郭明遺 鄧 艷 王天鑫 曾傳濤 吳華昌

(1. 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院,四川 成都 610100;2. 四川旅游學(xué)院烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610100)

水蜜桃(PrunuspersicaL.)為薔薇科桃屬植物,肉多汁甜,營養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛[1]。中國桃子品類豐富,其果肉中含有豐富的抗氧化物如維生素、類胡蘿卜素和酚類化合物[2],果核中富含具有抗炎、抗過敏以及抗菌等多種生物活性的木質(zhì)素[3]、苦杏仁苷[4-5]、多酚及苦杏仁酶[6]等物質(zhì)。研究表明,當(dāng)人體受到外源性物質(zhì)刺激時,細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧簇(ROS),大量ROS積累與細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[7],氧化損傷DNA和細(xì)胞組織[8],誘發(fā)基因突變、細(xì)胞凋亡等,調(diào)節(jié)代謝功能失調(diào),繼而引發(fā)多種相關(guān)疾病,如心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、慢性腎臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、中風(fēng)、糖尿病等[9-11]。

植物多酚具有多種特殊的生理活性,作為天然植物源性抗氧化劑的多酚物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療老年性退行性神經(jīng)疾病[12]、高血壓[13]、心臟代謝紊亂[14-15]、免疫系統(tǒng)促進(jìn)[16]、抗炎抑菌[17]、皮膚保護(hù)[18]等方面,被稱為“第七類營養(yǎng)素”。采用超聲協(xié)同纖維素酶提取法,能夠加速細(xì)胞壁破碎速度[19],增加提取劑滲透作用,其優(yōu)勢在于提取溫度低、提取時間短、得率高、耗能低[20],能夠最大限度保留其生物活性[21]。而有關(guān)水蜜桃果核的研究相對較少,主要為果核木質(zhì)化形成機(jī)理[22]、果肉粘核表型分析[23]以及裂核發(fā)病機(jī)制[24-26]研究,鮮有針對果核有益成分進(jìn)行的特定提取開發(fā)研究。研究擬對超聲輔助酶解提取水蜜桃果核多酚工藝進(jìn)行優(yōu)化,并分析其抗氧化性能,以期推動水蜜桃果核多酚在護(hù)膚品和保健品等具有高附加值產(chǎn)品中的應(yīng)用,為其深度開發(fā)利用提供依據(jù),助力特色產(chǎn)區(qū)的水蜜桃產(chǎn)業(yè)的升級發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

水蜜桃:產(chǎn)自四川省成都市龍泉驛區(qū);

食品級纖維素酶:10萬U/g,山東隆科特酶制劑有限公司;

七水合硫酸亞鐵、過二硫酸鉀(過硫酸鉀)、三羥甲基氨基甲烷(Tris緩血酸胺)、焦性沒食子酸、水楊酸、抗壞血酸:分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司;

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品:≥99%,上海麥克林生化科技有限公司;

福林酚試劑、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(≥95%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%):福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電動粉碎機(jī):FW177型,天津市泰斯特儀器有限公司;

紫外可見分光光度計(jì):UA Blue Star A型,北京萊伯泰科儀器有限公司;

電熱恒溫水浴鍋:DK-98-Ⅱ型,天津市泰斯特儀器有限公司;

恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9240A型,上海恒一科學(xué)儀器有限公司;

超聲波儀:SG9200T型,上海冠特超聲儀器有限公司;

電子天平:LS220ASCS型,上海天美天平儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水蜜桃核多酚的提取 將水蜜桃果肉、果核分離,果核用20 000 r/min破壁機(jī)粉碎3 min,過40目篩,冷凍備用。準(zhǔn)確稱量0.5 g水蜜桃果核粉,按料液比(m果核粉∶V乙醇)1∶30 (g/mL)加入乙醇、纖維素酶,于超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲輔助提取。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照GB/T 8313—2018繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 5x+0.021 2,R2=0.999 6。

1.3.3 提取液多酚含量測定 吸取1 mL提取液,用乙醇定容至10 mL,吸取1 mL定容后的溶液于比色管中,加入5 mL 10%福林酚試劑,搖勻,反應(yīng)1 h,測定765 nm處吸光度,以沒食子酸當(dāng)量干重(mg/g)表示多酚含量,平行3次,按式(1)計(jì)算多酚提取量。

(1)

式中:

R——多酚提取量,mg/g;

C——沒食子酸質(zhì)量濃度,μg/mL;

V——提取液體積,mL;

N——稀釋倍數(shù);

m——取樣量,g。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,以超聲功率240 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時間30 min,超聲溫度60 ℃,纖維素酶添加量5%為基礎(chǔ)提取條件,分別考察超聲功率(120,240,360,480,600 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%,40%,60%,80%,100%)、超聲時間(10,20,30,40,50 min)、超聲溫度(40,50,60,70,80 ℃)、酶添加量(1%,3%,5%,7%,9%)對水蜜桃果核多酚提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn),根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì),選擇酶添加量、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間為自變量,水蜜桃果核多酚提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析以確定多酚提取的最佳工藝條件。

1.3.6 抗氧化性分析

(1) ABTS自由基、DPPH自由基清除能力:參照GB/T 39100—2020。

(2) 羥自由基清除能力:參照石秀梅等[27]的方法。

(3) 超氧陰離子自由基清除能力:參照Wang等[28]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;運(yùn)用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析和設(shè)計(jì)。每組試驗(yàn)平行3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對水蜜桃多酚提取量的影響 由圖1可知,當(dāng)酶添加量為1%～5%時,多酚提取量隨酶添加量的增大而升高,當(dāng)酶添加量為5%時達(dá)最大,原因是一定量的纖維素酶的破壁作用使細(xì)胞中的多酚溶出增大,而當(dāng)酶添加量>5%時,多酚提取量開始下降,可能是因?yàn)檫^多的酶聚集阻塞了細(xì)胞壁作用通孔,使多酚溶出有所減少。綜合考慮,選擇酶添加量為3%,5%,7%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2 超聲功率對水蜜桃多酚提取量的影響 由圖2可知,當(dāng)超聲功率為120～240 W時,多酚提取量隨超聲功率的增大而增多,超聲功率的增大,加大了水蜜桃細(xì)胞中振動的幅度,有利于多酚的溶出;而當(dāng)超聲功率>240 W時,多酚提取量開始下降,可能是過大的超聲功率會在水中產(chǎn)生空化氣泡,使超聲波在水中傳遞作用減弱,多酚物質(zhì)的溶出效率降低。綜合考慮,選擇超聲功率為240 W。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對水蜜桃多酚提取量的影響 由圖3可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%,100%時,不利于多酚的提取;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～40%時,果核多酚提取量明顯增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時,果核多酚提取量達(dá)最大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>60%時,多酚提取量開始減少,可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過大,其他易溶于高濃度乙醇的物質(zhì)溶出,多酚溶出通道被占,使多酚溶出相對減少,影響了多酚物質(zhì)的溶出。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%,60%,80%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.4 超聲時間對水蜜桃多酚提取量的影響 由圖4可知,當(dāng)超聲時間為10～30 min時,多酚提取量逐漸增加,當(dāng)超聲時間為30 min時多酚提取量達(dá)到峰值,隨后開始緩慢下降,可能是因?yàn)殡S著超聲時間的延長,細(xì)胞中液體黏度增大,多酚溶出阻力增大,超聲波的空化作用可能使部分多酚分解。綜合考察,選擇超聲時間為20,30,40 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.5 超聲溫度對水蜜桃多酚提取量的影響 由圖5可知,當(dāng)超聲溫度為40～60 ℃時,多酚提取量增加,是因?yàn)殡S著超聲溫度的升高,纖維素酶開始活化,使提取達(dá)到較好的效果;當(dāng)超聲溫度為60 ℃時,多酚提取量達(dá)到最大,超過60 ℃后提取量開始下降,是因?yàn)槊冈诟邷叵聲Щ睢＞C合考慮,選擇超聲溫度為50,60,70 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇酶添加量、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間為自變量,以多酚提取率為響應(yīng)值,利用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化水蜜桃提取多酚工藝,各因素水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程擬合,得到多酚提取率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為:

Y=8.54+0.14A+0.52B+0.14C+0.18D-0.27AB-5.33×10-3AC-7.05×10-4AD-3.00×10-5BC+0.53BD-0.20CD-0.93A2-1.49B2-0.69C2-0.24D2。

(2)

表3 方差分析?

由圖6可知,酶添加量與超聲溫度、超聲溫度與超聲時間的響應(yīng)面圖曲面陡峭,交互作用對多酚提取量結(jié)果影響顯著,存在顯著協(xié)同作用。

圖6 因素交互作用對水蜜桃果核多酚提取量的影響

2.3 最佳工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert軟件分析結(jié)果,果核多酚的最優(yōu)工藝條件為酶添加量5.22%、超聲溫度62.98 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60.04%、超聲時間37.03 min,多酚提取量預(yù)測值為8.68 mg/g。考慮實(shí)際操作將提取參數(shù)優(yōu)化為酶添加量5.2%、超聲溫度63 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時間37 min,此條件下果核多酚提取量為8.63 mg/g,與預(yù)測結(jié)果非常接近,可以認(rèn)為該響應(yīng)面法得到的預(yù)期優(yōu)化提取條件具有較大的參考價(jià)值。

2.4 抗氧化活性分析

由圖7～圖10可知,在供試濃度范圍內(nèi),水蜜桃果核多酚提取物對4種自由基清除率均在趨于平緩前逐漸升高,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時,多酚提取物對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率分別為75.22%,85.91%,44.72%,45.76%。根據(jù)擬合方程求出,果核多酚提取物對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的半抑制濃度(IC50)分別為0.099,0.098,0.332,0.320 mg/mL。綜上,果核多酚提取物對DPPH自由基、ABTS自由基均表現(xiàn)出相對較好的抗氧化活性,且在一定適用范圍內(nèi)對各自由基的清除率隨提取物質(zhì)量濃度的升高而升高。

圖7 水蜜桃果核多酚提取物ABTS自由基的清除作用

圖8 水蜜桃果核多酚提取物DPPH自由基的清除作用

圖9 水蜜桃果核多酚提取物羥自由基的清除作用

圖10 水蜜桃果核多酚提取物超氧陰離子自由基的清除作用

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法確定了超聲輔助酶解提取水蜜桃果核多酚的最佳工藝參數(shù)為酶添加量5.2%,超聲溫度63 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時間37 min,此條件下水蜜桃果核多酚提取量可達(dá)8.63 mg/g。該果核多酚提取物對DPPH自由基、ABTS自由基均表現(xiàn)出相對較好的抗氧化活性,且半抑制質(zhì)量濃度(IC50)分別可達(dá)到0.098,0.099 mg/mL,說明果核作為特色食品加工廢棄物具備工業(yè)化機(jī)械生產(chǎn)循環(huán)利用的潛在路徑及附加產(chǎn)值。后續(xù)將在更豐富化其生理活性和產(chǎn)品化制劑的制備以及產(chǎn)品性能的測試評估上進(jìn)行深入研究。