柳緒超# 易偉宏# 陳澤才 徐震 肖國(guó)芝 秦雷*

椎間盤退行性疾?。╥ntervertebral disc degenerative diseases,IDDDs）是造成下腰痛的主要原因，而關(guān)于IDDDs的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚[1]。通過建立椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并對(duì)該模型進(jìn)行藥物干預(yù)或者分子機(jī)理的研究，對(duì)于IDDDs的發(fā)生機(jī)制和臨床前研究具有不可替代的作用。椎間盤退變動(dòng)物模型分為體外和體內(nèi)模型。其中，體外模型指椎間盤脫離器官原位，使用手術(shù)方法在體外進(jìn)行細(xì)胞或者組織培養(yǎng)；體內(nèi)模型特指利用各種不同的方式、方法，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下形成椎間盤病變的模型，并以此模型來研究各類防治IDDDs的方法。本文主要講述體內(nèi)模型，從造模的方法來看，體內(nèi)模型分可分為自發(fā)性退變、力學(xué)改變、化學(xué)損傷、物理?yè)p傷、營(yíng)養(yǎng)阻斷、基因敲除和其他疾病相關(guān)的幾類動(dòng)物模型（見圖1）。

圖1 常用的椎間盤退變動(dòng)物模型匯總

1 自發(fā)性椎間盤退變模型

人類和動(dòng)物的椎間盤在正常的衰老過程中都會(huì)發(fā)生自然退變[2]。Bouhsina等[3]通過對(duì)比年輕及成熟組的綿羊椎間盤，Cho 等[4]通過定量分析不同年齡的豬，以及Bailey 等[5]對(duì)比了6 只恒河猴胸腰椎和人類腰椎椎間盤，通過這些研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，總會(huì)表現(xiàn)出椎間盤退變的現(xiàn)象。值得注意的是，Cho等[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)豬的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白均下降，這與人類是不一致的，考慮原因是豬屬于四腳行走動(dòng)物，脊柱的受力情況跟人不一致，可能在豬的個(gè)體衰老過程中，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白均下降。

這些結(jié)果顯示，衰老的動(dòng)物也可以自發(fā)形成椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）。特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物年齡相關(guān)的退變，能較好地模擬人體椎間盤退變的緩慢過程，只是衰老模型的造模時(shí)間太長(zhǎng)，不利于大部分實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

2 誘發(fā)性椎間盤退變模型

由于椎間盤的退變是在多種因素作用下椎間盤組織發(fā)生生物力學(xué)和組織結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致纖維環(huán)破裂，髓核組織突出，壓迫脊髓和神經(jīng)根，進(jìn)而引起患者腰腿痛的疾病。誘發(fā)性的椎間盤退變模型是利用力學(xué)改變、化學(xué)損傷、物理?yè)p傷和營(yíng)養(yǎng)阻斷等引起椎間盤組織和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以此推進(jìn)和模擬椎間盤的退變方法。

2.1 力學(xué)改變

2.1.1 軸向加壓

軸向加壓指增加椎間盤承載的軸向壓力，可以通過有創(chuàng)操作或無創(chuàng)操作實(shí)現(xiàn)。郭小惠等[6]將克氏針垂直橫穿山羊L4/5椎體，安裝加壓裝置，施加40 N 的力量；而白雪東等[7]將新西蘭兔置入特制的筒內(nèi)使其保持直立后，再將其頸部佩戴項(xiàng)圈以增加脊柱的軸向壓力，通過無創(chuàng)操作實(shí)現(xiàn)對(duì)椎間盤的軸向加壓。在這些模型條件下，退變的動(dòng)物椎間盤表現(xiàn)出髓核縮小、細(xì)胞減少，被纖維樣組織代替，Ⅰ型膠原蛋白增多，Ⅱ型膠原蛋白減少，DHI降低，Pfirrmann分級(jí)變高等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些退變情況與人類IDD特點(diǎn)一致。

這種模型的建立基于使椎間盤受到極高的異常應(yīng)力，適用于模擬一些重體力勞動(dòng)者的椎間盤退變，但對(duì)于腰椎長(zhǎng)期處于正常重力的大部分人群，卻難以模擬出椎間盤受力的微環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中壓力的強(qiáng)度、頻率、持續(xù)時(shí)間的不同都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響，還需實(shí)驗(yàn)者進(jìn)一步改進(jìn)。

2.1.2 脊柱失穩(wěn)

脊柱失穩(wěn)模型是通過手術(shù)方式去除動(dòng)物椎體所附著的腰椎穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如肌肉、韌帶復(fù)合體、椎間小關(guān)節(jié)等，造成腰椎失去正常力學(xué)平衡的模型。

利用手術(shù)造成脊柱失穩(wěn)的動(dòng)物模型十分常見，被應(yīng)用于多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中。Oichi 等[8]去除小鼠L4雙側(cè)下關(guān)節(jié)突，橫切棘上韌帶和棘間韌帶；付方達(dá)等[9]手術(shù)去除小鼠棘上和棘間韌帶；于棟等[10]取新西蘭兔雙側(cè)胸鎖乳突肌用醫(yī)用硅膠硬管墊起致其短縮，造成頸椎動(dòng)力失衡；董軍等[11]給犬做寰樞椎融合術(shù)，造成C2/3椎間盤應(yīng)力改變，術(shù)后觀察到椎間盤退變的表現(xiàn)。動(dòng)物脊柱融合使得手術(shù)節(jié)段的活動(dòng)消失，造成臨近節(jié)段壓力改變，誘導(dǎo)或加速其退變，這與人體椎間融合術(shù)后鄰椎病的發(fā)生過程非常相似。

脊柱失穩(wěn)造模方法適合于模擬發(fā)育性、外傷及醫(yī)源性腰椎不穩(wěn)定的人群。但此類造模方法需要在外科手術(shù)的基礎(chǔ)上完成，實(shí)驗(yàn)的手術(shù)并發(fā)癥、操作的煩瑣程度，以及術(shù)后的瘢痕組織對(duì)其脊柱活動(dòng)度的影響，都是實(shí)驗(yàn)者在造模前需要考慮的問題。

2.1.3 直立誘導(dǎo)

人類是直立動(dòng)物，椎間盤所承壓力方向與動(dòng)物不同，直立誘導(dǎo)改變動(dòng)物的椎間應(yīng)力，使其更接近人類脊柱的自然形態(tài)[12]。毛強(qiáng)等[13]利用小鼠的恐水特性，將其置于含水燒杯中保持后足站立，增加軸向力學(xué)負(fù)荷，術(shù)后椎間盤發(fā)生退變表現(xiàn)，這些檢測(cè)指標(biāo)和人類IDD 的變化是一致的。被動(dòng)直立法是最貼近人類椎間盤退變的一種造模方式，雖然造模時(shí)間較長(zhǎng)，但其屬于非創(chuàng)傷侵襲性的椎間盤退變模型，具有創(chuàng)傷小、動(dòng)物存活率高的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 物理?yè)p傷

物理?yè)p傷是通過穿刺法損傷纖維環(huán)來構(gòu)建動(dòng)物模型，是目前應(yīng)用最廣的椎間盤退變模型。白榮飛等[14]將SD大鼠分別用針刺纖維環(huán)、終板注射無水乙醇，以及聯(lián)合兩種方式的方法進(jìn)行椎間盤退變?cè)炷?，發(fā)現(xiàn)這3 種方法均能誘導(dǎo)椎間盤退變，聯(lián)合穿刺和終板注射可明顯加快并加重椎間盤退變，有效縮短實(shí)驗(yàn)周期。Wawrose 等[15]在C 臂機(jī)透視下完成大鼠經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺，排除了傳統(tǒng)開放手術(shù)創(chuàng)傷引起大鼠的退行性反應(yīng)和疼痛行為，實(shí)現(xiàn)了微創(chuàng)化造模。但是經(jīng)皮穿刺所致的腹腔內(nèi)血管、神經(jīng)損傷等并發(fā)癥需要進(jìn)一步思考如何規(guī)避。當(dāng)經(jīng)皮穿刺這一微創(chuàng)方法應(yīng)用于大鼠尾椎椎間盤時(shí)，因?yàn)槲沧甸g盤周圍結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，經(jīng)皮穿刺體現(xiàn)出了操作更精準(zhǔn)方便的優(yōu)勢(shì)[16]。

總體說來，物理?yè)p傷方法相對(duì)簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，該過程在組織影像和免疫學(xué)方面表現(xiàn)出DHI降低，病理學(xué)評(píng)分升高，膠原變化，以及動(dòng)物疼痛行為的顯著變化，與人的椎間盤退變過程類似，然而這種急性創(chuàng)傷造成的退變與人類的退變機(jī)制差異較大，適用于探究椎間盤急性損傷的病理生理過程。但需注意的是，穿刺過程可能引起的免疫反應(yīng)等，會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來一定的干擾。

2.3 化學(xué)損傷

化學(xué)損傷是通過向椎間盤內(nèi)注射酶類（軟骨素酶ABC、木瓜凝乳蛋白酶、腫瘤壞死因子α 等）或非酶類藥物（博來霉素等），通過注射物對(duì)椎間盤內(nèi)細(xì)胞或基質(zhì)產(chǎn)生破壞，改變其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分，最終誘發(fā)椎間盤退變。

張長(zhǎng)春等[17]給家兔椎間盤髓核注射TNF-α，Kim 等[18]給大鼠注射不同濃度IL-1β，Suh等[19]給大鼠腰椎間盤髓核內(nèi)注射碘乙酸單鈉，術(shù)后均發(fā)現(xiàn)椎間盤退行性改變的表現(xiàn)；同時(shí)，Kim等[18]的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了椎間盤退變的評(píng)估指標(biāo)呈現(xiàn)出顯著的劑量相關(guān)和依賴性。這些結(jié)果提示，化學(xué)損傷模型可以通過不同的試劑濃度來控制椎間盤退變的嚴(yán)重程度，是一種遵循與臨床中椎間盤突出相似的動(dòng)物模型制作新方法。

化學(xué)損傷模型具有創(chuàng)傷較小、可重復(fù)性強(qiáng)和藥物劑量易于掌握等優(yōu)點(diǎn)，并且實(shí)現(xiàn)了調(diào)節(jié)藥物濃度來控制退變程度這個(gè)關(guān)鍵步驟。同時(shí)，化學(xué)損傷模型造模后，動(dòng)物的椎間盤在MRI、micro-CT、組織免疫學(xué)等各個(gè)方面都可以較好地模擬人的椎間盤退變的細(xì)胞和組織變化過程，這種模型比現(xiàn)有的穿刺法更能代表人類的組織學(xué)和行為特征。值得注意的是，化學(xué)試劑在椎間盤中分散濃度的掌控、對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的干擾以及引起的免疫炎癥反應(yīng)對(duì)椎間盤退變的影響需要考慮在內(nèi)。

2.4 營(yíng)養(yǎng)阻斷

腰椎間盤是全身最大的無血管組織，其營(yíng)養(yǎng)主要依靠軟骨終板通路[20]，營(yíng)養(yǎng)通路的阻斷使椎間盤營(yíng)養(yǎng)來源與代謝的過程均發(fā)生紊亂，給椎間盤退變模型的建立提供了一種新的思路。尹思等[21]在椎體終板骨質(zhì)處造成骨缺損后使用骨水泥進(jìn)行填塞，石芳芳等[22]利用腹膜后入路結(jié)扎節(jié)段動(dòng)脈，袁維等[23]將新西蘭兔椎間盤上下椎體注射無水乙醇，實(shí)現(xiàn)對(duì)椎間盤的營(yíng)養(yǎng)和代謝通路阻斷，觀察椎間盤高度丟失、信號(hào)減弱、髓核和纖維環(huán)凋亡的退化表現(xiàn)，與人類IDD觀察指標(biāo)一致。

上述方法使椎間盤營(yíng)養(yǎng)及代謝通路發(fā)生異常，適合模擬IDD的自然慢性病理過程，但是操作中要盡量減少操作中對(duì)軟組織剝離，減小創(chuàng)傷，盡量保證造模后脊柱力學(xué)平衡狀態(tài)，保證單一因素對(duì)于椎間盤變性的影響。

2.5 基因敲除技術(shù)

隨著基因技術(shù)水平的不斷提高，基因敲除技術(shù)為研究椎間盤退行性變提供了一種新思路。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過敲除某些特定的基因來構(gòu)建椎間盤退變模型。如Lin 等[24]將小鼠肌腱調(diào)節(jié)蛋白Tnmd基因敲除后，小鼠表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的進(jìn)展更快的IDD。此外，Tnmd和軟骨調(diào)節(jié)素Ⅰ（Chm1，唯一與Tnmd同源的基因）雙敲除（Tnmd -/-；Chm1-/-）小鼠不僅表現(xiàn)出加速的IVD 退化，而且表現(xiàn)出IVD的異位骨形成。同時(shí)，Chen等[25]在軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除粘著斑蛋白Kindlin-2這一基因后發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2的缺失會(huì)導(dǎo)致腰椎自發(fā)性和進(jìn)行性椎間盤退變，大大加速存在異常機(jī)械應(yīng)力的情況下尾椎間盤退變的進(jìn)展。這一表現(xiàn)的機(jī)制考慮是Kindlin-2 的缺失激活了Nlrp3 炎性小體和刺激髓核細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，引發(fā)惡性循環(huán)，最終ECM分解代謝和髓核細(xì)胞凋亡。

基因敲除技術(shù)為構(gòu)建椎間盤退變模型提供了新的選擇，但此技術(shù)對(duì)椎間盤退變特異性的基因、轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)和繁殖要求較高。但是隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步進(jìn)展，相信基因敲除技術(shù)在將來的椎間盤退行性疾病研究中將發(fā)揮更大的作用。

2.6 其他方式

除了以上方式，一些常見疾病及不良習(xí)慣也被證實(shí)與椎間盤退變的發(fā)生有明確關(guān)系，如糖尿病及高糖飲食、尼古丁注射引起椎間盤退變等。Illien-Jünger等[26]通過給小鼠投喂同等熱量的高/低糖基化終末產(chǎn)物的前體飼料，Lo等[27]將尼古丁注射入小鼠皮下，觀察到椎間盤退化的表現(xiàn)。這些方式提示和模擬不同單一外界因素對(duì)椎間盤退變產(chǎn)生的影響，對(duì)可能引起椎間盤退變的環(huán)境因素進(jìn)行了更多的研究。

3 總結(jié)與展望

關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，從人類的生活習(xí)性和脊柱形態(tài)的角度來講，大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物的脊柱生理構(gòu)造和生物力學(xué)環(huán)境與人類有很高的相似度，自發(fā)性退變、直立行走等因素與人類高度相似，但是價(jià)格、飼養(yǎng)條件、倫理的要求等方面限制使得大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物難以成為常規(guī)椎間盤退變的模型。而目前鼠類和兔類得益于飼養(yǎng)成本低、來源廣泛而充足，仍是椎間盤退變模型的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[28]。

上述動(dòng)物模型從不同的角度造成椎間盤的退行性變，不同方式的操作性、重復(fù)性及經(jīng)濟(jì)性各有優(yōu)缺點(diǎn)（見表1）。每一種椎間盤退變模型都有其優(yōu)勢(shì)和局限性，針對(duì)不同的研究需求選擇合適的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)開始前需要認(rèn)真考慮的問題。目前應(yīng)用最多的動(dòng)物模型仍然是穿刺或者穿刺后進(jìn)行髓核抽吸模型，因?yàn)獒槾汤w維環(huán)操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，適合模擬人類纖維環(huán)損傷、椎間盤退變的過程，尤其適用于探究椎間盤急性損傷的病理生理過程。

表1 常用的椎間盤退變的動(dòng)物模型

但是，人類椎間盤退變的復(fù)雜程度和客觀規(guī)律，目前仍沒有一種得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍承認(rèn)且全面模擬人類椎間盤退變的動(dòng)物模型。同時(shí)，除人類的椎間盤自發(fā)退變的因素外，還必須考慮到不同的人群所受影響的其他因素是不一樣的，如重體力勞動(dòng)人群之軸向壓力增加，發(fā)育性、外傷性及醫(yī)源性椎間盤退變?nèi)巳褐挡环€(wěn)。如何建立一種理想的椎間盤退變動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿允且粋€(gè)需要不斷研究和探索的問題，這種理想的模型需兼具以下特征：①造模方法力求簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，具有良好的可重復(fù)性，遵循道德準(zhǔn)則的同時(shí)盡量減少對(duì)動(dòng)物的傷害；②盡可能降低其他外部環(huán)境的影響，重現(xiàn)腰椎退行性病變的客觀規(guī)律；③由于椎間盤跟脊柱神經(jīng)息息相關(guān)，造模時(shí)對(duì)神經(jīng)的保護(hù)值得得到更高的重視。