陳二虎，袁國慶，孫晟源，唐培安

環(huán)境脅迫對銹赤扁谷盜呼吸速率及線粒體編碼基因表達(dá)水平的影響

陳二虎，袁國慶，孫晟源，唐培安

南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

【背景】線粒體是生物體內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞消耗氧和產(chǎn)生能量物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，在生物體抵抗逆境過程中發(fā)揮重要作用。銹赤扁谷盜（）是一種世界性儲糧害蟲，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性?！灸康摹糠治鲣P赤扁谷盜呼吸速率及線粒體編碼基因?qū)Σ煌h(huán)境脅迫的響應(yīng)，探究線粒體在銹赤扁谷盜抗逆境脅迫中的應(yīng)激反應(yīng)?！痉椒ā扛鶕?jù)銹赤扁谷盜線粒體基因組數(shù)據(jù)鑒定獲得線粒體編碼基因，并設(shè)計(jì)相應(yīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物。通過生物測定方法得出銹赤扁谷盜對熏蒸劑（甲酸乙酯）、植物源殺蟲劑（魚藤酮）和儲糧保護(hù)劑（阿維菌素）的毒力回歸方程及LC30，并用該濃度對試蟲進(jìn)行后續(xù)藥劑脅迫處理。利用RT-qPCR技術(shù)解析銹赤扁谷盜線粒體編碼基因的時(shí)空（不同發(fā)育階段和幼蟲不同組織）表達(dá)模式。最后，使用CO2檢測儀和RT-qPCR技術(shù)研究銹赤扁谷盜在高溫（35和40 ℃）、甲酸乙酯、魚藤酮、阿維菌素、饑餓等逆境脅迫下呼吸速率的變化以及線粒體編碼基因的表達(dá)模式。【結(jié)果】共設(shè)計(jì)12個(gè)線粒體編碼基因（除）的定量引物。RT-qPCR結(jié)果顯示這些線粒體編碼基因在3齡幼蟲階段均具有較高表達(dá)水平，且線粒體基因在3齡幼蟲馬氏管中特異性高表達(dá)。此外，高溫脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率呈現(xiàn)顯著上升趨勢，線粒體編碼基因及表達(dá)水平顯著上升，而及則呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢。甲酸乙酯熏蒸脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率顯著降低，12個(gè)線粒體編碼基因均顯著下調(diào)表達(dá)，其中和的表達(dá)水平僅為對照組的3.48%和1.91%。魚藤酮和阿維菌素脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率均顯著降低，且除外的線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著下調(diào)。饑餓脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率顯著降低，且隨著脅迫時(shí)間增加，線粒體編碼基因表達(dá)水平下調(diào)愈加顯著?！窘Y(jié)論】銹赤扁谷盜呼吸代謝速率以及線粒體編碼基因表達(dá)水平在不同逆境條件下均發(fā)生顯著變化，暗示線粒體在銹赤扁谷盜適應(yīng)高溫、藥劑和饑餓脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

銹赤扁谷盜；環(huán)境脅迫；呼吸速率；線粒體編碼基因

0 引言

【研究意義】銹赤扁谷盜（）是一種世界性儲糧害蟲，主要分布于溫帶和熱帶地區(qū)，在農(nóng)產(chǎn)品儲運(yùn)過程中一旦局部發(fā)生便會造成重大經(jīng)濟(jì)損失，其危害范圍廣，成蟲和幼蟲均可對破碎或受損傷的原糧造成破壞，如稻谷、豆類、油料和麥類等農(nóng)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品[1-2]。線粒體作為獨(dú)立擁有遺傳信息的細(xì)胞器，其在昆蟲適應(yīng)環(huán)境變化的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3-6]。開展銹赤扁谷盜應(yīng)答逆境脅迫時(shí)呼吸速率變化以及線粒體編碼基因表達(dá)模式的研究，闡釋線粒體在銹赤扁谷盜抗逆反應(yīng)中的重要作用，可揭示試蟲在不同環(huán)境條件下暴發(fā)成災(zāi)的潛在分子機(jī)制，進(jìn)而為儲糧害蟲的防控提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)昆蟲處于逆境脅迫時(shí)，會通過多種機(jī)制來抵御外界環(huán)境對自身造成的不利影響[7]。例如熱激蛋白在生物體抵御高溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用[8]，同時(shí)體內(nèi)會合成大量的抗氧化酶來緩解高溫脅迫所造成的氧化壓力[9]。而昆蟲抗藥性機(jī)制與多個(gè)基因有關(guān)，包括多種解毒代謝酶如細(xì)胞色素P450[10]、谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶[11]等。線粒體是生物體物質(zhì)代謝的主要場所，線粒體會根據(jù)外界環(huán)境的變化迅速改變其氧化磷酸化過程、呼吸代謝水平與ATP（adenosine triphosphate）的生成速率[12-13]。呼吸速率是表征生命體代謝強(qiáng)度的重要參數(shù)，呼吸鏈由線粒體內(nèi)膜上5個(gè)線粒體復(fù)合體組成，其在能量代謝過程中進(jìn)行氧化磷酸化并產(chǎn)生ATP，且研究表明昆蟲可能通過控制呼吸鏈復(fù)合體關(guān)鍵基因的表達(dá)水平來控制其呼吸代謝水平[14-15]。昆蟲抵御高溫時(shí)，作為細(xì)胞能量工廠的線粒體會參與生命體的呼吸和抗氧化代謝，如高溫條件下龜紋瓢蟲（）的呼吸代謝強(qiáng)度顯著提高[16]。此外，高溫會提高昆蟲體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量，ROS含量的提高會對線粒體的功能造成影響，例如高溫下紅頭麗蠅（）的肌肉組織線粒體功能受到損傷[17]。研究表明，昆蟲還會通過調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)水平來應(yīng)對高溫脅迫，例如，灰飛虱（）的和均受到低溫選擇的影響[18]；三色書虱（）的線粒體編碼基因和在高溫脅迫下其表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明線粒體基因表達(dá)水平與昆蟲適應(yīng)高溫環(huán)境密切相關(guān)[19]。與高溫相比，線粒體更易受到藥劑脅迫的影響，會提高生物體ROS的含量，ROS對線粒體的損傷可導(dǎo)致氧化磷酸化功能的減弱，從而影響機(jī)體生命活動乃至壽命[20]，同時(shí)會對線粒體的形態(tài)和膜結(jié)構(gòu)造成影響[21]。線粒體抑制劑則會直接作用于電子呼吸鏈，例如埃及伊蚊（）在氨基腈（線粒體復(fù)合體Ⅰ抑制劑）脅迫下，琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶活性均上升，而過氧化氫酶被抑制，造成ROS的產(chǎn)生，最終因氧化脅迫而死亡[22]。熏蒸劑對昆蟲的線粒體復(fù)合體也會造成影響，玉米象（）的線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅳ會受到辣根素的顯著影響[23-24]。【本研究切入點(diǎn)】上述研究表明線粒體代謝強(qiáng)度隨外界環(huán)境變化的調(diào)節(jié)能力與該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力具有一定的相關(guān)性，包括溫度適應(yīng)性、抗藥性等[25-27]。而目前關(guān)于昆蟲抗逆性機(jī)制的研究主要集中在核編碼基因，有關(guān)昆蟲綱線粒體編碼基因的研究仍較為匱乏。【擬解決的關(guān)鍵問題】以我國儲糧發(fā)生危害嚴(yán)重的銹赤扁谷盜為研究對象，分析不同逆境脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率變化以及線粒體編碼基因響應(yīng)逆境脅迫的表達(dá)模式，解析昆蟲呼吸代謝反應(yīng)以及線粒體相關(guān)基因在銹赤扁谷盜適應(yīng)逆境脅迫過程中的作用。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年7月至2023年7月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院儲糧害蟲防治實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試?yán)ハx

供試銹赤扁谷盜采自湖南省岳陽市湘陰縣長康鎮(zhèn)長康油脂實(shí)業(yè)有限公司，并已在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧食儲運(yùn)國家工程實(shí)驗(yàn)室以人工飼料（全麥粉﹕酵母粉﹕小麥粒﹕燕麥碎=5﹕1﹕1﹕3）培養(yǎng)數(shù)代，培養(yǎng)期間未接觸任何藥劑。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（30±1）℃、相對濕度75%±5%、無光照。

1.2 生物信息學(xué)分析及線粒體編碼基因引物設(shè)計(jì)

依據(jù)銹赤扁谷盜完整的線粒體基因組（GenBank登錄號：MH475917）獲得13個(gè)線粒體編碼基因序列，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）的引物，由于無法設(shè)計(jì)出合格的定量引物，因此本文研究了除外的12個(gè)銹赤扁谷盜線粒體編碼基因，相關(guān)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。銹赤扁谷盜12個(gè)線粒體編碼基因的特異性RT-qPCR引物如表1所示，以和為內(nèi)參基因[28]。

1.3 銹赤扁谷盜對不同藥劑敏感性測定

甲酸乙酯（品牌：阿拉丁；純度：有效成分含量99%）：將羽化后兩周的銹赤扁谷盜成蟲放于容量為1 L的廣口瓶中，將不同濃度梯度甲酸乙酯滴在熏蒸盒底部的濾紙上，然后迅速用尼龍紗布將盒子包好，置于廣口瓶內(nèi)，蓋上瓶蓋，并用保鮮膜將瓶口密封。將廣口瓶置于30 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)全黑暗條件下進(jìn)行熏蒸，每個(gè)處理供試成蟲60頭，熏蒸6h后散氣，放入正常飼料中飼養(yǎng)24 h，并設(shè)空白對照。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，24 h后統(tǒng)計(jì)試蟲死亡率。

阿維菌素（品牌：索萊寶；純度：有效成分含量95%）和魚藤酮（品牌：阿拉??；純度：有效成分含量95%）：使用丙酮溶解并稀釋儲糧保護(hù)劑阿維菌素和植物源殺蟲劑魚藤酮，將濾紙平鋪在直徑為6cm的一次性塑料培養(yǎng)皿中，用移液槍吸取稀釋后的藥劑300 μl均勻滴加在一次性濾紙上，取60頭羽化后兩周的銹赤扁谷盜成蟲放在濾紙藥膜上，待試蟲自由爬行3min后，將試蟲取出，放入正常飼料中飼養(yǎng)24h，對照組用相同體積的丙酮處理，統(tǒng)計(jì)試蟲死亡率。

判斷試蟲死亡的標(biāo)準(zhǔn)是用小毛筆觸碰試蟲的軀體，如果試蟲不動，干癟，則視為試蟲死亡，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定5個(gè)濃度梯度，使試蟲死亡率范圍達(dá)到16%—84%。根據(jù)不同濃度梯度下試蟲校正死亡率，用SPSS 26.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算銹赤扁谷盜對甲酸乙酯、阿維菌素和魚藤酮的毒力回歸方程和LC30。

1.4 銹赤扁谷盜不同逆境脅迫的處理

高溫處理：隨機(jī)選取羽化后兩周的銹赤扁谷盜成蟲30頭，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱的溫度分別設(shè)置為30℃（正常飼養(yǎng)溫度）、35和40℃（高溫脅迫溫度），每個(gè)溫度處理時(shí)間分別為0、2、4、6、12、24、36及48h，相對濕度均設(shè)置為75%±5%。不同藥劑脅迫處理：根據(jù)1.3計(jì)算得到銹赤扁谷盜對不同藥劑（甲酸乙酯、阿維菌素和魚藤酮）的LC30，隨機(jī)選取羽化后兩周的銹赤扁谷盜成蟲30頭，并采取1.3描述的方法利用不同藥劑的LC30濃度對試蟲進(jìn)行藥劑脅迫處理。饑餓脅迫處理：隨機(jī)選取羽化后兩周的銹赤扁谷盜成蟲30頭，在無飼料的情況下置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為30℃，相對濕度設(shè)置為75%±5%，分別處理0、1、2和3 d，其中0 d為對照。

1.5 不同逆境脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率檢測

挑選不同逆境脅迫（高溫、藥劑和饑餓脅迫）下的銹赤扁谷盜10頭，置于50ml的玻璃蟲室中，塞緊塞子使之密閉，根據(jù)GB/T29890—2013《糧油儲藏技術(shù)規(guī)范》中的要求檢查氣密性，置于相應(yīng)的環(huán)境下使用便攜式CO2檢測儀（B1010，深圳市沃賽特科技有限公司）監(jiān)測密閉蟲室內(nèi)的CO2含量，試蟲放入氣室后需要10 min左右的時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定的呼吸狀態(tài)，待穩(wěn)定后每組生物學(xué)重復(fù)測量30 min，每隔3 min記錄一次數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。呼吸速率以每頭銹赤扁谷盜每分鐘釋放的CO2（μL·l-1·min-1）表示。

1.6 不同發(fā)育階段和組織線粒體編碼基因表達(dá)模式分析

選取同一批發(fā)育狀態(tài)良好的卵、1—4齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹（5日齡蛹）以及羽化兩周后的成蟲各30頭，選取完畢后的試蟲立即放入-80 ℃液氮中冷凍備用，每組樣本均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。此外，選取同一批發(fā)育狀態(tài)良好的3齡銹赤扁谷盜幼蟲120頭，分別解剖獲得表皮、腸道、脂肪體、馬氏管等不同組織，并于-80 ℃液氮中冷凍備用，且每個(gè)組織樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用Trizol法提取上述各樣品總RNA（RNA濃度為500—600 ng·μl-1），利用RQ1 RNase-Free DNase清除基因組DNA。通過核酸濃度測定儀進(jìn)行樣本RNA濃度和純度測定，同時(shí)使用瓊脂糖凝膠電泳對樣品RNA完整性進(jìn)行檢測。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技有限公司，中國）合成第一鏈cDNA，所獲得的目標(biāo)產(chǎn)物于-20 ℃冰箱中進(jìn)行保存，以備后續(xù)使用。采用ChamQTM SYBR? qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）712試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，對銹赤扁谷盜線粒體編碼基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析，試驗(yàn)中的每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)性重復(fù)，利用2-??Ct方法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析[29]。

1.7 線粒體編碼基因響應(yīng)不同逆境脅迫表達(dá)模式分析

挑選不同逆境脅迫（高溫、藥劑和饑餓脅迫）下的銹赤扁谷盜試蟲，參照1.6的方法對不同逆境脅迫處理的昆蟲樣品進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR以及定量數(shù)據(jù)分析，計(jì)算獲得線粒體編碼基因響應(yīng)不同逆境脅迫的表達(dá)模式，且每組樣本均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Origin 2021作圖，SPSS 26.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，高溫和饑餓脅迫下的呼吸速率和基因相對表達(dá)量采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行均值多重比較，并利用圖基檢驗(yàn)法（Tukey’s test）進(jìn)行顯著性分析（＜0.05）。藥劑脅迫下的呼吸速率和線粒體編碼基因表達(dá)水平采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 銹赤扁谷盜對不同藥劑的敏感性

采用熏蒸劑甲酸乙酯、植物源殺蟲劑魚藤酮和儲糧保護(hù)劑阿維菌素對銹赤扁谷盜進(jìn)行藥劑脅迫（LC30）處理，銹赤扁谷盜對上述3種藥劑的敏感性測定結(jié)果如表2所示，LC30分別為8.3μL·l-1（甲酸乙酯）、1 696.7 mg·l-1（魚藤酮）和2.6 mg·l-1（阿維菌素）。

表2 銹赤扁谷盜對不同殺蟲劑的敏感性

2.2 銹赤扁谷盜線粒體編碼基因不同發(fā)育階段和組織表達(dá)模式

銹赤扁谷盜線粒體編碼基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式如圖1所示，12個(gè)線粒體基因在試蟲不同發(fā)育階段均有所表達(dá)，其中在3齡幼蟲時(shí)期均具有較高表達(dá)水平，而在4齡幼蟲及預(yù)蛹階段表達(dá)量處于較低水平。

由于線粒體基因均在銹赤扁谷盜3齡幼蟲階段呈現(xiàn)較高表達(dá)水平，因此進(jìn)一步解析了上述基因在該發(fā)育階段不同組織的表達(dá)模式。如圖2所示，線粒體基因在銹赤扁谷盜3齡幼蟲的不同組織均有所表達(dá)，其中在幼蟲脂肪體和表皮組織中表達(dá)水平較低，且除外，11個(gè)線粒體編碼基因均在幼蟲馬氏管中顯著高表達(dá)。

2.3 銹赤扁谷盜響應(yīng)高溫脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

30℃（正常飼養(yǎng)溫度）條件下，銹赤扁谷盜呼吸速率和線粒體編碼基因處于穩(wěn)定狀態(tài)（圖3-A、3-B）。高溫脅迫下，銹赤扁谷盜呼吸速率處于逐漸上升的趨勢（圖3-A），在持續(xù)脅迫48 h過程中，和未出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)（≥0.05），及的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增加呈顯著性上調(diào)趨勢，而及的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增加呈顯著性下調(diào)趨勢（＜0.05）（圖3-C、3-D），且上述基因在高溫脅迫下具有時(shí)間效應(yīng)。

線粒體基因表達(dá)水平用熱圖進(jìn)行表示，紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)The expression levels of mitochondrial protein-coding genes are represented as a heat map with red indicating high expression and blue indicating low expression。圖2同The same as Fig. 2

圖2 銹赤扁谷盜線粒體編碼基因幼蟲不同組織表達(dá)模式

2.4 銹赤扁谷盜響應(yīng)熏蒸劑甲酸乙酯脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

銹赤扁谷盜經(jīng)甲酸乙酯脅迫后呼吸速率顯著降低（＜0.001）（圖4-A）；甲酸乙酯脅迫下，除外的11個(gè)線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著下調(diào)（＜0.05），和表達(dá)量下調(diào)最為顯著（＜0.001），尤其是和，表達(dá)量僅為對照組的3.48%和1.91%（圖4-B）。

2.5 銹赤扁谷盜響應(yīng)魚藤酮和阿維菌素脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

魚藤酮和阿維菌素脅迫下銹赤扁谷盜呼吸速率均顯著降低（＜0.001）（圖5-A、5-B）。魚藤酮脅迫下，12個(gè)線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著下調(diào)（＜0.05），其中及表達(dá)量下調(diào)更為顯著（＜0.001）（圖5-C），僅為對照組（丙酮處理）的40.81%、39.36%、43.00%、37.79%和51.16%。阿維菌素脅迫下，除外，其他11個(gè)線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著下調(diào)（＜0.05），其中和表達(dá)量下調(diào)更為顯著（＜0.01）（圖5-D）。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，差異顯著性分析采用獨(dú)立樣本t-test Data are mean±SD, and independent sample t test was used to analyze the significance of the difference (* P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001)。圖5同The same as Fig. 5

2.6 銹赤扁谷盜響應(yīng)饑餓脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

銹赤扁谷盜的呼吸速率隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)降低趨勢（圖6-A）。12個(gè)線粒體編碼基因的表達(dá)量同時(shí)隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，其中在饑餓脅迫2 d后顯著下調(diào)，在饑餓脅迫3 d后顯著下調(diào)，其余10個(gè)線粒體編碼基因均在饑餓脅迫1 d后顯著下調(diào)（＜0.05）（圖6-B）。

3 討論

3.1 銹赤扁谷盜線粒體編碼基因具有發(fā)育階段和組織表達(dá)特異性

昆蟲線粒體編碼基因具有時(shí)空表達(dá)模式的特異性[14]。類似地，本研究發(fā)現(xiàn)銹赤扁谷盜12個(gè)線粒體編碼基因在3齡幼蟲中相對高表達(dá)（圖1），暗示其在3齡幼蟲時(shí)期的發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。3齡幼蟲可能通過上調(diào)線粒體編碼基因表達(dá)水平響應(yīng)代謝需求的提升，如埃及伊蚊（）的線粒體編碼基因的表達(dá)量在其1、2齡達(dá)到峰值，從而保證其正常生長發(fā)育[30]。在4齡幼蟲和預(yù)蛹時(shí)期線粒體編碼基因相對低表達(dá)，相關(guān)研究證明線粒體是蛻皮激素的靶標(biāo)位點(diǎn)，而該階段正是銹赤扁谷盜幼蟲蛻皮與蛹期形成的過渡階段，試蟲蛻皮激素含量提升，進(jìn)而抑制線粒體基因的表達(dá)[31]。王磊研究表明線粒體編碼基因在橘小實(shí)蠅（）中腸和脂肪體組織中顯著高表達(dá)[14]，本研究發(fā)現(xiàn)除外的11個(gè)線粒體編碼基因在幼蟲馬氏管中高表達(dá)。馬氏管是昆蟲的主要排泄器官[32]，且與中腸和脂肪體共同組成昆蟲的代謝中心，承擔(dān)著昆蟲解毒代謝反應(yīng)，根據(jù)線粒體編碼基因的組織特異性，推測線粒體可能對昆蟲解毒代謝反應(yīng)過程中的能量供應(yīng)發(fā)揮重要作用。

3.2 銹赤扁谷盜響應(yīng)高溫脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

線粒體在昆蟲抵御溫度脅迫中發(fā)揮重要作用，昆蟲通常會通過呼吸代謝和抗氧化代謝兩種機(jī)制來適應(yīng)極端溫度脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下試蟲呼吸速率顯著變化（圖3-A），表明高溫環(huán)境對銹赤扁谷盜呼吸代謝反應(yīng)造成巨大影響，其呼吸速率不斷升高，暗示銹赤扁谷盜體內(nèi)代謝水平處于逐漸上升狀態(tài)。類似地，研究發(fā)現(xiàn)亞洲小車蝗（）[33]、點(diǎn)蜂緣蝽（）[34]、西伯利亞蝗（）[35]等昆蟲在不同溫度脅迫下，呼吸代謝相關(guān)酶活性發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步證實(shí)了昆蟲可通過調(diào)整其呼吸代謝強(qiáng)度來提高自身對高溫環(huán)境的適應(yīng)性。同時(shí)，高溫脅迫對線粒體編碼基因表達(dá)水平影響顯著，高溫處理下和表達(dá)量顯著上調(diào)（圖3），這與昆蟲應(yīng)對高溫脅迫時(shí)其不斷增加的呼吸代謝水平和能量需求相吻合。然而，本研究同樣發(fā)現(xiàn)及均隨高溫持續(xù)脅迫其表達(dá)量顯著下調(diào)（圖3）。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，也是ROS的主要生產(chǎn)場所[36]，高溫條件下線粒體產(chǎn)生更多的能量以滿足自身需求，同樣會產(chǎn)生更多的ROS，ROS的積累會引起機(jī)體氧化應(yīng)激甚至死亡。和是NADH氧化還原酶即線粒體復(fù)合體Ⅰ的關(guān)鍵基因，是細(xì)胞色素C氧化酶即線粒體復(fù)合體Ⅳ的重要基因，則是ATP合成酶即線粒體復(fù)合體Ⅴ的關(guān)鍵基因，進(jìn)而推測銹赤扁谷盜可能通過降低線粒體復(fù)合體關(guān)鍵基因的表達(dá)以減少由于高溫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)試蟲的高溫適應(yīng)能力。如在40 ℃脅迫下，橘小實(shí)蠅通過下調(diào)線粒體編碼基因和的表達(dá)量以抵御氧化應(yīng)激[14]。

A：魚藤酮脅迫下呼吸速率的變化the changes of respiratory rate under rotenone stress；B：阿維菌素脅迫下呼吸速率變化the changes of respiratory rate under avermectin stress；C：魚藤酮脅迫下線粒體編碼基因相對表達(dá)量變化The relative expression changes of mitochondrial protein-coding genes under rotenone stress；D：阿維菌素脅迫下線粒體編碼基因相對表達(dá)量變化The relative expression changes of mitochondrial protein-coding genes under avermectin stress

A：饑餓脅迫下呼吸速率變化The changes of respiratory rate under starvation stress；B：饑餓脅迫下線粒體編碼基因相對表達(dá)量變化The relative expression changes of mitochondrial protein-coding genes under starvation stress

3.3 銹赤扁谷盜響應(yīng)藥劑脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

目前，由于儲糧行業(yè)對傳統(tǒng)熏蒸劑磷化氫的長期過度使用，儲糧害蟲已對其產(chǎn)生較高抗性，嚴(yán)重影響儲糧行業(yè)的健康發(fā)展[37-39]。本研究生測結(jié)果顯示，甲酸乙酯對銹赤扁谷盜具有較好的熏蒸殺蟲效果，表明其在儲糧害蟲防治方面具有較大的應(yīng)用潛力。陳艷研究發(fā)現(xiàn)，磷化氫處理后銹赤扁谷盜呼吸速率與線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著下調(diào)[40]，本研究與之結(jié)果一致，甲酸乙酯脅迫處理后試蟲呼吸速率顯著降低且伴隨線粒體編碼基因表達(dá)量顯著下降（圖4）。據(jù)此推測，銹赤扁谷盜面對不同熏蒸劑時(shí)表現(xiàn)出相同的響應(yīng)機(jī)制，一方面熏蒸劑磷化氫和甲酸乙酯均主要利用昆蟲呼吸作用進(jìn)入蟲體內(nèi)，當(dāng)銹赤扁谷盜處于藥劑熏蒸環(huán)境時(shí)，可通過調(diào)節(jié)線粒體和呼吸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，降低呼吸速率，減少熏蒸劑的吸收，進(jìn)而適應(yīng)熏蒸脅迫的逆境[41]；另一方面，推斷線粒體呼吸鏈可能是熏蒸劑的靶標(biāo)系統(tǒng)，熏蒸脅迫會造成該系統(tǒng)的崩潰，產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)而抑制線粒體相關(guān)功能，進(jìn)而降低呼吸速率和線粒體基因表達(dá)水平。

魚藤酮廣泛分布于魚藤屬植物的根皮部，是一種植物源殺蟲劑，該藥劑脅迫下，銹赤扁谷盜呼吸速率和線粒體編碼基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢（圖5-A、5-C）。其中及的表達(dá)量顯著下調(diào)，上述基因是NADH氧化還原酶即線粒體復(fù)合體Ⅰ的基因。且已有研究表明魚藤酮作用靶標(biāo)為線粒體復(fù)合體Ⅰ，通過促進(jìn)線粒體活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，如魚藤酮使大鼠線粒體內(nèi)ATP合成能力減弱，線粒體內(nèi)ATP酶活性降低，并誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[42]。魚藤酮脅迫導(dǎo)致豬的活性線粒體與總線粒體的比例降低，增加了ROS的產(chǎn)生，并減少了ATP的產(chǎn)生[43]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)線粒體ATP合成酶的基因和的表達(dá)量顯著下調(diào)，表明試蟲ATP含量可能會降低，從而進(jìn)一步增強(qiáng)線粒體氧化損傷程度。

儲糧保護(hù)劑阿維菌素是一種具有較高毒性的天然產(chǎn)物[44]，由表2可見低濃度阿維菌素即可對銹赤扁谷盜產(chǎn)生致死作用。阿維菌素是一種神經(jīng)毒素，對昆蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)具有抑制作用，本研究發(fā)現(xiàn)在該藥劑脅迫下，銹赤扁谷盜呼吸速率和線粒體編碼基因表達(dá)量均顯著降低（圖5-B、5-D），暗示試蟲體內(nèi)氧化代謝水平被顯著抑制。氟蟲腈與阿維菌素均為神經(jīng)毒素類殺蟲劑，研究發(fā)現(xiàn)氟蟲腈會抑制大鼠的氧消耗率、線粒體自噬、線粒體質(zhì)量、線粒體膜電位、ATP生成以及線粒體轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對線粒體的各方面機(jī)能造成損傷[45]。筆者推測，線粒體組織可能是阿維菌素重要的靶標(biāo)位點(diǎn)，在阿維菌素脅迫條件下銹赤扁谷盜線粒體受到誘導(dǎo)損傷，進(jìn)而造成昆蟲呼吸代謝速率降低，且抑制線粒體編碼基因表達(dá)。此外，阿維菌素脅迫下銹赤扁谷盜線粒體ATP合成酶基因和的表達(dá)量顯著下調(diào)，可以推測阿維菌素作用機(jī)理可能與魚藤酮類似，均會抑制銹赤扁谷盜線粒體膜電位和ATP含量。

3.4 銹赤扁谷盜響應(yīng)饑餓脅迫呼吸速率變化和線粒體編碼基因表達(dá)模式

饑餓脅迫下，銹赤扁谷盜呼吸速率呈現(xiàn)降低趨勢（圖6），暗示銹赤扁谷盜體內(nèi)氧化代謝水平降低，推測饑餓狀態(tài)下銹赤扁谷盜通過降低能量代謝以維持自身平衡。有研究表明饑餓脅迫會影響克氏錐蟲（）線粒體結(jié)構(gòu)，喪失線粒體重塑與自噬功能[46]。秀麗隱桿線蟲（）在饑餓脅迫期間線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)減少以及饑餓引起發(fā)育停止期間DNA損傷的累積，線粒體功能也因饑餓而受損[47]；根據(jù)以上結(jié)果可以推測，饑餓脅迫導(dǎo)致銹赤扁谷盜線粒體功能障礙，試蟲通過降低線粒體編碼基因表達(dá)量以保證線粒體的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

銹赤扁谷盜12個(gè)線粒體編碼基因具有時(shí)空表達(dá)特異性，表明線粒體編碼基因在銹赤扁谷盜生長發(fā)育過程和組織中發(fā)揮重要作用。高溫脅迫下，銹赤扁谷盜可能通過提升呼吸代謝速率和特定線粒體編碼基因表達(dá)量來響應(yīng)高溫逆境，同時(shí)通過降低一部分線粒體復(fù)合體關(guān)鍵基因的表達(dá)以應(yīng)對高溫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激；熏蒸劑甲酸乙酯脅迫下，銹赤扁谷盜可能通過降低呼吸速率和線粒體編碼基因表達(dá)量來減少甲酸乙酯吸入量；魚藤酮脅迫導(dǎo)致銹赤扁谷盜呼吸速率和線粒體編碼基因表達(dá)量顯著降低；銹赤扁谷盜呼吸速率和線粒體編碼基因積極響應(yīng)阿維菌素脅迫，推測線粒體可能也是阿維菌素的作用靶標(biāo)；饑餓脅迫下，由呼吸速率變化可以看出銹赤扁谷盜通過降低能量代謝水平維持自身平衡，同時(shí)會下調(diào)線粒體編碼基因表達(dá)量來保證線粒體的穩(wěn)定性。綜上，銹赤扁谷盜呼吸代謝和線粒體編碼基因?qū)Ω邷?、藥劑和饑餓脅迫呈現(xiàn)顯著的應(yīng)激反應(yīng)，且試蟲呼吸速率和線粒體基因表達(dá)量均表現(xiàn)出較為一致的響應(yīng)規(guī)律。

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CHEH ErHu, YUAN GuoQing, SUN ShengYuan, TANG PeiAn

College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety of Jiangsu Province/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Province, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023

【Background】Mitochondria is an important organelle in the organism, which is the primary site for cellular oxygen consumption and the production of the energy substance adenosine triphosphate (ATP), playing a significant role in the organism’s resistance to adversity. The rusty grain beetle () is a type of global stored grain pest, possessing extremely strong environmental adaptability.【Objective】The objective of this study is to analyze the respiratory rate ofand the response of mitochondrial protein-coding genes to different environmental stresses, and to investigate the stress response of mitochondria in the adversity resistance of.【Method】Mitochondrial protein-coding genes were identified based on the mitochondrial genome data of, and corresponding real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) primers were designed. The toxicity regression equation and LC30ofto fumigants (ethyl formate), botanical insecticides (rotenone), and stored grain protectants (avermectin) were determined by using bioassay methods, and these concentrations were used for subsequent drug stress treatment on the test insects. The spatial and temporal expression patterns (different developmental stages and different tissues of larvae) of mitochondrial protein-coding genes inwere analyzed by using RT-qPCR technology. Finally, the changes in the respiratory rate ofunder various adversity stresses such as high temperatures (35 and 40 ℃), ethyl formate, rotenone, avermectin, and starvation, as well as the expression patterns of mitochondrial protein-coding genes, were studied by using a CO2detector and RT-qPCR technology, respectively.【Result】Twelve mitochondrial protein-coding genes (excluding) quantitative primers were designed. RT-qPCR results showed that these mitochondrial protein-coding genes had a higher expression level at the 3rd instar larval stage, and mitochondrial genes were specifically highly expressed in the malpighian tubules of 3rd instar larvae. Moreover, under high-temperature stress, the respiratory rate ofsignificantly increased, and the expression levels of mitochondrial protein-coding genes,, andincreased significantly, while,,, andshowed a significant downregulation trend. Under ethyl formate fumigation stress, the respiratory rate ofsignificantly decreased, and all 12 mitochondrial protein-coding genes were significantly downregulated. Among them, the expression levels ofandwere only 3.48% and 1.91% of the control group, respectively. Under rotenone and avermectin stress, the respiratory rate ofsignificantly decreased, and the expression levels of mitochondrial protein-coding genes, except for, were significantly downregulated. Under starvation stress, the respiratory rate ofsignificantly decreased, and as the stress duration increased, the downregulation of mitochondrial encoded gene expression levels became more pronounced.【Conclusion】The respiratory metabolism rate and mitochondrial protein-coding gene expressions ofchanged significantly under different environmental stresses, indicating that the mitochondria plays an important role in the adaption to high temperature, pesticides, and starvation stress in.

; environmental stress; respiratory rate; mitochondrial protein-coding gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.006

2023-08-14；

2023-09-09

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD2100604）、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2022377）、國家自然科學(xué)基金（32001915，32272388）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（YXK2103）、江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX23_1894）

陳二虎，E-mail：erhuchen1104@163.com。通信作者唐培安，E-mail：tangpeian@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）