朱玉珍,吳紫薇,高貽宙,Ulf Meyer-Hoffert,吳志宏,

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023;2.德國基爾大學(xué) 醫(yī)學(xué)院皮膚學(xué)研究所,德國 基爾 24105)

特應(yīng)性皮炎(atoipc dermatitis,AD)是一種慢性、炎癥性、復(fù)發(fā)性皮膚病。特應(yīng)性皮炎患者會(huì)出現(xiàn)濕疹性病變并伴隨強(qiáng)烈的瘙癢,從而導(dǎo)致失眠和心理健康問題[1]。AD患者的先天免疫和適應(yīng)性免疫都發(fā)生了改變,導(dǎo)致病菌感染,從而觸發(fā)和加重疾病進(jìn)程。現(xiàn)有研究表明,AD中與免疫功能障礙相關(guān)的發(fā)病機(jī)制包括:免疫球蛋白E(immunoglobulin E,lgE)增加,對(duì)過敏原的敏感性增加,急性病變中Th2型細(xì)胞因子表達(dá)升高,表達(dá)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原的T細(xì)胞數(shù)量增加,朗格漢斯細(xì)胞和炎性樹突狀表皮細(xì)胞上高親和力IgE受體的表達(dá)增加,胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的表達(dá)增加[2-4]。除此以外,研究還發(fā)現(xiàn),多種免疫細(xì)胞參與AD的調(diào)控,如自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞等[5-7]。然而,AD的免疫病理學(xué)機(jī)制仍然不明確。因此,評(píng)估AD免疫細(xì)胞浸潤程度,探索潛在相關(guān)標(biāo)志物免疫細(xì)胞類型相對(duì)豐度的變化,對(duì)進(jìn)一步闡明AD的分子機(jī)制,開發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)具有重要意義。

基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)是目前最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,存儲(chǔ)了大量的測(cè)序數(shù)據(jù)。目前,已有多項(xiàng)研究通過下載公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來分析疾病的生物標(biāo)志物,如楊雷等[8]對(duì)骨關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制的探索和李娜等[9]對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫細(xì)胞的浸潤模式的研究。機(jī)器學(xué)習(xí)算法是一種人工智能技術(shù),它通過構(gòu)建自動(dòng)學(xué)習(xí)系統(tǒng)對(duì)未知數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析。機(jī)器學(xué)習(xí)已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于疾病預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后及藥物發(fā)現(xiàn)[10]。因此,本研究使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法來綜合篩選與AD相關(guān)的生物標(biāo)志物。此外,我們還使用通過估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)亞群鑒定細(xì)胞類型(cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts,CIBERSORT)算法研究了生物標(biāo)志物和免疫浸潤細(xì)胞之間差異的變化,以更好地了解AD所涉及的分子免疫機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供方向。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)檢索與AD相關(guān)的數(shù)據(jù)集,篩選標(biāo)準(zhǔn)為:數(shù)據(jù)集既包含正常對(duì)照皮膚樣本又包含AD患者皮膚損傷樣本;所有納入樣本均未進(jìn)行藥物處理。最終篩選出4個(gè)數(shù)據(jù)集:GSE32924、GSE130588、GSE16161和GSE36842,這4個(gè)數(shù)據(jù)集均為GPL570測(cè)序平臺(tái)。利用數(shù)據(jù)處理軟件RStudio對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了預(yù)處理。根據(jù)平臺(tái)的注釋文件將探針轉(zhuǎn)換為基因名,排除與基因符號(hào)不對(duì)應(yīng)的探針。將GSE32924和GSE130588、GSE16161和GSE36842分別合并,并進(jìn)行批次矯正;其中GSE32924、GSE130588作為訓(xùn)練集,GSE16161、GSE36842作為驗(yàn)證集。

1.2 篩選DEG

利用RStudio篩選訓(xùn)練集的差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG),閾值設(shè)置為|log2tFC|>2、p<0.05。

1.3 生物標(biāo)志物的篩選與驗(yàn)證

采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選出關(guān)鍵的DEG作為AD的生物標(biāo)志物。最小絕對(duì)收縮和選擇算子回歸分析(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)算法通過添加懲罰函數(shù),將不重要的回歸系數(shù)直接縮減為0,從而達(dá)到特征選擇的目的[11]。支持向量機(jī)遞歸特征消除特征選擇(support vector machine-recursive feature elimination,SVM-RFE)算法采用風(fēng)險(xiǎn)最小化原則和經(jīng)驗(yàn)誤差最小化原則,可用于提高學(xué)習(xí)性能以過濾模型[12]。隨機(jī)森林(random Forest,RF)算法通過對(duì)對(duì)象和變量進(jìn)行抽樣構(gòu)建預(yù)測(cè)模型,生成多個(gè)決策樹并依次對(duì)對(duì)象進(jìn)行分類,最終將分類樹結(jié)果進(jìn)行匯總,從而實(shí)現(xiàn)降維的目的[13]。RF算法通過基尼指數(shù)計(jì)算每個(gè)變量對(duì)分類樹每個(gè)節(jié)點(diǎn)上觀測(cè)值異質(zhì)性的影響,從而比較變量的重要性。本研究利用RStudio構(gòu)建上述3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法,并選擇重疊基因做進(jìn)一步分析。

將GSE16161和GSE36842合并作為驗(yàn)證集,構(gòu)建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線以評(píng)估生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值。ROC曲線下的面積(area under ROC curve,AUC)反映了診斷價(jià)值的大小,面積越大,越接近1,診斷準(zhǔn)確性越高;若越接近0.5,則診斷無意義。

1.4 免疫浸潤細(xì)胞分析

CIBERSORT算法基于線性支持向量回歸的原理進(jìn)行反卷積分析,可用于評(píng)估AD患者的免疫細(xì)胞浸潤情況[14]。CIBERSOFT算法基于蒙特卡洛(Monte Carlo)采樣來獲得每個(gè)樣本的反卷積p值。保留p<0.05的數(shù)據(jù),運(yùn)用RStudio分析正常對(duì)照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本之間免疫細(xì)胞浸潤的差異變化。然后進(jìn)行免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析,用相關(guān)系數(shù)r表示兩個(gè)系數(shù)之間的相關(guān)性。r為正時(shí)表示正相關(guān),r為負(fù)時(shí)則表示負(fù)相關(guān);r越接近1則兩個(gè)變量之間的相關(guān)性越高。

1.5 生物標(biāo)志物與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析

使用RStudio對(duì)篩選到的生物標(biāo)志物和免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析,以進(jìn)一步探索AD疾病發(fā)展過程中的免疫機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因篩選

GSE32924與GSE130588合并后共得到28個(gè)健康樣本(對(duì)照組),64個(gè)AD樣本(試驗(yàn)組),差異分析共篩選得到159個(gè)差異基因,包括54個(gè)上調(diào)基因和105個(gè)下調(diào)基因。

2.2 生物標(biāo)志物的篩選

使用3種不同的機(jī)器學(xué)習(xí)算法來篩選關(guān)鍵的DEG作為AD的生物標(biāo)志物,篩選結(jié)果如圖1所示。LASSO算法識(shí)別了16個(gè)基因(圖1(a))。SVM-RFE算法篩選出28個(gè)基因(圖1(b))。此外,利用RF算法對(duì)基因的重要性進(jìn)行排序,篩選基尼指數(shù)大于2的基因,共得到6個(gè)基因(圖1(c))。對(duì)3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出來的基因取交集,最終得到2個(gè)重疊的基因:基質(zhì)金屬肽酶12(matrix metalloproteinase 12,MMP12)和WNT(wingless/integrated,無翅/整合素)抑制因子1(WNT inhibitory factor 1,WIF1)(圖1(d))。

圖1 特應(yīng)性皮炎生物標(biāo)志物的篩選Fig.1 Screening biomarkers for patients with atopic dermatitis

構(gòu)建MMP12、WIF1的ROC曲線,并利用AUC值來確定正常對(duì)照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本的診斷有效性,結(jié)果見圖2。由圖2(a)和(b)可知,MMP12、WIF1在測(cè)試集中的AUC值分別為0.982、0.956,表明這兩個(gè)生物標(biāo)志物具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMP12、WIF1作為AD診斷標(biāo)志物的潛力,對(duì)合并的GSE16161和GSE36842中的這些基因進(jìn)行了ROC分析,繪制了ROC曲線(圖2(c)和(d)),結(jié)果也證明兩個(gè)基因可以作為AD的潛在生物標(biāo)志物。

圖2 MMP12、WIF1在測(cè)試集與驗(yàn)證集中的ROC曲線及AUC值Fig.2 ROC curve and AUC value of MMP12 and WIF1 in test set and verification set

2.3 生物標(biāo)志物與免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)性分析

采用CIBERSORT算法計(jì)算數(shù)據(jù)集中22種免疫細(xì)胞的浸潤豐度矩陣。由于樣本中單核細(xì)胞缺失,所以去除單核細(xì)胞,用21種免疫細(xì)胞做后續(xù)分析,結(jié)果如圖3所示。圖3(a)展示了21種免疫細(xì)胞在各樣本中的含量分布,同時(shí)通過小提琴圖較為直觀地展現(xiàn)了正常皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本免疫細(xì)胞浸潤的差異,p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖3(b)可知,與對(duì)照組相比,AD患者皮膚損傷樣本的初始CD4+T細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1、靜息樹突狀細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞浸潤水平顯著上升,記憶B細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2、活化肥大細(xì)胞則顯著下降。

圖3 樣本中21種免疫細(xì)胞分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of 21 immune cell in the sample

由圖3(c)可知,漿細(xì)胞與記憶B細(xì)胞呈較強(qiáng)正相關(guān)(r=0.61),靜息樹突狀細(xì)胞與靜息肥大細(xì)胞呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=-0.69),靜息樹突狀細(xì)胞與巨噬細(xì)胞M2呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=-0.66)。

為了探索生物標(biāo)志物與免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性,進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果如圖4所示。MMP12與樹突狀細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1、初始CD4+T細(xì)胞、初始B細(xì)胞呈較強(qiáng)正相關(guān);與CD8+T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2、活化自然殺傷細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)。WIF1則與之相反。

圖4 生物標(biāo)志物與免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Fig.4 Results of correlation analysis between biomarkers and immune cells

3 討 論

在訓(xùn)練集中篩選出了159個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因54個(gè),下調(diào)基因105個(gè)。隨后利用LASSO、SVM-RFE、RF算法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)一步篩選,最終得到2個(gè)交集基因:MMP12和WIF1。

通過免疫浸潤分析,我們發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本之間免疫細(xì)胞組成存在顯著差異。靜息肥大細(xì)胞在對(duì)照組中是主要的免疫細(xì)胞,而在AD組占比明顯下降。因此我們推測(cè)靜息肥大細(xì)胞可能在維持皮膚穩(wěn)態(tài)中起重要作用。在一項(xiàng)小鼠試驗(yàn)中,研究人員發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞缺陷小鼠表現(xiàn)出皮膚炎癥減輕,這表明過敏原誘導(dǎo)的皮膚炎癥需要肥大細(xì)胞活化[15]。在AD患者皮膚損傷組織中靜息/活化樹突狀細(xì)胞在AD組的占比顯著上升,樹突狀細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞的一種,可捕獲抗原、過敏原和微生物,將初始T細(xì)胞啟動(dòng)為免疫原性或耐受原性亞群,并充當(dāng)先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁。有研究表明樹突狀細(xì)胞直接參與AD特異性免疫過程,導(dǎo)致可溶性介質(zhì)的釋放和T細(xì)胞的激活,從而致使疾病惡化[16]。在我們的分析中,巨噬細(xì)胞M1顯著增加、M2則顯著減少。眾所周知,M1巨噬細(xì)胞本質(zhì)上是促炎細(xì)胞,其主要功能是通過吞噬作用或殺菌活性殺死或清除外來抗原或病原體。M2巨噬細(xì)胞具有愈合功能,在組織修復(fù)和維持組織完整性方面具有重要作用[17]。在一項(xiàng)皮膚活檢研究中也證實(shí)了巨噬細(xì)胞M1在特應(yīng)性皮炎表現(xiàn)出顯著特異性[18]。我們還發(fā)現(xiàn)活化自然殺傷細(xì)胞在AD患者皮膚損傷樣本中的占比顯著減少。而一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)小鼠自然殺傷細(xì)胞缺乏與皮膚中Th2炎癥的增強(qiáng)有關(guān),表明自然殺傷細(xì)胞在AD的病理學(xué)中起著關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[19]。此外,CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞也被證明在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-21]。

MMP12是一種由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的彈性蛋白酶,誘導(dǎo)各種炎癥細(xì)胞聚集成炎性組織,與許多慢性炎癥性疾病有關(guān),包括哮喘和動(dòng)脈肝硬化[22]。MMP12的表達(dá)異常與AD患者的全身特應(yīng)性存在相關(guān)性[23]。有研究報(bào)告了AD患者M(jìn)MP12在炎癥部位顯著增加,通過度普利尤單抗治療后檢測(cè)到MMP12有所減少,這也說明MMP12在AD中具有特異性[24]。WIF1是WNT通路的一個(gè)抑制因子,它可以直接與WNT分子結(jié)合,抑制WNT子與受體細(xì)胞膜上的卷曲蛋白受體及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6形成三聚體復(fù)合物,從而抑制信號(hào)傳導(dǎo)。WNT信號(hào)通路在細(xì)胞命運(yùn)決定、發(fā)育過程中的組織模式及損傷后的組織修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。WNT配體和信號(hào)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中也具有重要意義。有證據(jù)表明,WNT信號(hào)通路既影響巨噬細(xì)胞功能又受巨噬細(xì)胞功能的影響[25]。在WNT配體存在的情況下,WIF1在角質(zhì)形成細(xì)胞靜止和分化中具有潛在作用[26]。迄今為止,沒有直接證據(jù)證明WIF1在特應(yīng)性皮炎中的作用,故需進(jìn)一步調(diào)查以闡明潛在的生物學(xué)途徑。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與AD相關(guān)的生物標(biāo)志物:MMP12、WIF1。MMP12、WIF1基因表達(dá)水平與AD患者皮膚損傷樣本的免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)。因此,MMP12、WIF1有望成為特應(yīng)性皮炎潛在的診斷生物標(biāo)志物及免疫相關(guān)治療靶點(diǎn)。