唐 潔,宋 丹

(重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院急診科,重慶 400084)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在全球的發(fā)病率和致死率均較高。盡管醫(yī)學(xué)的進(jìn)步促進(jìn)了胃癌的診斷和治療,但大多數(shù)晚期胃癌患者的5年總生存率仍不到30%[1]。目前,臨床上胃癌的治療方式主要為外科手術(shù)(早期或中期)和化、放療(晚期)。早期手術(shù)效果較好,生存率可超過90%,而晚期常常面臨患者對放化療不敏感或者耐受性較差的問題,且患者容易復(fù)發(fā),因此迫切需要尋找新的治療方式[2]。環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)是一類以共價(jià)鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長鏈非編碼RNA,沒有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′ poly A尾巴,具有穩(wěn)定性、豐富性和保守性等特點(diǎn)[3-4]。研究表明,circRNA在消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-7]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路是眾多經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,通過蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等信號(hào)將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等[8]。MAPK14是MAPK家族的關(guān)鍵成員,在信號(hào)級(jí)聯(lián)中發(fā)揮核心功能[9]。然而,源自MAPK14的circRNA(circMAPK14)在胃癌中是否具有功能,目前缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究分析胃癌患者癌灶組織及癌旁組織中circMAPK14(hsa_circ_24603)的表達(dá)情況,研究其功能和相關(guān)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床組織標(biāo)本

收集2021年2月至2022年8月本院收治的29例胃癌患者癌灶組織和癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣2 cm)作為研究對象。患者和家屬均簽署了知情同意書。

1.1.2細(xì)胞株及試劑

正常永生化胃上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞系SGC7901購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMIl640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購于美國HyClone公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購于日本Dojindo Laboraories公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑購于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;SYBR Green/ROX Master Mix試劑盒購于加拿大Fermentas公司;膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒、叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,TBH)購于德國Sigma公司;抗體p-MAPK14、β-actin、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1臨床組織標(biāo)本處理

將收集的組織標(biāo)本在液氮中速凍,用研缽研磨后加入TRIzol試劑提取RNA,再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

SGC7901用RPMIl-1640培養(yǎng)基、GES-1用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),胎牛血清濃度為10%。培養(yǎng)箱設(shè)定參數(shù)為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.3小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾與TBH處理

circMAPK14 siRNA干擾序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成,分裝、儲(chǔ)存方法按照說明書進(jìn)行。將對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后接種于6孔板(每孔約5×105個(gè)細(xì)胞),待細(xì)胞密度約為60%時(shí),更換成無血清培養(yǎng)基。24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度50 nmol/L的circMAPK14 siRNA,對照組加入同劑量的陰性對照(scramble siRNA),轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.4流式細(xì)胞分析

實(shí)驗(yàn)組與對照組均加入TBH(分別納入實(shí)驗(yàn)+TBH組,對照+TBH組),濃度為50 μmol/L。24 h后收集細(xì)胞及上清液,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,室溫1 000 r/min離心5 min,按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行處理,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

根據(jù)不同標(biāo)本的cDNA,檢測circMAPK14、MAPK14、Noxa、Bax、Puma的表達(dá)水平。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用SYBR Green/ROX Master Mix試劑盒通過熒光定量PCR儀(美國BioRad公司)進(jìn)行操作,引物序列見表1。提取SGC7901、GES-1細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后定量檢測circMAPK14的表達(dá)情況。

表1 PCR引物序列

1.2.6CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將SGC7901細(xì)胞接種于96孔板中,每孔1×103個(gè)細(xì)胞,12 h后更換成無血清培養(yǎng)基進(jìn)行siRNA干擾。轉(zhuǎn)染24、48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度[A(450)]值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值并繪制生長曲線圖。

1.2.7劃痕試驗(yàn)

將SGC7901細(xì)胞接種于6孔板中(1×106/孔),轉(zhuǎn)染24 h后用無菌200 μL移液器槍頭沿孔的中間刮擦細(xì)胞板,顯微鏡拍照。隨后更換成無血清培養(yǎng)基,孵育48 h后再用顯微鏡拍照。

1.2.8Western blot檢測MAPK14磷酸化水平

干擾circMAPK14 48 h后,棄掉細(xì)胞上清液,預(yù)冷的PBS洗滌2次,加入蛋白裂解液冰上裂解30 min,刮下細(xì)胞后置于1.5 mL EP管中,12 000 r/min、4 ℃離心15 min。轉(zhuǎn)移裂解上清液并檢測蛋白水平。在裂解液中加入5×上樣緩沖液,煮沸5 min。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%)后將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,麗春紅染色、漂洗后用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗孵育,4 ℃過夜。吸掉一抗后加入TBST洗膜3次,再用二抗室溫孵育2 h,吸棄二抗洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),使用ImageJ進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 circMAPK14在癌灶組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

納入研究的29例胃癌患者癌灶組織中circMAPK14的mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.01);SGC7901細(xì)胞中circMAPK14的mRNA表達(dá)水平低于GES-1細(xì)胞(P<0.01),見圖1。

A:circMAPK14在癌灶組織中和癌旁組織中的表達(dá)水平;B:circMAPK14在SGC7901和GES-1細(xì)胞中的表達(dá)水平;a:P<0.01。

2.2 對照組與實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞circMAPK14 mRNA表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組circMAPK14的mRNA表達(dá)水平低于對照組(P<0.01),見圖2。

a:P<0.01。

2.3 circMAPK14對細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組吸光度明顯高于對照組(P<0.01),細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),見圖3。

a:P<0.01,與對照組比較。

2.4 circMAPK14對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)+TBH組細(xì)胞凋亡率低于對照+TBH組(P<0.01),下調(diào)SGC7901細(xì)胞circMAPK14表達(dá)會(huì)降低由TBH誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡,見圖4。

A:流式細(xì)胞圖;B:統(tǒng)計(jì)分析圖;①:對照組;②:實(shí)驗(yàn)組;③:對照+TBH組;④:實(shí)驗(yàn)+TBH組;a:P<0.01。

2.5 circMAPK14對胃癌細(xì)胞的遷移影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷徙能力明顯上升,見圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測circMAPK14對SGC7901細(xì)胞遷移的影響(200×)

2.6 circMAPK14對MAPK14和凋亡相關(guān)基因的影響

實(shí)驗(yàn)組MAPK14磷酸化水平增強(qiáng),Bax、Puma、Noxa的mRNA表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

A、B:p-MAPK14的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果;C:凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較;a:P<0.01。

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,靶向治療方法正越來越受到重視。最初,研究人員認(rèn)為circRNA是機(jī)體錯(cuò)誤拼接的產(chǎn)物,不具有任何生物學(xué)作用,但隨著人們對基因研究的深入,發(fā)現(xiàn)circRNA具有強(qiáng)大的功能,與細(xì)胞分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖息息相關(guān),在胃癌的治療方面發(fā)揮重要作用。例如circRNA GAP1能競爭結(jié)合miR-877-3p的靶位點(diǎn),抑制其表達(dá),從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移和生長[10]。核受體相互作用蛋白1環(huán)狀RNA(circNRIP1)充當(dāng)miR-149-5p的海綿,活化下游的AKT1/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路,促進(jìn)胃癌細(xì)胞進(jìn)展和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。YANG等[12]的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明人抗原R環(huán)狀RNA(circHuR)能抑制胃癌細(xì)胞的生長。線粒體核糖體蛋白S35環(huán)狀RNA(circMRPS35)可作為分子支架,將組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT7募集到叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型1(FOXO1)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3a(FOXO3a)基因的啟動(dòng)子上,從而誘導(dǎo)H4K5的乙?；?觸發(fā)FOXO信號(hào)通路,抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和增殖[13]。氧固醇結(jié)合蛋白樣10抗體環(huán)狀RNA(circOSBPL10)可作為胃癌患者總生存期和無病生存期的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)[14]。此外,還有研究指出,circRNA參與了胃癌化療耐藥的調(diào)控[15-16]。因此,circRNA具有潛在治療靶點(diǎn)、生物學(xué)標(biāo)志物等優(yōu)勢。

MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控了細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡等一系列生理活動(dòng)[8,17]。MAPK共有4個(gè)亞族:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、ERK5、p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)[17]。p38的活化不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,還能通過調(diào)控血管的形成來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在人體的發(fā)展[18-20]。此外,某些藥物也能通過抑制p38通路來發(fā)揮效果,例如異丙酚通過抑制表皮生長因子受體和p38的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖與侵襲,二氫楊梅素通過抑制ERK和p38的表達(dá)而具有明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖的效能[21-22]。MAPK14即p38α,屬于p38成員之一,可通過激活多種轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[9]。自發(fā)現(xiàn)MAPK14以來,臨床試驗(yàn)闡明了其在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲和化療反應(yīng)中的作用[23-24]。因此,在胃癌中尋找與MAPK14緊密相關(guān)的circRNA至關(guān)重要。

本研究中的circRNA來源于MAPK14,是在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)明顯的基因,提示此circRNA可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),circMAPK14能抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這為胃癌的研究提供了新思路和可能的治療靶點(diǎn)。機(jī)制研究方面,本研究結(jié)果提示circMAPK14可作為MAPK信號(hào)通路的調(diào)控因子,調(diào)控MAPK14磷酸化水平,并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng),影響B(tài)ax、Noxa、Puma等抑癌基因的表達(dá),從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡等進(jìn)程。

然而,circRNA對MAPK的調(diào)控方式多種多樣,部分通過充當(dāng)miRNAs的分子海綿,進(jìn)而調(diào)控MAPK和PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路[25];部分circRNA能編碼蛋白,影響MAPK磷酸化進(jìn)而影響癌癥的進(jìn)程[26];部分扮演支架角色影響相關(guān)基因的降解,從而調(diào)控MAPK信號(hào)通路[27]。本研究已明確circMAPK14能影響MAPK14的磷酸化,但如何調(diào)控還需更深入的實(shí)驗(yàn)研究。