楊 紅 唐 莉 李 毅 原紅霞 李青山,

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,山西 晉中 030619;2. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西 晉中 030619)

隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈、行為和生活方式的改變以及環(huán)境污染等因素的影響,亞健康人群呈逐年上升趨勢(shì)[1]。亞健康的形成與氧化應(yīng)激密切相關(guān),而機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的失衡被看作是形成亞健康的主要機(jī)理之一。與此同時(shí),慢性炎癥是“亞健康”的加速劑,其持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致慢性疾病發(fā)生發(fā)展,通過合理飲食可以緩解亞健康狀態(tài),提高生活質(zhì)量及疾病的預(yù)防[2]。

黑米、黑豆、黑芝麻隸屬于黑色食品范疇,富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素等成分,具有延緩衰老與增強(qiáng)造血功能等生物活性。已有研究顯示,黑米的總抗氧化能力是普通稻米的4～18倍[3];黑豆的抗氧化能力遠(yuǎn)大于黃豆和綠豆[4];黑芝麻籽及黑芝麻皮的總抗氧化能力均高于白芝麻[5]。因此,具有保健功能的黑色食品較其他食品呈現(xiàn)出較高的生物學(xué)價(jià)值,已成為食品市場(chǎng)的重要分支。目前,有關(guān)該類食品的研究范疇有限,有關(guān)黑木耳、黑玉米及黑棗的相關(guān)研究較少,且尚以抗氧化研究為主,其抗炎活性未見報(bào)道。

小米中富含蛋白質(zhì)和維生素等物質(zhì)[6],是優(yōu)質(zhì)的糧食。燕麥因其豐富的膳食纖維而具有降血脂、促排泄等功效[7]。目前針對(duì)小米與燕麥的研究仍集中在其主要功效方面,對(duì)抗氧化與抗炎活性的報(bào)道較少。

為了進(jìn)一步比較黑色食品與非黑色食品在生物學(xué)功能上的差異,研究擬以黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑棗、黑玉米6種黑色食品為研究主體,與燕麥、小米2種最常見的非黑色食品進(jìn)行對(duì)比,測(cè)定8種食品水提液中總黃酮和總多酚含量、抗氧化活性及其抗炎活性,通過分析其相關(guān)性,為上述食品的功效研究及其相關(guān)功能食品的創(chuàng)新開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑棗、黑玉米、燕麥、小米:市售;

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥98.0%,成都曼斯特生物科技有限公司;

福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):上海麥克林生化科技股份有限公司;

脂多糖(LPS):北京索萊寶科技有限公司;

NO試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;

小鼠IL-6 ELISA試劑盒:武漢貝茵萊生物科技有限公司;

可見分光光度計(jì):DU700型,美國(guó)Beckman公司;

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱:CCL-170B-8型,新加坡ESCO科技有限公司;

生物安全柜:AC2-4S1型,新加坡ESCO科技有限公司;

熒光酶標(biāo)儀:SpectraMaxI3x型,美國(guó)Molecular Devices儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 8種食品水提液的制備 將黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑棗、黑玉米、燕麥和小米樣品經(jīng)過篩選、粉碎、過篩后,與蒸餾水按照料液比(m樣品∶V水)1∶10 (g/mL)于85 ℃提取,過濾,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法[8]。

1.2.3 總多酚含量測(cè)定 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用Folin-酚法[9]。準(zhǔn)確移取樣品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各項(xiàng)操作, 測(cè)定吸光度,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的總多酚含量。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定 向具塞試管中加入2 mL待測(cè)液和2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L),搖勻,37 ℃避光保存30 min,測(cè)定517 nm處吸光度。取2 mL乙醇與2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)混勻,測(cè)定吸光度;取2 mL待測(cè)液與2 mL乙醇混勻,測(cè)定吸光度。選取維生素C(0.5 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照,并按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率[10]。

(1)

式中:

R——自由基清除率,%;

A0——空白組吸光度;

A1——樣品組吸光度;

A2——對(duì)照組的吸光度。

1.2.5 羥自由基清除能力測(cè)定 向試管中加入2 mL FeSO4溶液(6 mmol/L)、2 mL H2O2溶液(6 mmol/L)、2 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)和2 mL待測(cè)液,37 ℃反應(yīng)1 h,測(cè)定517 nm處吸光度。以蒸餾水作為空白對(duì)照,以不含H2O2的待測(cè)液為對(duì)照組,選取維生素C(0.5 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照,并按式(1)計(jì)算羥自由基清除率[11]。

1.2.6 鐵離子還原能力測(cè)定 取2.5 mL待測(cè)液依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴20 min后迅速冷卻,加入2.5 mL 10%三氧乙酸(TCA)溶液,混勻,4 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混勻后靜置10 min,測(cè)定700 nm處吸光度。以維生素C(0.5 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照,還原能力以吸光度值表示。

1.2.7 RAW264.7細(xì)胞存活率測(cè)定 取對(duì)數(shù)期小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,接種于96孔板中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)12 h,分別加入100 μL 8種食品水提液,使每個(gè)樣品孔的終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。37 ℃培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)基,加入150 μL DMSO,避光震蕩搖勻,測(cè)定490 nm處吸光度值,并按式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)

式中:

S——細(xì)胞存活率,%;

A0——空白組吸光度;

A1——樣品組吸光度;

A2——模型組吸光度。

1.2.8 RAW264.7細(xì)胞液中NO含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中,模型組加入100 μL終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS;樣品組分別加入100 μL同濃度的LPS和8種食品水提液,使樣品終質(zhì)量濃度為5 mg/mL;陽(yáng)性藥組加入100 μL同濃度的LPS和姜黃素溶液,使陽(yáng)性藥終濃度為25 μmol/L。37 ℃孵育24 h,吸取50 μL上清液,加入50 μL的Griess A、Griess B試劑,測(cè)定540 nm處吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞液中NO含量。

1.2.9 RAW264.7細(xì)胞液中IL-6含量測(cè)定 將細(xì)胞上清液于4 ℃離心10 min(3 000 r/min),按照IL-6 ELISA試劑盒操作說明測(cè)定細(xì)胞液中IL-6含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析及組間相關(guān)性分析(單因素ANOVA檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量比較

以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.001 3X+0.003 9(R2=0.998 8),符合比爾定律,可用于總黃酮含量測(cè)定。由圖1可知,黑棗與黑米的總黃酮含量最高且無顯著性差異;黑豆與小米的次之,二者也無顯著性差異;黑玉米和黑木耳的黃酮含量較低。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 總多酚含量比較

以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.011 9X-0.02(R2=0.996 7),符合比爾定律,可用于總多酚含量測(cè)定。由圖2可知,黑豆與黑棗的總多酚含量最高,顯著高于其總黃酮含量;其次為黑米,與總黃酮含量相當(dāng);小米的總多酚含量與總黃酮相當(dāng),但黑玉米的總多酚含量明顯高于總黃酮;黑木耳的總多酚含量?jī)H為0.083 mg/g。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 抗氧化能力比較

2.3.1 DPPH自由基清除能力 以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)98.56%,證明試驗(yàn)方法可行。由圖3可知,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),黑棗的DPPH自由基清除能力最高達(dá)89.48%,且與其他各組相比有顯著性差異。其次是黑米,其清除率為53.69%。黑玉米和黑芝麻也呈現(xiàn)出一定的抗氧化活性,其清除率分別為45.27%,41.56%。而作為非黑色食品的小米和燕麥的DPPH自由基清除率最低,僅為18.41%和22.74%。DPPH自由基活性高低與總黃酮、總多酚含量基本一致,但黑玉米的卻呈現(xiàn)較高活性,可能與其含有大量的具有強(qiáng)DPPH自由基清除能力的花青苷色素有關(guān)[12]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 羥自由基清除能力 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的維生素C溶液對(duì)羥自由基的清除率為50.51%,證明試驗(yàn)方法可行。由圖4可知,羥自由基清除能力由高到低排序?yàn)楹跅?小米>黑豆>黑木耳>燕麥>黑米>黑芝麻>黑玉米。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),黑棗對(duì)羥自由基的清除率為47.37%,而DPPH自由基清除率不佳的小米,其活性與黑棗的相當(dāng),達(dá)46.46%,二者之間無顯著性差異,可能是因?yàn)樾∶赘缓苄陨攀忱w維,其清除羥自由基的能力強(qiáng)于DPPH[13]?？傸S酮、總多酚含量較少的黑木耳,其羥自由基清除能力卻較好,可能與曹慧馨等[14]發(fā)現(xiàn)的具有較高羥自由基清除活性的黑木耳多糖有關(guān)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 鐵離子還原能力 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的維生素C溶液對(duì)鐵離子的還原能力為0.701 4,證明試驗(yàn)方法可行。由圖5可知,鐵離子還原能力由高到低排序?yàn)楹跅?黑米>小米>黑豆>黑芝麻>黑玉米>燕麥>黑木耳,與總黃酮含量排序基本保持一致,與何國(guó)云等[15]的研究結(jié)果一致。同時(shí),作為非黑色食品的小米表現(xiàn)出優(yōu)于其他食品的還原能力。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 抗炎能力比較

2.4.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 由圖6可知,當(dāng)食品水提液質(zhì)量濃度為5 mg/mL、姜黃素為25 μmol/L時(shí),其對(duì)細(xì)胞活力無顯著抑制作用。根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果,8種食品水提液可使用5 mg/mL這一質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。

圖6 8種食品水提液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

2.4.2 對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞液中NO含量的影響 以姜黃素作為陽(yáng)性對(duì)照,當(dāng)其質(zhì)量濃度為25 μmol/L時(shí),NO抑制率達(dá)60.12%,證明試驗(yàn)造模成功且方法可行。由圖7可知,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),黑棗與黑米的NO抑制率最強(qiáng),達(dá)64.92%,60.15%,且黑棗的NO抑制率顯著大于黑米的(P<0.05)。其次為黑豆,其NO抑制率為44.95%。同時(shí),黑芝麻、燕麥、黑木耳和小米也表現(xiàn)出一定的NO抑制活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4.3 對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞液中IL-6含量的影響 當(dāng)姜黃素濃度為25 μmol/L時(shí),其IL-6抑制率為50.16%,證明試驗(yàn)造模成功且方法可行。由圖8可知,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),黑棗的IL-6抑制率高達(dá)78.62%,顯著高于其他組(P<0.05)。其次為黑米與黑豆,分別為64.87%,56.98%,其活性趨勢(shì)與NO抑制率基本一致。IL-6抑制率活性由高到低排序?yàn)楹跅?黑米>黑豆>小米>黑芝麻>黑玉米>黑木耳>燕麥,與總黃酮、總多酚含量排序基本一致,其中小米因其富含特有的醇溶蛋白肽而呈現(xiàn)出良好的抗炎活性[16]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 總黃酮、總多酚含量與抗氧化、抗炎活性之間的相關(guān)性

利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)8種不同食品的總黃酮、總多酚含量及其DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、鐵離子還原能力、NO抑制率和IL-6抑制率之間進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析,所得Pearson相關(guān)系數(shù)及雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 8種食品水提液的總多酚、總黃酮含量與抗氧化、抗炎活性之間的相關(guān)性?

由表1可知,8種食品水提液的總黃酮含量與總多酚含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05);總黃酮和總多酚含量與DPPH自由基清除能力、羥自由清除能力和鐵離子還原能力呈正相關(guān),其中與還原能力之間的相關(guān)性最高(P<0.01)。同時(shí),總黃酮、總多酚含量與NO、IL-6抑制率之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明多酚和黃酮是其發(fā)揮抗氧化和抗炎活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí),8種食品的抗氧化活性與抗炎活性也呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

通過對(duì)比研究了黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑棗、黑玉米、燕麥、小米8種食品水提液的總黃酮、總多酚含量與抗氧化、抗炎活性的相關(guān)性。結(jié)果表明,8種食品水提液均含有總黃酮和總多酚,且含量差異較大,其抗氧化能力與抗炎能力亦存在一定的差異,且總黃酮、總多酚含量與抗氧化、抗炎活性之間存在一定的相關(guān)性?？傮w上,黑棗的總黃酮和總多酚含量最高,黑棗的自由基清除力最強(qiáng),其DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和鐵離子還原能力分別為89.48%,47.37%和0.331 6。同時(shí),黑棗對(duì)NO和IL-6亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。

綜上,黑棗含有豐富的黃酮類和多酚類物質(zhì),并具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎活性,相比其他食品具有顯著性優(yōu)勢(shì)。對(duì)于開發(fā)程度尚不高的黑棗,需進(jìn)一步深入研究其活性成分及功效。