D）。由此可見，兩種脫苦方法都在一定程度上降低了amandin的免疫反應性，且超聲快速脫苦的效果更明顯。采用間接ELISA測定進一步驗證致敏蛋白的免疫反應性變化情況，圖2-E顯示，SHAP的免疫反應性顯著降低了8.41%（＜0.05），熱水脫苦前后amandin的免疫反應性沒有顯著變化，而超聲快速脫苦使amandin的免疫反應性顯著降低6.79%（＜0.05），說明間接ELISA測定結果與western blotting試驗結果趨勢一致，即熱水脫苦對amandin的免疫反應性沒有顯著影響，而超聲快速脫苦可以顯著降低其免疫反應性。

2.1.3 不同干制方法對amandin蛋白免疫反應性的影響 將經飽和熱空氣去皮和超聲快速脫苦的苦杏仁采用熱風干燥和自然干燥兩種方法進行加工，探究兩種干制方法對苦杏仁中致敏蛋白amandin免疫反應性的影響。還原和非還原條件下，amandin的主要特征條帶仍沒有改變。還原條件下，熱風干燥（HAD）和自然干燥（ND）的蛋白條帶無明顯差異（圖3-A）；非還原條件下，ND的低分子量條帶消失，與UA的條帶組成基本一致（圖3-C）。

圖3 熱風干燥（HAD）和自然干燥（ND）后苦杏仁中amandin非還原條件下的SDS-PAGE圖譜（A）和Western boltting圖譜（B）、還原條件下的SDS-PAGE圖譜（C）和Western boltting圖譜（D）及ELISA測定結果（E）

Fig. 3 Reduced SDS-PAGE (A) and Western blotting (B), non-reduced SDS-PAGE (C) and Western blotting (D), and ELISA results (E) of amandin in apricot kernels after hot-air drying (HAD) and natural drying (ND)

還原和非還原條件下，去皮、脫苦和干制后苦杏仁中amandin發(fā)生特異性抗原抗體反應的條帶沒有明顯改變，但免疫條帶強度有明顯差異，從左至右總體呈現(xiàn)灰度逐漸降低的趨勢。根據(jù)灰度分析結果，非還原條件下，飽和熱空氣去皮后amandin的免疫條帶灰度值降低了37.5%，超聲脫苦后其免疫條帶灰度值又降低了23.04%，經熱風干燥和自然干燥后其免疫條帶相對灰度值分別又降低14.75%和1.85%；還原條件下，飽和熱空氣去皮后amandin免疫條帶的相對灰度值降低了19.49%，超聲快速脫苦后其相對灰度值又降低了12.98%，熱風干燥和自然干燥后其相對灰度值又分別降低44.52%、35.09%（圖3-B）。間接ELISA測定結果見圖3-E，飽和熱空氣去皮后苦杏仁中的amandin免疫反應性顯著降低了5.79%，超聲脫苦后又使其顯著降低12.04%，自然干燥對其免疫反應性沒有顯著影響，而熱風干燥使其免疫反應性顯著上升2.81%（＜0.05），但干制后苦杏仁中的amandin的免疫反應性都顯著低于未處理苦杏仁中的amandin（＜0.05）。Western blotting和間接ELISA測定結果并不完全一致。

2.2 加工對amandin結構的影響

如圖4-A所示，去皮和脫苦加工使amandin的圓二色譜負峰減弱，而干制后負峰顯著增強，說明加工過程在一定程度上改變了致敏蛋白質結構。由致敏蛋白質的二級結構含量變化發(fā)現(xiàn)（圖4-B），去皮和脫苦加工對蛋白質中-螺旋結構和-折疊結構的含量沒有顯著影響，但使-轉角含量顯著提高，無規(guī)則卷曲含量顯著降低。飽和熱空氣去皮和超聲快速脫苦后蛋白質的外源熒光強度均顯著增強（圖4-C）。熱風干制使amandin二級結構發(fā)生了顯著變化，外源熒光強度減弱，表面疏水性顯著降低（＜0.05），與外源熒光光譜測定結果的趨勢一致（圖4-D）。Zeta電位測定結果顯示，SHAP、UAD和HAD的電位絕對值都顯著降低（圖4-E）。

圖4 苦杏仁去皮、脫苦、干制加工對amandin圓二色譜（A），二級結構組成（B），外源熒光光譜（C），表面疏水性（D）和Zeta電位（E）的影響

2.3 加工對amandin消化穩(wěn)定性的影響

胃消化開始時，UA蛋白條帶主要分布于25—75 kDa；在胃消化液作用5 min后，25—75 kDa的蛋白條帶降解為分子量低于17 kDa的蛋白條帶，且隨消化作用時間延長，低分子條帶逐漸增強；胃消化30 min后，幾乎全部降解為低分子量條帶。HAD在與胃消化液混合后迅速降解為分子量低于17 kDa的條帶，且隨腸消化作用時間延長，這些低分子量條帶繼續(xù)降解而逐漸減弱。UA在經胃消化60 min后仍能引起特異性抗原抗體反應，且免疫條帶的強度隨消化時間的延長逐漸減弱，而HAD的免疫條帶僅出現(xiàn)在胃消化過程的0—10 min，且其灰度明顯低于UA的免疫條帶灰度（圖5）。

圖5 消化液的SDS-PAGE圖譜（A）、未加工苦杏仁中amandin（UA）消化產物的SDS-PAGE圖譜（B）及Western blotting圖譜（C）、加工后苦杏仁中amandin（HAD）消化產物的SDS-PAGE圖譜（D）及Western blotting圖譜（E）

3 討論

3.1 苦杏仁去皮方法的對比分析

去皮是苦杏仁加工過程中的第一道工序，是為了避免在加工過程中苦杏仁種皮對產品色澤和品質產生不良影響。苦杏仁皮占苦杏仁干重的2%—5%[26]，富含多酚類化合物、黑色素和苦杏仁苷等功能性成分，還含有大量膳食纖維、半纖維素、木質素等功能性膳食纖維。熱燙去皮是現(xiàn)階段苦杏仁去皮加工的常用方法，其操作簡單、成本低，但該方法也存在水資源浪費、能耗大且耗時長等缺點[27]。且在處理過程中，苦杏仁皮中的功能性成分會隨去皮水一并作為加工廢料被工廠大量排出，去皮水中有機物含量超標，引起資源浪費和環(huán)境污染。飽和熱空氣去皮是一種綠色去皮方法，此方法能耗小、耗時短、排污少，能解決傳統(tǒng)去皮方法造成的苦杏仁加工過程中資源浪費和環(huán)境污染等問題。

本研究結果顯示，amandin的電泳條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，可能是高溫使蛋白質結構部分降解所造成。飽和熱空氣去皮是利用苦杏仁皮受熱脹裂而達到去皮效果，溫度相對較低，不易使蛋白質結構發(fā)生變化；而熱燙去皮溫度高達100 ℃，足以使蛋白質發(fā)生變性，導致結構改變[14]。去皮加工過程中，amandin存在于苦杏仁內部，受苦杏仁皮和組織的保護，因此凝膠電泳圖譜上SHAP和BIBW的主要特征條帶沒有改變。這與Zhao等[20]的研究結果相似，熱加工使蝦提取蛋白的高分子量條帶消失，降解為低分子量條帶。蒸煮過程中，蛋白質易受熱變性，導致空間結構改變[28]，蛋白高級結構解聚，與致敏性相關的抗原表位被破壞或掩蓋，從而影響其IgE結合能力，使致敏蛋白的免疫反應性降低[29]。這與熱加工對致敏蛋白免疫反應性影響的相關研究結果基本一致[29-30]。綜上，采用飽和熱空氣去皮和熱燙去皮方法對苦杏仁進行加工后，amandin的免疫反應性都顯著降低，且熱燙去皮處理使其免疫反應性降低更為顯著。與熱燙去皮相比，飽和熱空氣去皮減少了苦杏仁苷隨脫苦水的流失，且顯著影響-葡萄糖苷酶的活性，蛋白質和還原糖的損失均減小[14]。

綜合去皮加工成本對苦杏仁品質、苦杏仁致敏性以及環(huán)境污染的影響考慮，選擇飽和熱空氣去皮，可以縮短加工時間、降低加工成本，也能顯著降低苦杏仁的致敏性。

3.2 苦杏仁脫苦方法的對比分析

苦杏仁在經飽和熱空氣去皮后，再進行脫苦處理?？嘈尤受帐强嘈尤士辔兜闹饕獊碓?，其本身無毒，但在-葡萄糖苷酶的作用下會分解產生苯甲醛和氫氰酸，氫氰酸為劇毒物質；一次性大量食用未脫苦的苦杏仁會導致嚴重的中毒癥狀甚至死亡。因此，苦杏仁的脫苦是開展苦杏仁深加工前的關鍵工藝技術[17]。熱水脫苦是常用的傳統(tǒng)脫苦方法，從其操作參數(shù)可知，該方法操作簡單，但耗時長且需要大量的水、品質損耗大[26]，苦杏仁中46種揮發(fā)性風味物質在經熱水脫苦后僅可檢出12種，苦杏仁風味和營養(yǎng)價值極大降低[17]。針對苦杏仁傳統(tǒng)脫苦過程中的能源和資源浪費問題，筆者課題組發(fā)明了基于超聲誘導苦杏仁快速脫苦的方法；該方法大幅縮短了脫苦時間，大量減少了廢水的排放和能源資源浪費[16]。由于超聲快速脫苦縮短了苦杏仁在水中浸泡的時間，且水浴所需溫度更低，可顯著減少苦杏仁中可溶性營養(yǎng)成分的流失。

根據(jù)SDS-PAGE結果顯示，超聲處理和長時間的熱處理可能使部分蛋白質亞基聚集，形成高分子量蛋白亞基結構。熱處理可以使蛋白質分子變性，發(fā)生聚集，分子量變大。楊春華等[31]在研究熱加工對豆?jié){中蛋白質的影響時也得到相似結果。而超聲空化引起的動力剪切和湍流作用既能使蛋白質原有結構崩解，又能使崩解的基團之間相互作用重組成亞聚集體，從而使蛋白質分子量增大[24]。熱水脫苦過程中影響amandin免疫反應性的主要因素是溫度，較高的溫度可以通過改變蛋白質的構象表位，使其免疫反應性發(fā)生改變，而對線性表位的影響不大[32]。但在飽和熱空氣去皮過程中，部分在高溫下易發(fā)生改變的蛋白質結構及其組成的構象表位已經被破壞，于是長時間的熱水脫苦未能顯著改變amandian的免疫反應性。而超聲快速脫苦后amandin的免疫反應性顯著降低，可能的原因是超聲空化效應使蛋白質原有結構崩解，進而形成新的聚集結構[24]，致使其抗原表位改變甚至破壞[33]，從而導致其免疫反應性降低[34]。馬濤等[35]也報道過類似結論，即超聲處理改變三文魚小清蛋白質結構，繼而降低其致敏性。還有研究表明，超聲處理可以修飾蛋白質結構，從而改變蛋白質的一些特定IgG識別的構象表位，進而影響蛋白質的免疫反應性[36]。去皮苦杏仁經熱水脫苦后其中amandin的免疫反應性沒有顯著變化，而超聲快速脫苦使amandin的免疫反應性顯著降低。

因此，綜合脫苦加工成本以及對苦杏仁品質和免疫反應性的影響考慮，選擇超聲快速脫苦方法，既可以高效完成脫苦，還能達到降低苦杏仁致敏性的目的。

3.3 苦杏仁干制方法的對比分析

脫苦后苦杏仁要進行干制處理，以延長其保質期和后續(xù)產品開發(fā)，干制后得到苦杏仁的初級加工產品，即光中杏仁（商品化脫苦杏仁）。

研究結果顯示，Western blotting和間接ELISA試驗檢測干制方法對amandin免疫反應性影響的結果并不完全一致，可能原因是蛋白質的致敏性與其抗原決定簇相關，抗原決定簇又稱表位，包括線性表位和構象表位[37]。在進行SDS-PAGE凝膠電泳時，蛋白質經過煮沸處理以及受還原性上樣緩沖液的作用發(fā)生變性，導致其構象表位破壞，因此Western blotting測定免疫反應性時主要識別的是蛋白質的線性表位和部分構象表位，而ELISA分析時使用的是未變性的致敏蛋白，抗體既能識別其線性表位也能識別其構象表位。因此，Wstern blotting和ELISA測定結果可能呈現(xiàn)差異。Western blotting檢測主要是對致敏蛋白條帶定性，確定致敏蛋白條帶的分子量，只能半定量且靈敏度遠低于ELISA。

根據(jù)SDS-PAGE、Western-blotting和ELISA結果綜合分析，在自然干燥和熱風干燥過程中amandin的蛋白質亞基組成沒有顯著變化。amandin在熱風干燥過程中免疫反應性增強可能的原因是：一方面，高溫干制過程中蛋白質可能發(fā)生熱變性，空間結構改變[18]，導致線性表位被掩蓋而部分構象表位暴露，最終致使免疫反應性增強[38]；另一方面，熱風干燥過程中致敏蛋白可能與糖類發(fā)生美拉德反應，形成糖基化修飾或交聯(lián)物，從而改變蛋白質結構，影響抗原表位的識別，導致致敏蛋白的免疫反應性發(fā)生改變[39]。有研究表明美拉德反應增強了花生致敏蛋白的免疫反應性[40]，與熱風干制對苦杏仁致敏蛋白免疫反應性的影響結果一致。熱風干燥后苦杏仁中amandin的免疫反應性略低于自然干燥的苦杏仁，兩種干制方法對amandin免疫反應性的影響沒有顯著性差異。自然干燥操作簡單、成本低，但干制時間長。自然干燥所得產品色澤雖較暗但沒有明顯褐變，風味物質有散失而對苦杏仁中營養(yǎng)物質也沒有顯著影響，缺點是干制過程中易受細菌和霉菌污染[41]。熱風干燥技術以熱空氣為介質與食品進行濕熱交換，同時由于物料表面水分被汽化，物料表面與內部產生水分濃度差，從而使內部水分向外表面逐漸擴散[42]。該干制技術生產效率高，在農副產品中被廣泛運用，但所得產品色澤和營養(yǎng)損失大[18]。

綜合以上因素，選擇熱風干燥方法對苦杏仁進行加工，雖不可避免苦杏仁發(fā)生褐變，但生產效率高、成本低，適用于工廠化加工。

3.4 加工對苦杏仁中amandin結構影響的分析

圓二色譜在222 nm和208 nm處出現(xiàn)負峰，表明苦杏仁致敏蛋白中-螺旋結構的存在，在216 nm出現(xiàn)負峰，表明致敏蛋白含有-折疊結構[6]。研究結果顯示無規(guī)卷曲含量降低，說明加工處理使蛋白質中原有特定無規(guī)律肽段構象破壞[43]，蛋白質結構相對松散，部分展開。其可能原因是飽和熱空氣去皮時的熱處理使水溶性蛋白分子結構展開，暴露出更多的疏水基團[44]，超聲快速脫苦時，超聲空化作用也會使蛋白質疏水區(qū)域展開，導致疏水基團暴露于極性環(huán)境中[45]。外源熒光光譜和表面疏水性測定結果也得出一致結論。外源熒光光譜可以反映蛋白質的三級結構變化情況，說明去皮和脫苦加工使amandin表面暴露出更多的疏水基團與ANS結合，在激發(fā)光作用下發(fā)射熒光[24]。蛋白質表面暴露的疏水基團越多，則表面疏水性越強[46]，本研究的表面疏水性測定結果進一步確證了這一結論。熱風干制使苦杏仁中水分含量降低的同時可能使蛋白質分子加熱變性、巰基氧化、水分子-蛋白質分子間氫鍵變化，造成了蛋白質原有二級結構和空間構象的破壞。Zeta電位測定結果顯示蛋白質分子穩(wěn)定性降低，蛋白質分子間的靜電排斥作用減弱，可能導致蛋白質分子間的聚集狀態(tài)發(fā)生改變[21,47]。

綜上，苦杏仁去皮、脫苦和干制加工影響了amandin的二級及三級結構組成，改變了蛋白質分子的聚集狀態(tài)以及蛋白質分子間的相互作用，進而可能導致構象表位的破壞、掩蓋或暴露以及線性表位的掩蓋或暴露，最終導致amandin免疫反應性的減弱或增強。

3.5 加工對苦杏仁中amandin消化穩(wěn)定性影響的分析

amandin在經消化系統(tǒng)進入免疫系統(tǒng)后，與其抗原性相關的蛋白或蛋白片段結構若能仍然保持足夠完整則能引起過敏反應[48]。在利用體外靜態(tài)模擬消化試驗評估其消化穩(wěn)定性時，基于食物在人胃和腸消化系統(tǒng)中滯留的時間分別為1 h和4 h[49]，本研究中體外靜態(tài)模擬胃消化和腸消化的最大取樣時間分別設置為60 min和120 min。研究結果顯示，HAD比UA更易在胃消化過程中降解。觀察腸消化過程的凝膠電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，除消化液本身的蛋白條帶外無明顯蛋白條帶，可能是由于UA和HAD在腸消化液的作用下迅速徹底降解，低分子量的蛋白條帶徹底降解為分子量很小的肽段和氨基酸。這與李英英等[50]在研究大豆球蛋白的體外消化穩(wěn)定性時的報道結果相一致。Western blotting圖譜顯示在消化液的作用下，與致敏蛋白抗原性相關的蛋白質結構逐漸降解，免疫反應性逐漸減弱；UA的抗原決定簇結構比HAD的更穩(wěn)定，能耐受更長的消化時間，其潛在致敏性更強，更易在人體內引起過敏反應。經飽和熱空氣去皮、超聲快速脫苦和熱風干制后，苦杏仁中amandin的消化穩(wěn)定性降低，其抗原表位在消化過程中降解速度加快，經胃消化后幾乎不能引起免疫反應，苦杏仁的致敏性極大降低。

4 結論

不同加工方法對苦杏仁致敏蛋白amandin的免疫反應性均有一定影響，其中飽和熱空氣去皮和超聲快速脫苦使amandin免疫反應性降低效果最顯著。采用飽和熱空氣去皮、超聲快速脫苦和熱風干制加工后的苦杏仁致敏性顯著降低15.03%。amandin免疫反應性改變是由加工處理導致其蛋白質結構變化造成，其中超聲快速脫苦導致的結構變化最明顯。此外，加工處理還會導致苦杏仁中amandin消化穩(wěn)定性的降低，與致敏性相關的抗原結構更易在消化過程中降解，致使苦杏仁潛在致敏性進一步降低。因此，在苦杏仁加工過程中，可以通過優(yōu)化加工方法來降低苦杏仁的致敏性。

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Effects of Processing Technology on the Amandin Immunoreactivity and Digestive Stability of Apricot Kernel

LONG FeiFei1, ZHANG QingAn1, ZHANG ZhiHua1, 2

1School of Food Engineering and Nutrition Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119;2Inner Mongolian GaoYuan Apricot Kernels Juice Co., Ltd, Zhungeer County 017100, Inner Mongolia

【Background】In recent years, allergies have become a global health concern, and the number of allergic individuals continues to rise. Nut is one of the common origins of allergies, and apricot kernels, as a common nut containing the allergenic protein amandin, have become one of the most susceptible nuts to allergies. Therefore, allergy removal of nuts has become a research hotspot. The processing of apricot kernels generally involves procedures, such as peeling, debitterizing and drying, and there are no relevant reports on whether their allergenicity will be affected during these processing. 【Objective】The aim of this study was to explore the impact of processing on the allergenicity with the allergenicity, quality and nutritional characteristics of apricot kernels as the evaluation indicators, and to optimize the processing for reducing the allergenicity of apricot kernels, thus providing the theoretical basis and technical support for the processing of low allergenic nuts products of apricot kernels.【Method】Firstly, the methods of Western blotting and ELISA were used to investigate the effects of different peeling, debitterizing and drying methods on the amandin immunoreactivity in apricot kernels. Then, the circular dichroism spectroscopy, extrinsic fluorescence spectroscopy, surface hydrophobicity and zeta potential measurements were used to study the effects of various processing methods on the structure and surface properties of amandin, and to analyze the mechanism of the immune-reactivity changes of amandin. Finally, the vitro simulation digestion experiments were conducted to investigate the digestive stability of amandin in apricot kernels before and after processing, and Western blotting analysis was conducted on the digestion products to further explore the changes in potential allergenicity of apricot kernels.【Result】In terms of allergenicity, the amandin’s immunoreactivity after being peeled by the saturated hot air and blanched decreased by 8.41% and 13.15%, respectively. After being quickly debitterized by ultrasound, the amandin’s immunoreactivity decreased by 6.79%. Blanching debitterizing had no significant effects on its immunoreactivity. After natural drying and hot air drying, the immune reactivity of the amandin significantly increased by 4.58% and 2.81%, respectively (＜0.05). Based on the impact of processing on the quality and nutritional characteristics of apricot kernels, those suitable processing methods to decrease the allergenicity of apricot kernels were optimized like the saturated hot air peeling, ultrasonic rapid debitterizing and hot air drying, and the immune reactivity of apricot kernels decreased by 15.03% under the optimal conditions. In terms of the structure of amandin, the secondary structure composition, tertiary structure, surface hydrophobicity and zeta potential have undergone certain changes during the processing. Among them, the ultrasound rapid debitterizing significantly changed the tertiary structure of amandin and enhanced its surface hydrophobicity (＜0.05), resulting in the most significant decrease in its immune reactivity. The digestive stability of the amandin after processing was significantly reduced, and the accelerated degradation rate of structures was related to the specific antigen antibody reactions in allergenic proteins, leading to a further decrease in the potential allergenicity of apricot kernels.【Conclusion】Different processing steps could affect the allergenicity of apricot kernels by changing the structure of amandin, i.e. the reasonable processing methods could be used to reduce the allergenicity of apricot kernels.

apricot kernel; amandin; processing; immunoreactivity; digestive stability

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.011

2023-05-23；

2023-09-28

陜西省2021年度重點研發(fā)計劃農業(yè)領域一般項目（2021NY-163）、鄂爾多斯市科技局2022年度科技重大專項（2022EEDSKJZDZX022）、西安市科技局科技創(chuàng)新人才服務企業(yè)項目（2020KJRC0011）、中央高校基本科研業(yè)務費專項資金重點項目（GK202102009）

龍斐斐，E-mail：longfeifei334@163.com。通信作者張清安，Tel：13572932273；E-mail：qinganzhang@snnu.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）