時 憲，楊家慶，王秀娟

(青島科技大學(xué)，高分子科學(xué)與工程學(xué)院，橡塑材料與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省橡塑材料與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266042)

添加適宜適量的抗氧劑可以減緩橄欖油儲存與運(yùn)輸過程中因光照和溫度變化引起的腐敗變質(zhì)情況，提高其化學(xué)穩(wěn)定性，從而延長橄欖油的保存期限[1]。

油脂在氧化過程中與氧氣發(fā)生反應(yīng)，易發(fā)生氧化酸敗，其化學(xué)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，產(chǎn)生各種含氧官能團(tuán)如羰基、醛基等[2]。Jie等[3]為了研究油脂氧化程度，通過紅外全反射光譜計(jì)算氧化前、氧化后橄欖油中羰基（C=O）吸收峰與亞甲基（CH2）吸收峰強(qiáng)度之比，證明油脂發(fā)生了明顯的氧化。楊國燕[4]通過差示掃描量熱儀（DSC）測定壓榨亞麻籽油和菜籽油在不同氧化溫度下的誘導(dǎo)氧化時間，用于評價(jià)油的氧化程度。

隨著人們生活水平的不斷提高，低毒、高效的天然抗氧劑成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。目前，主要集中在天然抗氧劑之間協(xié)同作用的研究上[5-6]。郝曉麗等[7]利用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)研究TBHQ與維生素E協(xié)同抗氧化作用。鐘機(jī)等[8]研究了茶多酚與維生素E對魚子油抗氧化作用的影響, 發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用茶多酚和維生素E時, 顯著提高了魚子油的抗氧化能力, 聯(lián)合使用茶多酚和維生素E的效果與使用人工合成抗氧劑TBHQ的效果相當(dāng), 且高于單獨(dú)使用茶多酚和維生素E的效果，表明二者之間具有協(xié)同效應(yīng)。復(fù)配抗氧劑的研究與應(yīng)用是當(dāng)今食品工業(yè)的發(fā)展趨勢，探討抗氧劑之間的協(xié)同作用，開發(fā)高效的復(fù)配抗氧劑，對于抗氧劑的有效利用具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過紅外全反射光譜檢測、DPPH自由基清除能力以及DSC氧化誘導(dǎo)期的測定，研究復(fù)配抗氧劑對橄欖油抗氧化性表現(xiàn)，探究其協(xié)同作用，為橄欖油實(shí)際生產(chǎn)和生活應(yīng)用中開發(fā)高效復(fù)配抗氧劑提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

迷迭香提取物（RE，純度99%），成都萬象宏潤生物科技有限公司。橄欖油（分析純），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度96%），特丁基對苯二酚（TBHQ，純度98%），茶多酚提取物（TP，純度99%），無水乙醇（純度95%），均來自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀，HQL，德國布魯克（bruker）；磁力加熱攪拌器，78-1B，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；熱空氣老化試驗(yàn)機(jī)，D3051511，臺中高鐵科技股份有限公司；差示掃描量熱計(jì)，D3061404，臺中高鐵科技股份有限公司；紫外熒光光度計(jì)，UV1900，上海睿士科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取七組10mL橄欖油，并按照數(shù)字序號1～7作為標(biāo)記，第1組未添加抗氧劑的空白橄欖油樣品作為對照組，2～4組分別單獨(dú)加入RE、TP和TBHQ各2mg，5～7為RE、TP和TBHQ各1mg兩兩復(fù)配，以上添加量均符合GB/T 2760-2014。將添加抗氧劑的橄欖油樣品于25℃超聲處理并進(jìn)行磁力攪拌5min，然后裝入棕色廣口瓶中。

1.2.2 烘箱法加速老化實(shí)驗(yàn)

將樣品放入棕色廣口瓶中密封，置于（80±1）℃恒溫烘箱內(nèi)，分別在氧化0、2、4、6天后取樣，取樣后放置于-20℃冰箱儲藏備用。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測定

在2mL油樣中加入2mL DPPH溶液（6×10-5mol/L），常溫條件下于黑暗處靜置2h后，用紫外熒光光度計(jì)測定517nm處吸光度。DPPH自由基清除能力計(jì)算公式為[9]：

式（1）中，AC為對照組的吸光度，AS為油脂樣品的吸光度。

1.2.4 紅外全反射光譜分析

使用德國Bruker公司的HQL型傅立葉變換紅外-拉曼光譜儀對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行紅外測試，橄欖油樣品采用衰減全反射模式[10]。

1.2.5 差示掃描量熱法（DSC）測定橄欖油氧化誘導(dǎo)期

分別取1～7號樣品2.5mg放入鋁合金制成的一層鋁制板上，并放入敞口的鋁坩堝中。設(shè)置升溫速率為10℃/min，溫度由30℃升溫至160℃，空氣的升溫流速控制為30mL/min。誘導(dǎo)氧化期為氧化反應(yīng)曲線最大斜率的切線和氧化反應(yīng)前外推時間基線相交點(diǎn)所對應(yīng)的時間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)測定3次取平均值得到樣品的氧化誘導(dǎo)期[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基清除能力測定是將抗氧劑自身含有的H原子與DPPH中的自由基相結(jié)合，生成沒有顏色的穩(wěn)定化合物[12]，通過該實(shí)驗(yàn)可得出加入不同抗氧劑的橄欖油自由基清除能力。首先分別對氧化2、4、6天中未加入抗氧劑的樣品進(jìn)行紫外分光測試，得到空白對照組吸光度，然后測定加入不同抗氧劑樣品的吸光度，按公式（1）計(jì)算得出不同樣品的DPPH自由基清除率。單體抗氧劑和復(fù)配抗氧劑實(shí)際平均值可通過氧化2、4、6天的DPPH自由基清除率計(jì)算平均值得出。通過同一濃度下單體抗氧劑DPPH自由基清除率，利用加合取平均方法計(jì)算得出1：1兩兩復(fù)配時復(fù)配抗氧化劑的理論值[13-14]，由此得出氧化2、4、6天時復(fù)配抗氧劑理論平均值。

從表1可以看出，通過計(jì)算樣品氧化2、4、6天的DPPH自由基清除率平均值，得出單體抗氧劑自由基清除率實(shí)際平均值最高為TBHQ的70.1%，其次是復(fù)配抗氧劑TP和RE的67.5%，由此可得，TBHQ與TP和RE兩者間的自由基清除率實(shí)際平均值差距小于3%，說明兩者自由基清除能力差距不大。通過對比復(fù)配抗氧劑TP和RE的實(shí)際平均值和理論平均值發(fā)現(xiàn)，其自由基清除率實(shí)際平均值為67.5%，而理論平均值為54.7%，相比理論值增長12.8%，說明TP和RE復(fù)配情況下整體協(xié)同作用表現(xiàn)較強(qiáng)，而RE、TP分別與TBHQ復(fù)配時，復(fù)配抗氧劑的DPPH自由基清除率實(shí)際平均值均低于理論平均值，說明整體協(xié)同作用表現(xiàn)較弱。

表1 紫外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 UV experimental data

由圖1可知，氧化2天的實(shí)驗(yàn)樣品中，單體抗氧劑中TBHQ自由基清除率最高為93.9%，其次TP自由基清除率為63.6%，而RE自由基清除率僅為12.9%，三者差距較大。復(fù)配抗氧劑TP和RE自由基清除率為57.6%，為復(fù)配抗氧劑中效果最好。通過對比TP、RE、TP與RE復(fù)配三組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TP對DPPH自由基的清除能力明顯高于RE，略高于TP和RE復(fù)配實(shí)驗(yàn)組。這主要是因?yàn)镈PPH為脂溶性體系[15]，而RE為水溶性抗氧劑，TP比RE具有更好的脂溶性，更易分散到整個體系中，進(jìn)而發(fā)揮好的抗氧化效果。

圖1 氧化2天樣品自由基清除率Fig.1 Free radical scavenging rate after 2 days of aging

由圖2可知，氧化4天的實(shí)驗(yàn)樣品中，單體抗氧劑中RE自由基清除率最高為83.3%，其次TP自由基清除率為71.1%，而TBHQ自由基清除率為57.1%。復(fù)配抗氧劑中TP和RE自由基清除率為80.7%，為復(fù)配抗氧劑中最高。衡量抗氧劑的優(yōu)劣標(biāo)準(zhǔn)為自由基清除率達(dá)到50%以上，以上實(shí)驗(yàn)組均符合自由基清除率測試實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 氧化4天樣品自由基清除率Fig.2 Free radical scavenging rate after 4 days of aging

由圖3可知，氧化6天后的實(shí)驗(yàn)樣品中，單體抗氧劑中TBHQ自由基清除率最高為59.2%，其次TP自由基清除率為52.9%，而RE自由基清除率僅為44.3%，三者差距縮小。復(fù)配抗氧劑TP和TBHQ體系的自由基清除率為65.5%，為復(fù)配抗氧劑中最高，其次是TP和RE復(fù)配體系的自由基清除率為64.2%。綜合三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來看，復(fù)配抗氧劑TP和RE使用效果最為穩(wěn)定，協(xié)同作用效果較好，一定程度上可替代人工合成抗氧劑TBHQ應(yīng)用于橄欖油實(shí)際生產(chǎn)中。

圖3 氧化6天樣品自由基清除率Fig.3 Free radical scavenging rate after 6 days of aging

2.2 紅外全反射光譜分析

由圖4可知，通過對比紅外光譜圖中未被氧化和氧化6天的空白對照組于1800cm-1左右處的吸收峰，發(fā)現(xiàn)氧化6天后的空白樣品在該處波峰明顯降低，此處為碳碳雙鍵（-CH2=CH2-），分析原因是由于碳碳雙鍵被氧化導(dǎo)致其波峰值降低。同時，對比發(fā)現(xiàn)氧化6天后的空白樣品于2800cm-1左右處波峰升高，此處為油脂氧化產(chǎn)物羰基（-C=O），羰基的出現(xiàn)意味著油脂發(fā)生了氧化，而實(shí)驗(yàn)所用橄欖油中主要成分為油酸，油酸分子結(jié)構(gòu)式中含有大量碳碳雙鍵。

圖4 空白對照組紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of blank control group

對7組樣品紅外光譜圖中的碳碳雙鍵吸收峰與亞甲基吸收峰進(jìn)行積分，其積分之比可得到不同樣品中碳碳雙鍵的變化情況。結(jié)果如圖5所示。 由圖5可知，RE與TP復(fù)配實(shí)驗(yàn)組碳碳雙鍵含量最高，說明RE與TP復(fù)配橄欖油對碳碳雙鍵的保護(hù)效果最好，其次是TP與TBHQ復(fù)配。

圖5 碳碳雙鍵與亞甲基積分量化比Fig.5 Integral ratio of carbon-carbon double bond to methylene

由圖6可知，對樣品紅外光譜圖中的羰基吸收峰與亞甲基吸收峰進(jìn)行積分，其積分之比可得到不同樣品中羰基的變化情況。由此可得出結(jié)論：RE與TP復(fù)配實(shí)驗(yàn)組中羰基含量最低，說明該組實(shí)驗(yàn)對羰基的抑制效果最好，其次是TP與TBHQ復(fù)配實(shí)驗(yàn)組。綜合紅外全反射實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，得出RE與TP復(fù)配抗氧劑對橄欖油結(jié)構(gòu)保護(hù)方面最好，性質(zhì)最穩(wěn)定，與前文DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果一致。

圖6 羰基與亞甲基積分比值Fig.6 Integral ratio of carbonyl to methylene

2.3 氧化誘導(dǎo)期實(shí)驗(yàn)分析

氧化誘導(dǎo)期（OIT）是測定樣品在高溫和氧氣條件下開始發(fā)生自動催化氧化反應(yīng)的時間。樣品的氧化誘導(dǎo)期時間越長則代表抗氧劑的抗氧化性效果越好，對油脂的保護(hù)性也就越好，反之效果越差[16]。根據(jù)圖7可得出當(dāng)設(shè)置溫度由30℃升溫至160℃時，實(shí)驗(yàn)樣品中添加抗氧劑均可延長橄欖油氧化誘導(dǎo)期，其中TBHQ的氧化誘導(dǎo)期時間最長為8.8min，明顯優(yōu)于其他組數(shù)據(jù)，說明TBHQ對延長橄欖油氧化誘導(dǎo)期的效果最佳。由于TP中的酯類兒茶素在高溫下易發(fā)生差向異構(gòu)現(xiàn)象[17]，雖然抗氧化活性好，但耐高溫性差，所以DSC測試氧化誘導(dǎo)期效果劣于TBHQ，橄欖油實(shí)際生產(chǎn)保存中可根據(jù)溫度條件的不同選擇適配的抗氧劑方案。

圖7 DSC氧化誘導(dǎo)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 DSC oxidation induction experiment result

3 結(jié)論

（1）樣品在氧化2、4、6天后，復(fù)配抗氧劑TP和RE自由基清除率較為穩(wěn)定地維持在60%及以上水平，且復(fù)配抗氧劑中僅有該組自由基清除率實(shí)際平均值高于理論平均值，說明整體協(xié)同作用表現(xiàn)穩(wěn)定，協(xié)同作用效果最好。

（2）傅里葉紅外光譜分析特定基團(tuán)碳碳雙鍵和羰基的比值，得出復(fù)配抗氧劑TP與RE對橄欖油結(jié)構(gòu)保護(hù)方面為最佳選擇。

（3）DSC測定樣品氧化誘導(dǎo)期結(jié)果顯示添加TBHQ體系的氧化誘導(dǎo)期最長，若較高溫度保存橄欖油時可適當(dāng)加入TBHQ抗氧劑。