王曉輝 向禮波 劉美玲 楊立軍 龔雙軍

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢；氟啶胺；敏感性；抗性菌株；生物學(xué)特性

灰霉病（grey mold）波及范圍廣，是世界性重要病害之一，該病會(huì)導(dǎo)致多種蔬菜果實(shí)腐爛變質(zhì)，是保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)的一種威脅。其病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea具有寄主范圍廣泛、產(chǎn)孢量大、易隨氣流傳播、極易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。目前，防治灰霉病的主要方法為施用殺菌劑。但是，由于灰葡萄孢基因變異頻率較高，生長(zhǎng)速度快和產(chǎn)孢量大，其對(duì)殺菌劑具有較高抗性風(fēng)險(xiǎn)。已有抗性監(jiān)測(cè)表明，灰葡萄孢對(duì)琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）、二甲酰亞胺類（DCFs）、呼吸抑制劑（QOls）和苯并咪唑類（MBCs）殺菌劑等均已產(chǎn)生了抗性。另外，還存在對(duì)幾種殺菌劑同時(shí)表現(xiàn)出多藥抗性的菌株。由于灰霉病菌的抗藥性導(dǎo)致殺菌劑的防效降低，甚至某些藥劑（DCFs和MBCs）在有些地區(qū)完全不能使用。

氟啶胺（fluazinam）是吡啶胺類殺菌劑（phe-nylpyrroles）中用于灰霉病防治的重要品種，由日本石原產(chǎn)業(yè)公司開發(fā)，它的作用機(jī)理獨(dú)特，能夠解偶聯(lián)氧化磷酸化，具有高效和廣譜特性。對(duì)鏈格孢屬Alternaria、葡萄孢屬Botrytis、疫霉屬Phytophthora，核盤菌屬Sclerotium的病原菌具有很好的防治效果。目前，氟啶胺制劑已經(jīng)登記防治多種作物病害，尤其在灰霉病防治上應(yīng)用廣泛。

已有的研究表明，植物病原菌對(duì)氟啶胺產(chǎn)生抗性風(fēng)險(xiǎn)低，氟啶胺屬于低抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑；且與其他類型的殺菌劑不存在交互抗性。自從1990年開始應(yīng)用防治作物病害以來，只有Tamura報(bào)道在菜豆田發(fā)現(xiàn)了抗氟啶胺的灰葡萄孢菌株。本研究從吉林、江西、湖北、山東、北京、湖南等地區(qū)的草莓、辣椒、四季豆、茄子和番茄上采集并分離了灰霉病菌菌株，測(cè)定其對(duì)氟啶胺的敏感性，比較敏感性下降菌株與敏感菌株之間的生物學(xué)性狀的差異，研究抗氟啶胺灰葡萄孢菌株的適合度，旨在為灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的抗性治理及氟啶胺的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試藥劑

95%氟啶胺、98%咯菌腈和97%腐霉利原藥分別由湖北正興源精細(xì)化工有限公司、湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司和沈陽化工研究院有限公司提供。

1.2菌株的采集與分離

2020年-2021年分別在北京、吉林、湖南、山東、湖北和江西等地各種蔬菜大棚采集灰霉病病葉或病果，將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室。18～20℃濕潤(rùn)培養(yǎng)2d后，將具有灰霉病特征的病組織放置于解剖鏡下，采用龔國(guó)淑等的單孢分離法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再利用形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，分離到的菌株置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3灰霉病菌對(duì)氟啶胺敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定：以二甲基亞砜為溶劑，將氟啶胺原藥配制成濃度為10mg/mL的溶液作為母液，置于4℃冰箱備用。在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上參照Shao等的方法設(shè)計(jì)帶藥平板濃度，對(duì)敏感性菌株濃度設(shè)為：0.001 562 5、0.003 125、0.006 25、0. 012 5、0.025、0.05u/g/mL和0.1ug/mL;對(duì)敏感性下降菌株濃度設(shè)為：0.0125、0.025、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5、1、2ug/mL和4ug/mL，其中4u/g/ml。為最小抑制濃度（MIC）。將藥劑母液用二甲基亞砜稀釋成系列濃度，等量加入PDA培養(yǎng)基中，倒人滅菌培養(yǎng)皿中（d=9cm），制成帶毒平板，以添加等量二甲基亞砜作為空白對(duì)照。在預(yù)培養(yǎng)好的供試菌株菌落邊緣的同一圓周上用打孔器（d=3mm）打取菌餅，菌絲面朝下接種于培養(yǎng)皿中央，3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。待對(duì)照菌落大小接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)測(cè)定各處理菌落直徑（mm），與對(duì)照處理相比計(jì)算出菌落擴(kuò)展生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑）／（對(duì)照菌落直徑一菌餅直徑）×100%。

以抑制率的幾率值y作為縱坐標(biāo)，藥劑濃度對(duì)數(shù)值z(mì)作為橫坐標(biāo)，求出毒力回歸方程y=bx+a和相關(guān)系數(shù)r，計(jì)算藥劑對(duì)病菌的抑制中濃度EC50。

1.4抗藥穩(wěn)定性

將敏感菌株JL106及敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47在無藥PDA平板上培養(yǎng)，當(dāng)菌絲形成菌落，打取菌餅繼代培養(yǎng)。分別測(cè)量各菌株的第1代、5代、10代對(duì)氟啶胺的敏感性。每代培養(yǎng)3d。

1.5對(duì)其他殺菌劑的敏感性

選取4株敏感性下降菌株和11株敏感菌株，分別測(cè)定其對(duì)二甲酰亞胺類的腐霉利和苯基吡咯類的咯菌腈敏感性，然后分別以對(duì)氟啶胺和其他藥劑的EC50的對(duì)數(shù)值為橫、縱坐標(biāo)作圖，求出回歸直線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6對(duì)氟啶胺敏感性下降的灰葡萄孢菌株的生物學(xué)特性測(cè)定

1.6.1菌株生長(zhǎng)速率測(cè)定

田間自然敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47，敏感菌株HN31，JX83，BJ17和JL106，接種于PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)3d后，在菌落邊緣同一圓周上打取直徑為5mm菌餅，采用菌絲朝下的方式接種到含有15mL PDA培養(yǎng)基的正中間，用封口膜封緊培養(yǎng)皿，每菌株3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，測(cè)量菌落的生長(zhǎng)直徑并記錄結(jié)果，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.6.2菌絲生物量測(cè)定

參照Tian等的方法。在20℃條件下培養(yǎng)3d的敏感菌株HN31、JX83、BJ17和JL106及田間自然敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的平板上，用直徑為3mm的打孔器于菌落邊緣同一圓周上打取5枚菌餅，接種于盛有200mL PDB培養(yǎng)液的塑料瓶中，每處理設(shè)置3次重復(fù)，振蕩培養(yǎng)96h去掉培養(yǎng)液，于60℃烘12h。稱量各瓶中菌絲干重，取3次重復(fù)的平均值為各處理的菌絲生物量。

1.6.3平板上產(chǎn)孢能力及孢子萌發(fā)能力

參照Markoglou等的方法，略加改動(dòng)，方法如下：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的敏感菌株HN31、JX83、BJ17和JL106及敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的菌落于20℃，光照周期L∥D=14h∥10h條件下培養(yǎng)7～10d，每皿加20mL濃度為0.1%的葡萄糖液（有利于孢子萌發(fā)），用涂布器將所有的菌絲（包括分生孢子）刮下，用4層紗布過濾至50mL塑料離心管中，離心收集孢子，棄上清，用1%葡萄糖溶液重懸，振蕩器振蕩1min，使孢子充分地分散均勻。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各菌株孢子懸浮液的濃度，并稀釋成80個(gè)/mL，取40uL于凹玻片中，于20℃黑暗培養(yǎng)6h，鏡檢每個(gè)菌株共200個(gè)孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率，每菌株設(shè)置3次重復(fù)。

1.6.4致病力測(cè)定

將BJ14、BJ45、BJ46、BJ47和JL106等5個(gè)菌株在PDA平板上培養(yǎng)3d備用。選用生長(zhǎng)狀態(tài)和大小相同且表面無明顯損傷的番茄果實(shí)進(jìn)行致病力測(cè)定。用蒸餾水輕輕清洗果實(shí)3次，將盤子（長(zhǎng)25cm，寬19.5cm）用75%乙醇清洗消毒，然后用蒸餾水清洗干凈，鋪3層吸水紙，用蒸餾水濕潤(rùn)。在各菌株的菌落邊緣同一圓周上打取5mm菌餅，菌絲面朝下接種到番茄果實(shí)中間部位，每菌株3次重復(fù)，置于20℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d，統(tǒng)計(jì)對(duì)番茄的致病力并比較各菌株致病力的差異。試驗(yàn)重復(fù)3次。以對(duì)氟啶胺敏感的菌株JL106和PDA培養(yǎng)基為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS軟件（Version 9.13；SAS Institute，Cary，NC）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。5%水平下LSD多重比較檢驗(yàn)各處理平均值之間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1供試灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的敏感性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定分離獲得的117株灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的敏感性。菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的EC50分別是0.179 8、0.152 4、0.113 7 ug/mL和0. 394 6 ug/mL，顯著高于其他113個(gè)菌株，并且僅有這4個(gè)菌株能夠在MIC濃度（4ug/mL）下生長(zhǎng)（圖1）。剩下113個(gè)菌株對(duì)氟啶胺的EC50平均值為0.025 1ug/mL，作為本研究的敏感基線。因此，這4個(gè)菌株為氟啶胺的敏感性下降菌株，其他菌株為氟啶胺敏感菌株。來自6省市的117株灰霉病菌的EC50的變化見表1，來自湖北的菌株敏感性最高，對(duì)氟啶胺的平均EC50最低，為0.002 6ug/mL;來自北京的菌株敏感性最低，對(duì)氟啶胺的平均EC50最高，為0.038 9ug/mL。

2.2抗性的穩(wěn)定性

將敏感性降低菌株在不含藥劑PDA平板上連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后，測(cè)定其對(duì)氟啶胺抗性水平變化。結(jié)果（表2）表明，敏感性降低菌株在無藥劑條件下連續(xù)培養(yǎng)10代后，抗性水平無顯著差異，這說明對(duì)藥劑的不敏感性可以通過無性繁殖穩(wěn)定表現(xiàn)。

2.3交互抗性特征

氟啶胺敏感菌株和敏感性降低菌株對(duì)咯菌腈和腐霉利的敏感性不存在顯著差異，因此氟啶胺與咯菌腈、腐霉利之間不存在交互抗性（圖2）。

2.4對(duì)氟啶胺敏感性下降的灰葡萄孢菌株的生物學(xué)特性

2.4.1敏感性下降菌株生長(zhǎng)速率、菌絲干重、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)

田間敏感性下降菌株生長(zhǎng)速率顯著低于敏感菌株，但菌絲生物量與敏感菌株無顯著差異。田間敏感性下降菌株的產(chǎn)孢能力和孢子萌發(fā)率與敏感菌株也無顯著差異（表3）。

2.4.2敏感性下降菌株的致病力

在番茄果實(shí)上進(jìn)行致病力的試驗(yàn)結(jié)果表明，敏感菌株JL106的致病力顯著高于4株敏感性下降菌株（圖3）。4株敏感性下降的菌株致病力之間無顯著差異（表4）。

3結(jié)論與討論

建立敏感基線是病原菌對(duì)藥劑抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，尤其是對(duì)B．cznerea等有高抗藥風(fēng)險(xiǎn)的病原菌。有關(guān)氟啶胺的敏感基線的研究已有很多報(bào)道，Shao等報(bào)道江蘇、浙江、遼寧、湖北和重慶等地區(qū)的100株灰霉病菌的EC50平均為0.022 7ug/mL，敏感菌株最低抑制濃度（MIC）<4 ug/mL，石妞妞等報(bào)道氟啶胺對(duì)福建省106株番茄灰霉病菌的EC50平均值為0.022 1ug/mL。本研究測(cè)定了采自吉林、北京、江西、山東、湖南和湖北等6省市共計(jì)117株灰霉病菌B．cinerea對(duì)氟啶胺的敏感性，樣本量足夠大；除了4株菌敏感性顯著降低之外，藥劑對(duì)其他113株病原群體EC50平均值為0.025 1ug/mL，與前人研究的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)的4個(gè)菌株都是從北京草莓種植園中分離，這可能與當(dāng)?shù)赜盟庮l率和用藥習(xí)慣有關(guān)，草莓的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，因此農(nóng)戶用藥頻次較高，藥劑的選擇壓力大，菌株對(duì)藥劑的敏感性降低。此外，發(fā)現(xiàn)的4株敏感性下降的菌株致病力顯著下降。所以，氟啶胺大面積推廣應(yīng)用期間，需要定期監(jiān)測(cè)灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的抗性發(fā)展?fàn)顩r。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)氟啶胺室內(nèi)和田間抗藥性的報(bào)道較少。Tamura報(bào)道日本北海道發(fā)現(xiàn)了大豆灰霉病菌B．cznerea的田間高抗性菌株，但是關(guān)于抗性倍數(shù)沒有詳細(xì)介紹。Shao等在室內(nèi)采用藥劑馴化獲得抗性突變體菌株，抗性菌株的抗性水平RF（突變體的EC50/親本菌株的EC50）為23～53，抗性菌株的EC50分布于0.23～0.44ug/mL之間。Vitoratos在室內(nèi)利用甲基硝基亞硝基胍誘變玉米瘤黑粉菌Ustilago may-dis獲得氟啶胺抗性菌株，抗性水平（RF）為11.8～80，EC50分布于0.25～0.48ug/mL之間。本研究分離得到4株對(duì)氟啶胺敏感性降低的田間菌株，其EC50為0.113 7～0.394 6ug/mL，其MIC值大于4ug/mL，抗性倍數(shù)在4.7和16.3之間，屬于低一中抗水平。

了解抗性菌株的生物學(xué)特性，可以為解析病原菌對(duì)藥劑的抗性機(jī)制提供幫助。在抗性菌株生物學(xué)特性研究中發(fā)現(xiàn)，4株敏感性下降菌株生長(zhǎng)速率顯著低于敏感菌株，菌絲生物量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率與敏感菌株無顯著差異；致病力測(cè)定結(jié)果顯示敏感性降低的菌株致病力顯著下降。說明這4株菌株田間競(jìng)爭(zhēng)力沒有優(yōu)勢(shì)，從另一方面也說明為什么氟啶胺使用了快30年，但是在國(guó)內(nèi)外對(duì)其抗藥性的相關(guān)報(bào)道比較少。Vitoratos報(bào)道的甲基硝基亞硝基胍誘變獲得的突變體在生長(zhǎng)速率和致病力上與親本菌株沒有差異，Shao等通過藥劑篩選獲得的突變體在菌絲生物量、產(chǎn)孢量和致病力上顯著低于親本菌株。本研究的結(jié)果與以上前人研究結(jié)果有差異，推測(cè)可能原因是抗性菌株獲得方法不同而有差異，抑或是菌株的種類不同而有所不同。交互抗藥性研究結(jié)果顯示，氟啶胺與咯菌腈和腐霉利不存在交互抗藥性。目前研究認(rèn)為腐霉利及咯菌腈的靶標(biāo)之一可能是雙組分信號(hào)途徑的雙組分組氨酸激酶元件OSl，在動(dòng)物細(xì)胞中，氟啶胺通過解偶聯(lián)氧化磷酸化抑制細(xì)胞線粒體的能量合成，具體作用機(jī)制尚不清楚。Shao等研究顯示，抗性菌株ATP含量下降，然而ATPase活性卻顯著高于親本菌株，表明灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的抗性機(jī)制與菌體的能量代謝密切相關(guān)。目前能量合成影響的相關(guān)研究主要是磷酸化抑制劑。磷酸化抑制劑一般有3類，第一類呼吸抑制劑，這類抑制劑抑制呼吸鏈的電子傳遞，也就是抑制氧化，氧化是磷酸化的基礎(chǔ)，抑制了氧化也就抑制了磷酸化；第二類磷酸化抑制劑，這類抑制劑抑制ATP的合成，抑制了磷酸化也一定會(huì)抑制氧化；第三類解偶聯(lián)劑，使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行，后兩類都抑制能量ATP合成。Vitoratos報(bào)道[25]室內(nèi)獲得的U．may-dis抗性突變體和敏感菌株對(duì)氟啶胺和磷酸化抑制劑寡霉素敏感性測(cè)定，表明兩者存在正交互抗藥性，而與解偶聯(lián)劑2，4-二硝基酚不存在交互抗藥性，氟啶胺作為磷酸化抑制劑還是作為解偶聯(lián)劑阻斷能量的產(chǎn)生，還需要進(jìn)一步的研究。在以后的研究中將分析氟啶胺和其他氧化磷酸化抑制劑對(duì)灰霉菌線粒體活性的影響，確定氟啶胺的確切作用位點(diǎn)。